微 生 物 学 实 验 指 导
郑州牧业工程高等专科学校生物工程系
? 实验一 显微镜的构造和使用
? 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
? 实验三 霉菌的制片与观察
? 实验四 放线菌和酵母菌形态观察
? 实验五 微生物的显微直接计数法
? 实验六 微生物细胞大小测定
? 实验七 培养基的制备
? 实验八 微生物的分离、纯化和接种
实 验 项 目
? 实验九 细菌的培养特性观察及显微镜检查
? 实验十 稀释平板测数法
? 实验十一 物理因素对微生物的影响
? 实验十二 药敏试验
? 实验十三 细菌的生化试验
? 实验十四 酸乳的制作
? 实验十五 水中细菌总数和大肠菌群的检测
? 实验十六 病毒的鸡胚培养
? 实验十七 病毒的血凝试验
实验一 显微镜的构造和使用
? （一）实验目的
? （二）实验内容和原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）注意事项
? （六）实验作业
Antony van Leeuwenhock
自制单式显微镜观察到细菌等微生物个体
（一）实验目的
? 1.掌握普通光学显微镜的基本构造、使
用方法、保护要点。
? 2.掌握普通光学显微镜油浸系的原理。
? 3.使用油镜观察几种细菌的基本形态。
（二）实验内容和原理
? 1.显微镜的构造
? 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一
为 机械装臵,一为 光学系统,这两部分很好
的配合，才能发挥显微镜的作用。
? （ 1）显微镜的机械装臵
? 显微镜的机械装臵包括 镜座、镜筒、物镜转
换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺
旋 等部件。
（ 2）显微镜的光学系统
? 显微镜的光学系统由 反光镜，聚光器，
接物镜，接目镜 等组成，光学系统使物
体放大，形成物体放大像 。
? 根据物镜放大率的高低，可分为,
? ①低倍物镜 指 10×；
? ②高倍物镜指 40×；
? ③ 油浸物镜 100×。
? 普通光学显微镜常用的目镜为 10倍平场
目镜（ P）。
光学显微镜的构造
1,物镜转换器 2,接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6,彩虹光
阑 7.光源 8,镜座 9,电源开关 10,光源滑动变阻器 11,粗
调螺旋 12,微调螺旋 13,镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋
? 显微镜的几个常用系数,
? a.放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍
数
? b,分辨率, 是表示显微镜辨析物体（两端）
两点之间距离的能力。
? c,数值孔径,也叫做镜口率（或开口率），
它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，
与镜象亮度的平方根成正比。
2.油镜使用的原理
? 油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过
玻片与镜头之间的空
气时，由于空气与玻
片的密度不同，使光
线受到曲折，发生散
射，降低了视野的照
明度。
? 加入中间的介质是一
层香柏油（其折射率
与玻片的相近），则
几乎不发生折射，增
加了视野的进光量，
从而使物象更加清晰。
（三）实验器材
? 1.显微镜、香柏油、乙醇 -乙醚混合液、擦
镜纸、吸水纸等。
? 2.细菌三种形态的染色标本。
（四）实验方法
? 一,观察前的准备
? 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，
要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳
地将显微镜搬运到实验桌上。
? 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离
桌子边缘约 10cm左右，右侧可放记录本或
绘图纸。
? 3、调节光照,不带光源的显微镜，可利用灯光
或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直
射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼
睛。
? 将 10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈
打开到最大位臵，用左眼观察目镜中视野的亮
度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最
均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电
流旋钮来调节光照强弱。
? 二,低倍镜观察
? 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习
惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定
检查的位臵。
? 将标本片放臵在载物台上，用标本夹夹住，移动
推动器，使被观察的标本处在物镜正下方,转动
粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观
察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物
像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止 。用推
动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到
视野中央进行观察。
? 三,高倍镜观察
? 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较
好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的,在
转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片
相撞 。然后从目镜观察，调节光照，使亮度
适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物
台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像
清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野
中央进行观察。
? 四,油镜观察
? 使用油镜按下列步骤操作,
? 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将
载物台下降）约 2cm,并将高倍镜转出。
? 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香
柏油。
? 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台
缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，
使镜头几乎与标本接触。
? 4、从接目镜内观察，用粗调节旋钮将载
物台徐徐下降，当出现物像一闪后改用细
调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开
油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，
重复上述操作。
? 五,观察完后复原
? 下降载物台,将油镜头转出，先用擦镜纸擦去
镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合
液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭
2— 3下即可，（注意向一个方向擦拭） 。
? 将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不
与载物台通光孔相对，而是成八字形位臵，再
将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与
聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机
械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
? 1.学生使用显微镜固定镜号、位臵，填写使
用卡，本学期一直使用本台显微镜。
? 2.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
? 3.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，
以保证光洁度。
（五）注意事项
? 4.观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后
用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，
切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜
面。
? 5.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察
的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察
时，右眼注视绘图。
? 6.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
座，不可单手拿，更不可倾斜拿 。
（六）实验作业
? 1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不
同？应特别注意些什么？
? 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？
? 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，
而不是直接用高倍镜或油镜观察？
? 4.绘出细菌的几种基本形态。
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
? （六）注意事项
（一）实验目的,
学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
? 1.简单染色法, 是用一种染料使细菌着色以
显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，
通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱
性复红 等）使其着色。
? 2.革兰氏染色法, 是 1884年由丹麦病理学家
C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有
的细菌区分为革兰氏阳性菌 （ G+） 和革兰
氏阴性菌 （ G— ） 两大类，是细菌学上最常
用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌
分为 G+菌和 G— 菌，是由这两类菌的细胞壁
结构和成分的不同所决定的。
（二）实验原理,
? G— 菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的
类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，
故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细
胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复
合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经
复红复染后就成红色。
? G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类
脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚
糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌
仍保留初染时的颜色。
1 2 3 4？ 结晶紫 碘液
酒精
复红
革兰氏阴性杆菌 革兰氏阳性杆菌
G+球菌与 G-杆菌
? 1,活材料,培养 24小时的大肠杆菌
和葡萄球菌。
? 2,染色液和试剂,结晶紫、碘液、
95%酒精、石炭酸复红,蒸馏水、
乙醚 -乙醇混合液、香柏油。
? 3,器材,废液缸、洗瓶、载玻片、
接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
（三）实验器材
? 1、简单染色,
? （ 1） 涂片,取干净载玻片一块，在载玻片中
央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌
涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。
? （ 2） 晾干,让涂片自然晾干或者在酒精灯火
焰上方文火烘干。
? （ 3） 固定,手执玻片一端，让菌膜朝上，通
过火焰 2-3次固定（以不烫手为宜）。
(四）实验方法,
? （ 4） 染色,将固定过的涂片放在废液缸上
的搁架上，加复红染色 1-2min。
? （ 5） 水洗,用水洗去涂片上的染色液。
? （ 6） 干燥,将洗过的涂片放在空气中晾干
或用吸水纸吸干。
? （ 7） 镜检,先低倍观察，再高倍观察，并
找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂
片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中
仔细调焦观察细菌的形态。
? 2、革兰氏染色,
? （ 1） 涂片 （ 2） 晾干 （ 3） 固定,与简单染
色法相同
? （ 4） 结晶紫染色,将玻片臵于废液缸玻片
搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结
晶紫染色液染色 1分钟；水洗：倾去染色液，
用水小心地冲洗。
? （ 5） 媒染,碘液，媒染 1min； 水洗：用水
洗去碘液。
? （ 6） 脱色,将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇
脱色 20— 25s至流出液无色，立即水洗。
? （ 7） 复染,滴加复红复染 3-5min； 水洗：
用水洗去涂片上的复红染色液。
? （ 8） 晾干,将染好的涂片用吸水纸吸干。
? （ 9） 镜检,镜检时先用低倍，再用高倍，
最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色
反应性。
? ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,
? a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
? b.用擦镜纸沾少许 乙醚 -乙醇混合液 将镜头擦
2-3次。
? c.再用干净的擦镜纸将镜头擦 2-3次。注意擦
镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，
按号放入显微镜柜中。
? ②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，
放入回收容器内。
（ 10)实验完毕后的处理,
? 1.革兰氏染色成败的关键是 酒精脱色 。
如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色
而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰
氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱
色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量
多少等因素的影响，难以严格规定。
？ （五）注意事项
? 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲
洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色
液被稀释而影响染色效果。
? 3.选用幼龄的细菌。 G+菌培养 12h-16h，
E.coli培养 24h。 若菌龄太老，由于菌体
死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性
反应。
? 绘出 葡萄球菌 和 大肠杆菌 的形态图，并
注明两菌的革兰氏染色的反应性。
（六）实验作业
实验三 霉菌的制片与观察
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
学习霉菌制片并观察霉菌的形态。
曲霉 根霉 青霉
（一）实验目的,
? 曲霉的分生孢子
? 根霉的孢子囊和孢子囊梗
? 孢子梗
? 孢子囊
? 孢子
囊轴
分生孢子
分
生
孢
子
梗
分生孢子梗
? 分生孢子
? 霉菌的营养体是分枝的 丝状体 。其个体比细菌和
放线菌大得多，分为 基内菌丝 和 气生菌丝 。气生
菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝
可以形成不同的孢子。
? 霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且 孢子 容易
飞散，所以制标本时要注意的是：尽量保持细胞
不变形，我们根据这一要求，利用胶带纸粘取霉
菌，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌
形态。
（二）实验原理,
? 1.活材料,在马铃薯琼脂平板上培养 3— 4
天的 曲霉 （ Aspergillus sp.）, 根霉
（ Rhizpus sp.）, 青霉 （ Penicillum
sp.）。
? 2.染色液,美蓝（或结晶紫、复红）染色
液。
? 3.器材,剪刀、镊子、载玻片、胶带纸、
显微镜，吸水纸，擦镜纸。
（三）实验器材
? 胶带纸观察法,在载玻片上滴加一滴染色液，
用胶带纸从生长有霉菌的平板中粘取少量带有
孢子的霉菌菌丝（注意应从基部粘取，避免只
粘取到孢子），压在染液上（勿使产生气泡，
且不要再移动盖玻片），先用 低倍镜,必要时
转换 高倍镜 镜检并记录观察结果。
? 注意观察菌丝 有无隔膜, 有无假根, 足细胞 等
特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状
和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小
等。
（四）实验方法
? 给出 曲霉, 根霉, 青霉 的个体形态图，并
注明各部位名称。
（五）实验作业,
实验四 放线菌和酵母菌形态观察
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.学习放线菌的印片染色法和胶带纸
粘菌染色法。
? 2.学习自制水浸片法观察酵母菌。
（二）实验原理
? 1.放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线
菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情
况，常用印片染色法和胶带纸粘菌染色法进行
制片观察。
? 2.酵母菌可以用单纯的水制成水浸片观察，也
可以用染色液制成水浸片观察。
放线菌菌落形态
放线菌形态
酵母菌菌落形态
酵母菌形态
（三）实验器材
? 1.活材料：放线菌培养物，酵母菌斜面
培养物。
? 2.染色液：复红染色液（或结晶紫，美
兰）
? 3.器材：载玻片，胶带纸，小刀，接种
环，吸水纸，擦镜纸，酒精灯，香柏油，
乙醚 -乙醇混合液，显微镜。
（四）实验方法
? 印片, 取干净载玻片一块，用小刀切取
放线菌培养体一块，放在载玻片上，用
另一块载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻
按压，然后将载玻片垂直拿起。注意不
要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱
孢子丝的自然形态；
印片 → 微热固定 → 石炭酸复红染色
1min→ 水洗 → 晾干 → 镜检
1.印片法,
? 微热固定,将印有放线菌的涂面朝上，
通过酒精灯火焰 2-3次加热固定；
? 染色,石炭酸复红染色 1min；
? 水洗, 水洗后晾干；
? 镜检, 先用低倍镜后用高倍镜，最后用
油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排
列情况。
2.胶带纸法,
? 粘菌, 用胶带纸在放线菌培养体上粘取
菌体，注意，压取时从菌落边顺着菌体
生长方向，避免从菌落上面压取，以免
取得的全是孢子 。
? 染色, 将粘有菌体的胶带纸压在事先 准
备好的滴油染液的载玻片上 。 将多余染
色液用滤纸吸掉。
? 镜检, 同上。
? 在载玻片上滴加一滴蒸馏水或一滴染色
液，用接种环钓取少许酵母菌放入上述
液滴里，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，
且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，
后用高倍镜镜检并记录观察结果。注意
观察酵母菌的 大小，芽体，死菌体和活
菌体 。
3.水浸片法观察酵母菌,
（五）实验作业
? 1.绘出放线菌孢子丝和孢子形态图。
? 2.绘出酵母菌形态图。
实验五 微生物的显微直接计数法
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
? 了解 血球计数板 的构造、计数原理和
计数方法，掌握显微镜下直接计数的技
能。
一、实验目的
? 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用
的有 显微直接计数法 和 平板计数法 。
?血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有 4
条槽构成 3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一
短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
二、实验原理
? 计数区的刻度有两种：一种是计数区分为
16个大方格（大方格用三线隔开），而每
个大方格又分成 25个小方格；另一种是一
个计数区分成 25个大方格（大方格之间用
双线分开），而每个大方格又分成 16个小
方格。
? 但是不管计数区是哪一种构造，它们都有
一个共同特点，即计数区都由 400个小方格
组成。
? 使用血球计数板计数时，先要测定每个小
方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌
液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
? 计数区边长为 1mm,则计数区的面积为 lmm2，
每个小方格的面积为 1/400mm2。 盖上盖玻
片后，计数区的高度为 0.1mm,所以每个计
数区的体积为 0.1mm3,每个小方格的体积
为 1/4000mm3。
? 所以,1mm3体积应含有小方格数为
1000mm3/1/4000mm3=4× 106个小方格，即
系数 K=4× 106 。
? 因此,每 ml菌悬液中含有细胞数 = 每个
小格中细胞平均数（ N）× 系数（ K）×
菌液稀释倍数（ d）
? 1．活材料,酿酒酵母 （ Saccharomyces
cerevisiae） 菌液。
? 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片,
吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
三、实验器材
? 1.取洁净的 血球计数板 一块，在计数区
上盖上一块 盖玻片 。
四、实验方法
? 2.将 酵母菌悬液 摇匀，用滴管吸取少许，从计
数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘
摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体
的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用
吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
? 也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使
计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片
后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片
（勿使产生气泡）。
? 3．计数时若计数区是由 16个大方格组成，
按对角线方位，数左上、左下、右上、右
下的 4个大方格（即 100小格）的菌数。如
果是 25个大方格组成的计数区，除数上述
四个大方格外，还需数中央 l个大方格的
菌数（即 80个小格）。
? 如菌体位于大方格的双线上，计数时则数
上线不数下线，数左线不数右线，以减少
误差。
? 4．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞
大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数 2-3次（每次数值不应
相差过大，否则应重新操作），求出每
一个小格中细胞平均数（ N）,按公式计
算出每 ml（ g） 菌悬液所含酵母菌细胞数
量。
? 5．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球
计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹
擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾
干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
计数
次数
每个大方格菌数
稀
释
倍
数
试管斜
面中的
总菌数
平均
值
1
2
3
4
5
第一次
第二次
将实验结果填入下表中,
五、实验作业,
实验六 微生物细胞大小测定
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
一、实验目的
? 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和
使用原理，掌握微生物细胞大小的测定
方法。
二、实验原理
微生物细胞的大小是微生物重要的形态
特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下
来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有
目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆
形玻片，在玻片中央
把 5mm长度刻成 50等分，
或把 10 mm长度刻成
100等分。测量时，将
其放在接目镜中的隔
板上 (此处正好与物镜
放大的中间像重叠 )来
测量经显微镜放大后
的细胞物象。
? 由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相
同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不
一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时
须先用臵于镜台上的镜台测微尺校正，以
求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小
格所代表的相对长度。
? 镜台测微尺（图 20-2）是中央部分刻有精确等分线
的载玻片，一般将 lmm等分为 100格，每格长 l0μm
（ 即 0.0lmm）,是专门用来校正目镜测微尺的。校
正时，将镜台测微尺放在载物台上。
? 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位臵，都要
经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台
测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此
从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小。
? 所以用镜台测微尺的已知长度在一定放
大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目
镜测微尺每格所代表的长度，然后移去
镜台测微尺，换上待测标本片，用校正
好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量
微生物大小。
三、实验器材
? 1．活材料,酿酒酵母 (Saccharomyces
cerevisiae)斜面菌种。
? 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微
尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦
镜纸。
四、实验方法
? 1．目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋
下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入
目镜的隔板上，把镜台测微尺臵于载物台
上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦
距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转
动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻
度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使
两尺的, 0” 刻度完全重合。
? 定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合
的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微
尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜
台测微尺的刻度每格长 l0μm, 所以由下
列公式可以算出目镜测微尺每格所代表
的长度。
? 例如目镜测微尺 5小格正好与镜台测微尺 5小
格重叠，已知镜台测微尺每小格为 l0μm, 则
目镜测微尺上每小格长度为 =5× 10μm/5 ＝
10μm 。
? 用同法分别校正在 高倍镜 下和 油镜 下目镜测
微尺每小格所代表的长度。
? 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，
因此校正目镜测微尺必须针对特定的显
微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒
长度）进行，而且只能在特定的情况下
重复使用，当更换不同放大倍数的目镜
或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每
一格所代表的长度。
2．细胞大小的测定
? (1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液
? (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
? (3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，
先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜
下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，
宽各占几格（不足一格的部分估计到小数
点后一位数）。
? 测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正
值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌
体的大小要在同一个标本片上测定 10-20
个菌体，求出 平均值,才能代表该菌的
大小。而且一般是用对数生长期的菌体
进行测定。
五、实验作业,
物镜（ μm） 目尺格数 台尺格数 目尺校
正
10×
40×
100×
目镜测微目尺校正结果
将实验结果填入下列表格
酵母菌大小测定记录 （格）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值
长
宽
? 结果计算 长 μm ＝ 平均格数×校正值
? 宽 μm ＝ 平均格数×校正值
? 大小表示：宽 μm × 长 μm
实验七 培养基的制备
? （一）实验目的
? （二）实验内容及原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1,了解配制培养基的原理和基本程序，
熟悉常用培养基的名称。
? 2.掌握培养基酸碱值的测定。
? 3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用
范围，并掌握其具体操作方法。
（二）实验内容及原理
? 1.培养基,用人工方法将多种营养物
质按微生物生长代谢的需要配制成的
一种营养基质。
? 2.培养基营养物质来源,水，碳源，
氮源，矿质营养，生长因素或生长因
子。
? 3.培养基的分类,
? 按照配制培养基的营养物质来源可分为,
? ⑴ 天然培养基,利用天然的有机物配制而成的
培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基。
? ⑵ 半合成培养基,既有天然物质又含化学试剂
的培养基称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养
基。
? ⑶ 合成培养基,采用多种化学试剂配制的，各
种成分及其用量都确切知道的培养基。如高氏
一号培养基。
? 根据培养基制成后的物理状态可分为,
? ⑴ 液体培养基,呈液体状态的培养基。
? ⑵ 固体培养基,外观呈固体状态的培养
基。
? ⑶ 半固体培养基,将各种营养成份按比
例配制成营养液后，加入适量固化剂,
处于半固体状态的培养基。
? ⑴ 基础培养基, 含有多数有机营养型细菌所需
养分。
? ⑵ 加富培养基, 加入有利于某类微生物生长繁
殖所需的营养物质，使其增值速度快于其他微
生物。
? ⑶ 选择培养基,加入某些物质或除去某些营养
物质以阻抑其他微生物生长，从而有利于某一
类群或某一目标微生物生长。
? ⑷ 鉴别培养基,用来检查微生物的某些代谢特
性。
根据培养基的功能和用途可分为,
4.灭菌实验原理
? 高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压容器内
进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于
密闭，增加了器内的压力，使水的沸点
升高，从而获得高于 100度的蒸汽温度，
导致菌体蛋白质凝固变性 而达到灭菌的
目的。
? 高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点
有三,一湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，
二湿热穿透力强，三蒸气变成水时可放
出大量热增强杀菌效果,因此，它是效
果最好的灭菌方法。
? 适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、
金属用具。一般培养基在 121,3℃ 灭菌
20分钟即可。
? 手提式高压蒸汽灭菌器示意图
?加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器
盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀
门，排净 其中冷空气。
?待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排
出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至
所需压力时 (一般是 101.53kPa,即 15磅 /英寸 2，温度
为 121.3℃ )，开始计时，维持 15-30min。 灭菌时间到
达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，
排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时
突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。
高压蒸汽灭菌器使用方法
5.培养基的制备原则
? ⑴ 有供微生物生长发育的各种营养物质
及足够的水分；
? ⑵ 有合适的酸碱度；
? ⑶ 绝对无菌；
? ⑷ 均质透明。
（三）实验器材
? 1.药品和试剂,牛肉膏、蛋白胨、氯化
钠、蒸馏水、琼脂,1mol氢氧化钠,
1mol盐酸。
? 2.器材,天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、
电炉,PH试纸、试管、三角瓶、分装漏
斗、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。
? 1.称量
按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸
中。
? 配方：牛肉膏 5.0g,蛋白胨 10.0g,NaCl5.0g,
琼脂 20.0g,蒸馏水 1000ml,pH7.0。
（四）实验方法
培养基的制备过程
称量 ---溶解 ----调节 pH值 ----过滤 ---
-分装及包扎 ----灭菌 ----灭菌后试管
摆放斜面
? 2.溶解
? 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加
热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂
的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不
要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补
足所失水分。
? 3.调节 pH值
? 用玻璃棒沾少许液体，测量 PH值。用氢氧化
钠和盐酸调节 PH。
? 4.过滤
用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要
求可省去。
? 5.分装及包扎
? 根据不同的需要，可将制好的培养基分
装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，
管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将
棉塞部分包好。
? 6.灭菌,高压蒸汽灭菌,1210C灭菌 20分
钟。
? 7.灭菌后试管摆放斜面 。
（五）实验作业
? 1.思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种
培养基？
? 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有
效？
实验八 微生物的分离、纯化和接种
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解微生物分离和纯化的原理
? 2.掌握倒平板的方法和几种常用的分
离纯化接种培养的基本操作技术，掌
握微生物的无菌操作技术。
? 微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得
所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种
时不慎污染时也需予以分离。
? 分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待
分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细
胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使
其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不
开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培
养基上的过程。
（二）实验原理
? 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株
微生物的过程称为微生物 分离 与 纯化 。平板分离
法普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理是
选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成
分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂
造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生
长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
? 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，
通常是由一个细胞繁殖而成的集合体 。 因此 可
通过挑取单菌落而获得一种纯培养 。 获取单个
菌落的方法可通过 稀释涂布平板 或 平板划线 等
技术完成。
? 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到
培养基上的操作技术称之为 接种 。接种的关键
是 要严格的进行无菌操作。
（三）实验器材
? 牛肉膏蛋白胨培养基、接种环、酒精
灯、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、接
种环、无菌培养皿、涂布器、恒温培
养箱等。
（四）实验方法 倒平板 → 划线 → 培养 → 挑单菌落 → 接种
移植 → 保存
? 右手持盛培养基的三角瓶臵火焰旁边，用左手将试
管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；
然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，
迅速倒人培养基约 15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，
使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平臵于桌面
上，待凝后即为平板。
1.倒平板
? 平板培养基具有较大的表面积，用于从混
杂的检查材料中分离出纯种细菌,其要点
是如何获得较多的孤立菌落。
2.平板划线分离
? 最常用的平板接种法是划线法。先将接
种环用火焰灭菌，待冷却后挑取检查材
料，涂于平板的上端，随即向下连续平
行划线至平板的底部，划线时接种环与
平板表面所成的角度要小，以免划破琼
脂。划线要密而不重复，充分利用平板
的表面。划线完毕，先盖好平板，再将
接种环上残留的细菌用火焰灭菌。
? 培养后可观察有无孤立菌落生长，每一孤
立菌落即为一纯种细菌。一般病原菌的菌
落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求
出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出
率。
平板划线分离培养结果
? 斜面培养基不易污染，常用于培养纯种
细菌。斜面培养基通常也采用划线接种
法。接种时，右手持接种环，先将接种
环灭菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的
细菌。
3.斜面接种法
? 将平板放回原处后，用左手取斜面培养基，用
右手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过
火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管 (勿
触碰管壁 )，从斜面底部向上连续平行划线 (图
2-2)。划线完毕，再将试管口通过一下火焰，
棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环上的残
留细菌用火焰灭菌。
? 所接种的细菌经培养生长为均质的菌苔。此培
养物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各
种生物学性状检查。
接种环灭菌法 细菌培养物的取材
双管移植法
双管移植法
? 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养
菌接种液体培养基进行生化试验，用接种环
从斜面上沾取少许菌苔，将接种环在液体内
振摇几次即可。
4.液体接种法
半固体培养基穿刺接种法
5.培养
? 分离好的平板做好标记,倒置 于 37℃ 温箱培养
18～ 24h 。
? 接种好的斜面、液体、半固体培养基做好标记，
放 37℃ 温箱培养 18～ 24h 。
（五）实验作业
? 1、细菌分离培养的原理？
? 2、细菌分离培养及移植应注意哪些事
项？
实验九 细菌的培养特性观察及显微镜检查
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.掌握细菌在培养基上的生长表现。
? 2.学习对孤立菌落进行染色镜检。
（二）实验原理
? 细菌的培养特性包括细菌的生长条件和生长表
现，单个细菌或单种细菌在固体培养基表面生
长繁殖，形成肉眼可见的菌落，各种细菌所形
成的菌落特征是不同的，按照各种细菌所形成
的菌落特征，可以在鉴别细菌中作为依据。
? 通过对单个菌落染色镜检达到进一步认识该细
菌的目的。
（三）实验器材
? 细菌分离培养物、酒精灯、玻璃铅笔、
火柴、试管架、接种环、显微镜。
（四）实验内容及方法
? 首先一般先观察整个平板培养基上的菌落
形态及种类，然后再选有代表性的各种孤
立菌落做如下的详细观察。
? 其项目有 大小、形态、隆起、边缘、表面
状况、质地、颜色、透明度 等 。
1.菌落形态
? 大小,一般可描述为针尖大、粟粒大等，也可
按实测 mm数表示之。
? 形状,点状、圆形、卵圆形、叶状等。
? 边缘,整齐、锯齿状、毛发状等。
? 表面,光滑、皱纹、湿润、干燥等。
? 隆起度,凸起、扁平、中心凹陷等。
? 结构,均质性、颗粒状等。
? 色调,无色、白色、黄色、褐色等。
? 透明度,透明、半透明、不透明等。
菌落形态
? 注意,观察菌落时，不要将空气中落入培
养基而生长的杂菌误认为目的细菌。杂菌
一般生长于划线痕迹外，或为个别的形状
异常的孤立菌落。另外观察时，也要注意
保护好平板，勿使再落入杂菌。
? 选择经肉眼详细观察过的不同种类的孤立菌落
各一个，用特殊铅笔在平皿底部作圈记并编号，
然后再涂膜，做革兰氏染色。
? 染色后镜检，注意观察视野内是否为形态相同
的纯种细菌，注意其形态、排列、染色性等，
如有不同，则可能挑菌时触碰其它菌落，应另
选菌落涂片染色。
2,染色镜检
（五）实验作业
? 1,将细菌菌落观察结果绘图记录。
? 2,将染色镜检结果绘图记录。
实验十 稀释平板测数法
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
一、实验目的
? 了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹
平板培养法和混合平板培养法，认识
细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理
? 稀释平板计数 是根据微生物在固体培养基上所形成
的单个 菌落,是由一个 单细胞 繁殖而成这一培养特
征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
? 计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，
尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞
存在 （否则一个菌落就不只是代表一个细胞），
再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，
使其均匀分布于平板中的培养基内。
? 经培养后，由 单个细胞生长繁殖形成菌
落，统计菌落数目，即可计算出样品中
的含菌数 。
? 此法所计算的菌数是培养基上长出来的
菌落数，故又称 活菌计数 。一般用于某
些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制
品检验、土壤含菌量测定及食品、水源
的污染程度的检验。
三、实验器材
? 1．活材料：土壤
? 2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
? 3．器材,100ml无菌水,9ml无菌水、无菌平皿、
lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲
等。
四、实验方法
1.样品稀释液的制
备 准确称取待测样
品 l0g,放入装有 90ml
无菌水并放有小玻璃
珠的 250ml三角瓶中，
振荡，使微生物细胞
分散，静臵 20-30s，
即成 10-1稀释液；再
用 1ml无菌吸管，吸取
10-1稀释液 lml,移入
装有 9ml无菌水的试管
中,
四、实验方法
吹吸 3次，让菌液混合
均匀，即成 10-2稀释
液；再换一支无菌吸
管吸取 10-2稀释液 1
ml,移入装有 9ml无菌
水的试管中，也吹吸
三次，即成 l0-3稀释
液；
以此类推，连续
稀释，制成 10-4,10-
5,10-6等一系列稀释
菌液
? 用 稀释平板计数 时，待测菌稀释度的选
择应根据样品确定。样品中所含待测菌
的数量多时，稀释度应高，反之则低。
测定土壤细菌数量时，采用 10-4, 10-5,
10-6稀释度。
2．平板种接培养
? 平板接种培养有 混合平板培养法 和 涂抹
平板培养法 两种方法。
? （ 1） 混合平板培养法 将无菌平板编上
10-4, 10-5, 10-6号码，每一号码设臵
三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求
吸取 10-6稀释液各 1ml放入编号 10-6的 3个
平板中,
? 同法吸取 10-5稀释液各 lml放入编号 10-5的 3
个平板中，再吸取 10-4稀释液各 lml放入编号
10-4的 3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸
管可不必更换） 。
? 然后在 9个平板中分别倒入已融化并冷却至
45— 50℃ 的细菌培养基，轻轻转动平板，使
菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒臵，适温
培养。至长出菌后即可计数
（ 2）涂抹平板计数法
? 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所
不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无
菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌
吸管吸取 0.1ml菌液，对号接种在不同稀
释度编号的琼脂平板上（每个编号设三
个重复）。
? 用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，
每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释
度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向
高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。
? 将涂抹好的平板平放于桌上 20-30min，
使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒
转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
五、实验作业,
稀释度 10-4 10-5 10-6
菌落数
1 2 3 4 平均 1 2 3 4 平均 1 2 3 4 平均
1g样品活菌数
将实验结果填入下表
? 计算结果时，常按下列标准从接种后的 3个稀释度
中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含
菌数。
? （ 1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太
悬殊。
? （ 2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿 30—
300个菌落为宜，霉菌以每皿 10— 100个菌
落为宜。
? 选择好计数的稀释度后，即可统计在平板
上长出的菌落数，统计结果按下式计算。
? 混合平板计数法,
? 每克样品的菌数 =同一稀释度几次重复的
菌落平均数×稀释倍数
? 涂抹平板计效法,
? 每克样品的菌数 =同一稀释度几次重复的
菌落平均数× 10×稀释倍数
实验十一 物理因素对微生物的影响
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验内容及方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 了解物理因素抑制或杀死微生物的作用
及其试验方法。
（二）实验原理
? 采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微
生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为 灭
菌 。用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝
大多数微生物的方法称为 消毒 。
? 微生物广泛存在于周围环境中，消毒灭菌主要
是通过理化因素使微生物的主要代谢发生障碍，
或菌体蛋白质变性凝固，或破坏其遗传物质，
导致微生物死亡。
? 这里主要介绍物理因素杀灭微生物的几
种方法，以及相关器材的使用。在微生
物的生长范围内有 最高、最适、最低生
长温度,一旦超过最低和最高生长温度，
微生物均不能生长，或处于休眠状态，
甚至死亡。
（三）实验器材
? 1.菌种：大肠杆菌 24h培养物。
? 2.培养基：普通琼脂培养基、无菌水。
? 3.器材：无菌培养皿、无菌三角玻棒、
无菌五角星黑纸、无菌吸管、镊子、恒
温培养箱、高压灭菌器。
（四）实验内容及方法
1.温度对微生物的影响
高
温
灭
菌
干热灭菌
湿热灭菌
火焰灭菌 ★
烘箱内干燥热空气灭菌 ★
巴斯德消毒法
间歇灭菌法
高压蒸汽灭菌法 ★★
干热灭菌,
? ① 火焰灭菌,常用酒精灯、接种环
? 特点：彻底、迅速。
? ② 干燥热空气箱 灭菌,
? 用法, 干燥热空气杀死微生物，通常将灭菌
物品臵于鼓风干燥箱内,160 ℃ -170 ℃ 加热
2h以达到灭菌目的。玻璃器皿、金属用具常用
此方法灭菌 。
? 特点, 由于空气传热穿透力差，菌体在脱水
状态下不易杀死。所以温度高、时间长。
? 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升,以达
到高温灭菌目的的方法。
? a,方法：一般 121℃ （ 15磅 /英寸 2）
? 时间,20-30min。
? 器材,高压灭菌器
? 加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌
器盖，拧紧螺旋使之密闭。灭菌器下用煤气或电
炉等加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气，
否则压力表上所示压力并非全部是蒸汽压力，灭
菌将不完全。
湿热灭菌 (moist heat sterilization)
? 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续
排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐
渐升至所需压力时 (一般是 101.53kPa,即 15磅 /英
寸 2，温度为 121.3℃ )，调解炉火，保持压力和温
度（注意压力不要过大，以免发生意外），维持
20-30min。
? 灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，
慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。 切不可
在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免
灭菌器中液体喷出。
? b 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养
皿。
? c 注意事项,
? 1.灭菌开始排净冷空气；
? 2.灭菌终了，缓慢降压回；
? 3.灭菌结束，趁热取出物品。
? 湿热灭菌较干热灭菌效果好
1.特点,
温度低、时间短、灭菌效果好。
2.灭菌效果好的原因,
a.菌体内含水量越高凝固温度越低；
b.蒸汽冷凝会放出潜热。
c.饱和水蒸汽穿透力强。
d.湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主
要破坏氢键结构。
? 紫外线 对微生物有明显的致死作用，波长
260nm紫外线具有最高的杀菌效应。剂量
高、时间长、距离短时就易杀死它们。
? 光复活现象,经紫外线照射后受损害的细
胞，如立即暴露在可见光下，则有一部分仍
可恢复正常活力。
2.紫外线对微生物的影响
? 实验方法,将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按
无菌操作制成平板，用无菌移液管吸取
0.1mL大肠菌液涂布于平板上（用无菌三角
玻棒）。
? 在无菌室中，将无菌五角星牛皮纸放置于平
板，在距离紫外灯的 30cm处照射 20min，
去牛皮纸加皿盖（如图）。于 37 ℃ 温箱中
倒置培养 24h后记录结果。
紫外线对微生物的影响
1.牛皮纸 2.紫外线照射区 3.遮牛皮纸处有细菌处
4.紫外线照射处无细菌生长
（五）实验作业
? 1.高温对微生物生长各有何影响？为
什么？
? 2.紫外线照射时，为什么要除掉皿
盖？
实验十二 药敏试验
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解化学药剂的杀菌和消毒作用，学
习纸片扩散法测定该细菌对某种药物的
敏感程度。
? 2.掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。
（二）实验原理
? 一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀
死作用。因此，在实验室内和生产中常利
用某些化学药剂进行杀菌或或消毒。不同
的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能
力不同，此外，药剂浓度、作用时间及环
境条件不同，其效果也不同。
? 本实验所用的方法为 Bauer-Kirby法，即
常用的纸片法。其原理是将干燥的浸有
一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种
一定量某种细菌的琼脂平板上。
? 经培养后，可在纸片周围出现无细菌生
长区，称 抑菌环 。测量抑菌环的大小，
即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。
（三）实验器材
? 1.活材料,培养 24h的大肠杆菌或葡萄球菌、
沙门氏菌斜面菌种。
? 2.培养基和试剂,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，
药敏片（ 1g/L HgCl2,0.2mg/L链霉素,
0.2mg/L青霉素,50g/L石炭酸，或其它种类消
毒剂、抗生素。）
? 3.器材,无菌平皿，无菌水，无菌吸管，玻璃
刮铲，无菌镊子。
（四）实验方法
? 1.制平板,取无菌平皿，将已溶化并冷却至
50oC左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌
操作法倒入平皿中,使之冷凝成平板。
? 2.制备菌悬液,取无菌水，用接种环取菌种
1-2环接入无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液。
制平板 — 制备菌悬液 — 接种 — 加药片 — 培养
? 3.接种,用无菌吸管吸取已制好的菌悬
液 0.1ml接种于平板上，用无菌玻璃刮铲
涂匀。
? 4.加药片,用无菌镊子将浸药滤纸片分
别平铺于含菌平板上，注意药片放好后
不要移动，并在平皿背面做好标记。
? 5.培养,将平皿臵于 37oC下培养 24h观察
结果。
? 药物敏感试验（纸片扩散法）
1.滤纸片 2.有菌区 3.抑菌区
（五）实验作业
? 取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌
圈产生，并测量抑菌圈的大小。将测量结
果记录下来。
? 附录,药物纸片的制备：取普通滤纸用打
洞机打成直径 6mm的圆形纸片，浸于一定浓
度的抗生素中。
实验十三 细菌的生化试验
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解几种常用的细菌生化试验方法。
? 2.了解这些生化试验的原理。
（二）实验原理
? 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。
由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种
差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用
糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以
其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不
同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物
学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生
化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
? 细菌具有分解某些糖类的特定酶，可根据细菌
分解利用糖能力的差异，表现出是否 产酸产气
作为鉴定菌种的依据。
? 是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴
甲酚紫（即 B.C.P指示剂，其 pH在 5.2以下呈黄
色,pH在 6.8以上呈紫色），经培养后根据指
示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵
培养基中放入倒置杜氏小管观察。
? 本试验采取的方法是在做好的发酵管中加入
0.5%的 琼脂粉,使发酵管成为 半固体状态,培
养后观察培养基产生气泡的状态判断产气情况。
1,糖类发酵试验原理
2.甲基红试验（ M.R.）
? 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄
糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖
代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸
和甲酸等大量酸性产物，可使培养基 pH值下降
至 pH4.5以下。
? 有机酸的产生可由加入的甲基红指示剂变色进行检验，甲基红变色范围为 pH4.2（ 红） —
pH6.3（ 黄），细菌分解葡萄糖产酸，使甲基
红指示剂变红，将培养液由原来的橘黄色变为
红色，则 M.R.（ +） 反应。
3.V.P.试验
? 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能
分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，
脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境
下，被空气中氧气氧化为二乙酰，二乙
酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，
称 V.P.（ +） 反应。
4.吲哚试验
? 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨
中的色氨酸生成吲哚 (靛基质 )。吲哚本
身没有颜色，不能直接看见，但当加入
对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与
吲哚作用，形成 红色 的玫瑰吲哚。
（三）实验器材
? 1.活材料：大肠杆菌（ E,coli）,沙门氏杆菌
? 2.培养基
糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽
糖、蔗糖）
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基
? 3.试剂
甲基红试剂,V.P.试剂、吲哚试剂。
? 4, 器材
接种环、酒精灯、恒温培养箱。
（四）实验方法
? 1,试管标记,取葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘
露醇、麦芽糖发酵试管和 M.R.,V.P.,吲哚
培养液试管各一支，标记上所要接种的菌
种。
? 2,接种,以无菌操作分别接种少量菌苔至以
上各相应试管中，糖发酵管为半固体培养基，
用穿刺接种法接种。
? 3.培养,臵 37℃ 恒温箱中培养，糖发酵管在
培养 24h后观察结果,M.R.和 V.P.在培养 48h
后观察结果，吲哚在培养 72h后观察结果。
培养液试管 → 标记 → 接种 → 培养 → 观察 → 记录
? 与对照管比较，若糖发酵管保持原有颜色，其
反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，
记录用,－,表示；如呈黄色，反应结果为阳
性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用,＋,
表示。
? 培养基中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖
能产酸并产气，记录用,⊕,表示；没有气泡
为阴性反应，记录用,－,表示。
4,结果观察
糖发酵管结果观察
M.R.试验结果观察
? 于 M.R.培养液中，各加入 2～ 3滴甲基红指示剂，
注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培
养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄
色，则为阴性反应，分别用, ＋, 或, －, 表
示。
V.P.试验结果观察
? 取 V.P.试管，加入等量 V.P.试剂，摇匀，以使
空气中的氧溶入，静臵于 37℃ 恒温箱中保温
15～ 30min后，若培养液呈红色，记录为 V.P.
试验阳性结果（用, ＋, 表示）；
? 若不呈红色，仍未为黄中带蓝色者记录为 V.P.
试验阴性结果（用, －, 表示）。
吲哚试验结果观察
? 在培养液中加入乙醚 1～ 2ml,经充分振荡使吲
哚萃取至乙醚中，静臵片刻后乙醚层浮于培养
液的上面，此时沿管壁缓慢加入 1ml吲哚试剂
（ 加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙
醚层影响结果观察 ）。
? 如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲
哚试验阳性反应，仍呈黄色为阴性反应，阳性
用, ＋,,阴性用, －, 表示。
（五）实验作业
? 1.以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其
原理是什么？
? 2.细菌生理生化反应试验中为什么要设
对照？
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
试验十四 酸乳的制作
（一）实验目的
? 学习并掌握酸奶制作的基本原理和方法。
（二）实验原理
? 酸奶是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的
一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制
品，是具有一定保健作用的食品。
? 其基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产
生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白变形凝固而使整
个牛奶呈凝乳状态。同时通过发酵还可形成酸
奶特有的香味和风味。
（三）实验器材
? 1.活材料,一般选用保加利亚乳杆菌和
嗜热链球菌，本试验采用市场购买的酸
乳成品。
? 2.培养基,鲜牛奶，白糖,pH自然。
? 3.器材,铝锅，燃气灶，铝勺，塑料杯，
无菌盖纸，塑料吸管。
（四）实验方法
牛奶加热灭菌 → 加糖 → 冷却 →
接种 → 分装 → 封口 → 保温发酵
?1.牛奶加热至 85-90℃,加入 8%的白砂糖，继续
加热至煮沸,5-8分钟。
?2.冷却至 43-45 ℃,接种，将成品酸乳按照 1比
10加入牛奶中，搅匀。
? 3.分装入清洗过的塑料杯，加无菌封口
纸封口。
? 4.发酵：放入 41.5 ℃ 恒温箱培养 3-4h，
检查是否凝固，取出后放入 2-5 ℃ 冷却
后风味更好，品尝。
（五）实验作业
? 品尝自己做的酸乳，判断其感官品质是
否达到要求，若达不到要求，分析其原
因。
实验十五 水中细菌总数和大肠菌群的检测
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原
理和测定意义。
? 2.学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总
数的方法。
? 3.学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二）实验原理
? 水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来
自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。
水中微生物种类及数量因水源不同而异。一般
地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污
染。
? 水的微生物学检查，常用测定细菌总数和大肠
杆菌菌群数，来判断水的污染程度,目前我国
规定生活饮用水的标准为 1m1水中细菌总数不
超过 100个；每 1升水中大肠菌群数不超过 3个。
超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，
水中可能有病原菌存在。
? 细菌总数, 指 1ml或 1g检样中所含细菌菌
落的总数，所用的方法是稀释平板计数法。
? 大肠菌群, 是指在 37℃24 h内能发酵乳糖
产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽
孢杆菌的总称, 主要由肠杆菌科中的四个
属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬
酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
? 水的大肠菌群数, 指 100ml水样内含有大
肠菌群实际数值，以 MPN表示, 水中大肠
菌群的数量，是直接反映水源被人畜排
泄物污染的一项重要指标，国际上公认
大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因
此，必须对饮用水进行大肠菌群的检查 。
（三）实验器材
? 1.菌落总数的测定,
? （ 1）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；
? （ 2）器材：灭菌三角瓶，灭菌平皿，灭
菌吸管，试管,5支 9ml无菌水等。
? 2.大肠菌群测定,
? （ 1）培养基,
? a.乳糖胆盐蛋白胨培养基 ；
? b.伊红美兰琼脂培养基；
? c.乳糖发酵管。
? （ 2）材料：灭菌三角瓶，灭菌平皿，灭
菌吸管，试管,9ml无菌水等。
（四）实验方法
? 1.水样的采集, 本实验采集的是池水，在
距岸边 5米处，距水面 10-15cm的深水水样，
将灭菌的三角瓶瓶口向下浸入水中，然后
翻转过来，盛满后，将瓶塞盖好。
? 2.细菌总数的测定,
? ① 样品稀释, 以无菌操作方法吸取 1ml充
分混匀的水样，注入盛有 9ml灭菌水的试管
中，混匀成 1,10稀释液。
水源水 1ml 1ml 1ml
1ml 1ml 1ml
池塘水
1ml 1ml 1ml 1ml
10-1 10-2 10-3 10-4
? 吸取 1,10的稀释液 1ml注入盛有 9ml灭菌水的
试管中，混匀成 1,100稀释液。按同法依次稀
释成 1,1000,1,10000稀释液等备用。 吸
取不同浓度的稀释液时必须更换吸管。
? ② 接种, 用灭菌吸管取 2～ 3个适宜浓度的稀
释液 1ml，（ 一般选择 1,100, 1,1000,1：
10000稀释液）分别注入灭菌平皿。
? 倾注约 15ml已融化并冷却到 45℃ 左右的营养琼脂培养
基，并立即旋摇平皿，使水祥与培养基充分混匀。每
个样品做两个平皿接种。
? ③ 培养,待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，
臵于 37℃ 恒温箱内培养 24h,进行菌落计数，即为水
样 1ml中的细菌总数。
? ④ 计数方法,作平皿菌落计数时，可用眼晴直接观
察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿
的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一
步计算时应用。
⑤ 计数的报告
? 应选择菌落数在 30-300之间的平板作为菌落总
数测定标准，在求同稀释度的平均数时，若其
中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采
用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释
度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，
而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此
半皿计数后乘 2以代表全皿菌落数。然后再求
该稀释度的平均菌落数。
3.细菌总数的报告
? 菌落计数的报告：菌落数在 100以内时按
实有数报告，大于 100时，采用二位有效
数字，在二位有效数字后面的数值，以
四舍五入方法计算，为了缩短数字后面
的零数也可用 10的指数来表示。
2.大肠菌群的测定 （多管发酵法）
? 1.初步发酵实验,
? 方法,将 10-2,10-3,10-4水样各取 1ml接种于
乳糖胆盐蛋白胨培养液中，内有倒臵杜氏小
管,37℃ 培养 24hr,观察产酸和产气情况。
产酸产气初步确定有大肠菌群。
? 产酸：溴甲酚紫作指示剂，培养基由紫色变
为黄色。
? 产气：杜氏小管顶端有气泡。
初步发酵实验 → 平板分离 → 复发酵实验 → 报告
2,平板分离
? （ 1）划线分离,将第一步产酸产气的
菌落划线接种在伊红美兰固体培养基表
面,37℃ 培养 24hr,目的阻止厌氧芽
孢杆菌生长。大肠菌群在 EMB平板上，
菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有
金属光泽，或者呈紫红色，仅中间颜色
较深。
（ 2）革兰氏染色
? 取有典型菌落特征的单个菌落进行革兰
氏染色。
? 大肠菌群和好氧芽孢杆菌生长。同时大
肠菌群有特征性菌落出现。
? 大肠菌群：革兰氏阴性菌、不生芽孢、
好氧。
? 好氧芽孢杆菌：革兰氏阳性菌、生芽孢、
好氧 。
3,复发酵试验
? 将可疑菌落（革兰氏阴性、伊红美兰特征
菌落）移接于单倍乳糖发酵管中，每管可
接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌
落 1-3个,37℃ 培养 24h。
? 产酸产气者确定为有大肠菌群存在。
4,根据有大肠菌群的阳性管数查表计算。
（五）实验作业
? 记录实验结果，并对所测样品作出评
价。
实验十六 病毒的鸡胚培养
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方
法。
? 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病
毒的操作技术。
（二）实验原理
? 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡
胚培养两种方法，而鸡胚培养更为常
见。一般而言，禽病毒病大部分可经
鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热
也可经鸡胚分离病毒。
? 鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的
疫苗接种方法。这种方法就是对孵化后
期的鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些
病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响，
通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具
有免疫保护力。
（三）实验器材
? 1.鸡胚, 要选择 SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所
以要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽
流感病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖
致死鸡胚。
? 孵化前的鸡胚应注意消毒，臵 37-38℃, 相对
湿度 45-60%的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，
孵蛋第 4天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。多
采用 9-11日龄的活胚接种。
2.接种材料,
? 本实验采用 新城疫弱毒活疫苗 作试验用。
? 3.各种器材,
? 孵蛋器、照蛋器、蛋托、打孔器,1ml注
射器,41/2针头、镊子,3%碘酊,75%酒精
棉球、记号笔、固体石蜡、酒精灯、剪刀、
眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管。
（四）实验方法
? 1.接种前的准备,
? a.鸡胚的准备,选择 9-11日龄的鸡胚，在照
蛋时以记号笔勾出气室，于气室稍下方胚胎活
跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划
上记号，作为接种部位。用 3%碘酊对接种部位
进行消毒，再用 75%酒精棉球擦一遍，在接种
定位处打孔，气室向上竖放于蛋托上。
鸡胚的模式结构
1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔
4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白
? b.病毒材料的准备,要分离培养的病毒材料
应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严
格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按
照每 1000羽份配成 250ml,为达到无菌的目的，
可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各
100-5000IU,臵室温中 1h处理。
2.接种
? 鸡胚接种的方法有几种,
绒毛尿囊腔内接种 ★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
卵黄囊内接种
? 取 10-12日龄的鸡胚，照
蛋选择血管较少的部位做
一记号，用磨蛋器磨一于
纵轴平行的裂痕，小心挑
开蛋壳，将白色的壳膜用
针尖小心挑破，不要伤及
血管丰富而透明的绒毛尿
囊膜，在气室顶端钻一小
孔，用滴管贴近小孔，轻
轻一吸，绒毛尿囊膜便下
陷成一小凹。
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎 2.羊膜腔 3.绒毛尿囊膜
取 10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
放回孵化器，使蛋直立
孵化。
羊膜腔接种
羊膜腔接种
1.鸡胚胎 2.羊膜腔 3.绒毛尿囊膜 4.羊膜
选择 6-8日龄的鸡胚，
照蛋检查，划出气室
和胎位，并以气室向
上竖立在蛋托上，气
室端的蛋壳经消毒后
以打孔器钻一小孔，
将注射针头刺过小孔，
沿着卵的纵轴刺入约
3cm,然后注入
0.2ml的病毒接种液，
用氧化锌胶布及石蜡
封口后放回孵化器中
培养。
卵黄囊内接种
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种
3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
绒毛尿囊腔内接种 ★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
卵黄囊内接种
3.收毒,病毒的收毒根据接种的途径而定。
尿 囊 液
绒毛尿囊膜
羊 水
卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
? 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦
净后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚
胎等残物煮沸消毒后弃去。
（五）实验作业
? 1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意
什么问题？
? 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程
中应注意哪些问题？
实验十七 病毒的血凝实验 （ HA）
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验要点
? （六）实验作业
（一）实验目的
? 1.掌握病毒的血凝试验的操作方法。
? 2.掌握病毒效价的判定。
（二）实验原理
? 某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症
等，有能凝集动物红细胞的特性，此即
红细胞凝集现象。
? 这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与
动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，
发生红细胞凝集现象。可以利用这一特
性判断被检材料中有无病毒的存在，并
可以测定病毒的效价。
（三）实验器材
? 1.鸡 1%红细胞悬浮液
? 由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速臵于
装有 抗凝血剂 （ 3%柠檬酸钠溶液）的离
心管中，用生理盐水洗涤 3次，每次以
3000r/min离心 10分钟，将血浆、白细胞
等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，
用 PH=7的生理盐水稀释成 1%悬浮液。
? 2.病毒：鸡新城疫弱毒疫苗
? 3.0.85%生理盐水，微量移液器,96孔板，
滴头，微量振荡器。
材料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
生理盐
水 (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 对照 病 毒(μl)
1%鸡
红细胞
悬液
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
稀 释
倍 数 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
1/25
6 1/512
1/102
4
1/204
8
结 果 凝 凝 凝 凝 凝 凝 凝 不凝 不凝 不凝 不凝 不凝
弃
（四）实验方法
? 上述材料全部按顺序加完后，振荡 96孔
板，使红细胞与病毒充分接触，然后臵
于 20-22℃ 室温中静臵，自第 15分钟开始
观察结果，每 5分钟检查一次，至 60分钟
结束，观察结果时注意不要摇震 96孔板。
? 如果被检材料中有病毒的存在，就会出
现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集
反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管
底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小
圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上
的红细胞沿倾斜面呈线状流动,
结果观察,
? 1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
? 2．观察实验孔
? ++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，
边缘不整齐，无红细胞沉积。
? +++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但
尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。
? ++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面
积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
? +只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞
在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细
胞在此小圆盘周围。
? -不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆
盘，边缘整齐。
病毒血凝呈现的不同程度凝集强度
? 凝集效价,能使红细胞呈 ++凝集的病毒最高
稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗
原。如上述第 7孔为 ++，则该病毒悬液效价为 1：
128，即病毒稀释到 1,128时，每 50μl 中含一
个血凝单位的病毒。凝集孔数越高,病毒凝集
效价越高,
? 4单位病毒,血凝试验（ HA） 测出病毒的 HA价，
配制成 4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。
材料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
生理盐
水 (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 对照 病 毒(μl)
1%鸡
红细胞
悬液
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
稀 释
倍 数 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
1/25
6 1/512
1/102
4
1/204
8
结 果 凝 凝 凝 凝 凝 凝 凝 不凝 不凝 不凝 不凝 不凝
弃
1单位
病毒 4单位病毒
病毒的血凝实验（ HA） 结果分析
（五）实验要点
? 1.配臵 1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免
把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。
? 2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换
一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验
效果。
? 3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入
下一孔中。
? 4.适时观察结果，如果长时间放臵，凝集的
红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。
（六）实验作业
? 1.报告血凝试验 （ HA） 的血凝效价的判定
结果。
? 2.病毒的血凝试验有何意义?
郑州牧业工程高等专科学校生物工程系
? 实验一 显微镜的构造和使用
? 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
? 实验三 霉菌的制片与观察
? 实验四 放线菌和酵母菌形态观察
? 实验五 微生物的显微直接计数法
? 实验六 微生物细胞大小测定
? 实验七 培养基的制备
? 实验八 微生物的分离、纯化和接种
实 验 项 目
? 实验九 细菌的培养特性观察及显微镜检查
? 实验十 稀释平板测数法
? 实验十一 物理因素对微生物的影响
? 实验十二 药敏试验
? 实验十三 细菌的生化试验
? 实验十四 酸乳的制作
? 实验十五 水中细菌总数和大肠菌群的检测
? 实验十六 病毒的鸡胚培养
? 实验十七 病毒的血凝试验
实验一 显微镜的构造和使用
? （一）实验目的
? （二）实验内容和原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）注意事项
? （六）实验作业
Antony van Leeuwenhock
自制单式显微镜观察到细菌等微生物个体
（一）实验目的
? 1.掌握普通光学显微镜的基本构造、使
用方法、保护要点。
? 2.掌握普通光学显微镜油浸系的原理。
? 3.使用油镜观察几种细菌的基本形态。
（二）实验内容和原理
? 1.显微镜的构造
? 普通光学显微镜的构造可分为两大部分：一
为 机械装臵,一为 光学系统,这两部分很好
的配合，才能发挥显微镜的作用。
? （ 1）显微镜的机械装臵
? 显微镜的机械装臵包括 镜座、镜筒、物镜转
换器、载物台、推动器、粗动螺旋、微动螺
旋 等部件。
（ 2）显微镜的光学系统
? 显微镜的光学系统由 反光镜，聚光器，
接物镜，接目镜 等组成，光学系统使物
体放大，形成物体放大像 。
? 根据物镜放大率的高低，可分为,
? ①低倍物镜 指 10×；
? ②高倍物镜指 40×；
? ③ 油浸物镜 100×。
? 普通光学显微镜常用的目镜为 10倍平场
目镜（ P）。
光学显微镜的构造
1,物镜转换器 2,接物镜 3.游标卡尺 4.载物台 5.聚光器 6,彩虹光
阑 7.光源 8,镜座 9,电源开关 10,光源滑动变阻器 11,粗
调螺旋 12,微调螺旋 13,镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.标本移动螺旋
? 显微镜的几个常用系数,
? a.放大倍数 =接物镜放大倍数×接目镜放大倍
数
? b,分辨率, 是表示显微镜辨析物体（两端）
两点之间距离的能力。
? c,数值孔径,也叫做镜口率（或开口率），
它与显微镜的分辨力成正比，与焦深成反比，
与镜象亮度的平方根成正比。
2.油镜使用的原理
? 油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过
玻片与镜头之间的空
气时，由于空气与玻
片的密度不同，使光
线受到曲折，发生散
射，降低了视野的照
明度。
? 加入中间的介质是一
层香柏油（其折射率
与玻片的相近），则
几乎不发生折射，增
加了视野的进光量，
从而使物象更加清晰。
（三）实验器材
? 1.显微镜、香柏油、乙醇 -乙醚混合液、擦
镜纸、吸水纸等。
? 2.细菌三种形态的染色标本。
（四）实验方法
? 一,观察前的准备
? 1、显微镜从显微镜柜或镜箱内拿出时，
要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳
地将显微镜搬运到实验桌上。
? 2、将显微镜放在自己身体的左前方，离
桌子边缘约 10cm左右，右侧可放记录本或
绘图纸。
? 3、调节光照,不带光源的显微镜，可利用灯光
或自然光通过反光镜来调节光照，但不能用直
射阳光，直射阳光会影响物像的清晰并刺激眼
睛。
? 将 10×物镜转入光孔，将聚光器上的虹彩光圈
打开到最大位臵，用左眼观察目镜中视野的亮
度，转动反光镜，使视野的光照达到最明亮最
均匀为止。自带光源的显微镜，可通过调节电
流旋钮来调节光照强弱。
? 二,低倍镜观察
? 镜检任何标本都要养成必须先用低倍镜观察的习
惯。因为低倍镜视野较大，易于发现目标和确定
检查的位臵。
? 将标本片放臵在载物台上，用标本夹夹住，移动
推动器，使被观察的标本处在物镜正下方,转动
粗调节旋钮，使物镜调至接近标本处，用目镜观
察并同时用粗调节旋钮慢慢下降载物台，直至物
像出现，再用细调节旋钮使物像清晰为止 。用推
动器移动标本片，找到合适的目的像并将它移到
视野中央进行观察。
? 三,高倍镜观察
? 在低倍物镜观察的基础上转换高倍物镜。较
好的显微镜，低倍、高倍镜头是同焦的,在
转换物镜时要从侧面观察，避免镜头与玻片
相撞 。然后从目镜观察，调节光照，使亮度
适中，缓慢调节粗调节旋钮，慢慢下降载物
台直至物像出现，再用细调节旋钮调至物像
清晰为止，找到需观察的部位，并移至视野
中央进行观察。
? 四,油镜观察
? 使用油镜按下列步骤操作,
? 1、先用粗调节旋钮将镜筒提升（或将
载物台下降）约 2cm,并将高倍镜转出。
? 2、在玻片标本的镜检部位滴上一滴香
柏油。
? 3、从侧面注视，用粗调节旋钮将载物台
缓缓地上升，使油浸物镜浸入香柏油中，
使镜头几乎与标本接触。
? 4、从接目镜内观察，用粗调节旋钮将载
物台徐徐下降，当出现物像一闪后改用细
调节旋钮调至最清晰为止。如油镜已离开
油面而仍未见到物象，必须再从侧面观察，
重复上述操作。
? 五,观察完后复原
? 下降载物台,将油镜头转出，先用擦镜纸擦去
镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许乙醚乙醇混合
液擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦拭
2— 3下即可，（注意向一个方向擦拭） 。
? 将各部分还原，转动物镜转换器，使物镜头不
与载物台通光孔相对，而是成八字形位臵，再
将载物台下降至最低，降下聚光器，反光镜与
聚光器垂直，最后用柔软纱布清洁载物台等机
械部分，然后将显微镜放回柜内或镜箱中。
? 1.学生使用显微镜固定镜号、位臵，填写使
用卡，本学期一直使用本台显微镜。
? 2.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
? 3.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，
以保证光洁度。
（五）注意事项
? 4.观察标本时，必须依次用低、高倍镜，最后
用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，
切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜
面。
? 5.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察
的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察
时，右眼注视绘图。
? 6.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜
座，不可单手拿，更不可倾斜拿 。
（六）实验作业
? 1.油镜与普通物镜在使用方法上有何不
同？应特别注意些什么？
? 2.使用油镜时，为什么必须用香柏油？
? 3.镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，
而不是直接用高倍镜或油镜观察？
? 4.绘出细菌的几种基本形态。
实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
? （六）注意事项
（一）实验目的,
学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法。
? 1.简单染色法, 是用一种染料使细菌着色以
显示其形态，不能辨别细菌细胞的构造，
通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱
性复红 等）使其着色。
? 2.革兰氏染色法, 是 1884年由丹麦病理学家
C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有
的细菌区分为革兰氏阳性菌 （ G+） 和革兰
氏阴性菌 （ G— ） 两大类，是细菌学上最常
用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌
分为 G+菌和 G— 菌，是由这两类菌的细胞壁
结构和成分的不同所决定的。
（二）实验原理,
? G— 菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的
类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，
故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细
胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复
合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经
复红复染后就成红色。
? G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类
脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚
糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌
仍保留初染时的颜色。
1 2 3 4？ 结晶紫 碘液
酒精
复红
革兰氏阴性杆菌 革兰氏阳性杆菌
G+球菌与 G-杆菌
? 1,活材料,培养 24小时的大肠杆菌
和葡萄球菌。
? 2,染色液和试剂,结晶紫、碘液、
95%酒精、石炭酸复红,蒸馏水、
乙醚 -乙醇混合液、香柏油。
? 3,器材,废液缸、洗瓶、载玻片、
接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。
（三）实验器材
? 1、简单染色,
? （ 1） 涂片,取干净载玻片一块，在载玻片中
央加一滴蒸馏水，按无菌操作法取大肠杆菌
涂片，做成浓菌液，注意取菌不要太多。
? （ 2） 晾干,让涂片自然晾干或者在酒精灯火
焰上方文火烘干。
? （ 3） 固定,手执玻片一端，让菌膜朝上，通
过火焰 2-3次固定（以不烫手为宜）。
(四）实验方法,
? （ 4） 染色,将固定过的涂片放在废液缸上
的搁架上，加复红染色 1-2min。
? （ 5） 水洗,用水洗去涂片上的染色液。
? （ 6） 干燥,将洗过的涂片放在空气中晾干
或用吸水纸吸干。
? （ 7） 镜检,先低倍观察，再高倍观察，并
找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂
片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中
仔细调焦观察细菌的形态。
? 2、革兰氏染色,
? （ 1） 涂片 （ 2） 晾干 （ 3） 固定,与简单染
色法相同
? （ 4） 结晶紫染色,将玻片臵于废液缸玻片
搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结
晶紫染色液染色 1分钟；水洗：倾去染色液，
用水小心地冲洗。
? （ 5） 媒染,碘液，媒染 1min； 水洗：用水
洗去碘液。
? （ 6） 脱色,将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇
脱色 20— 25s至流出液无色，立即水洗。
? （ 7） 复染,滴加复红复染 3-5min； 水洗：
用水洗去涂片上的复红染色液。
? （ 8） 晾干,将染好的涂片用吸水纸吸干。
? （ 9） 镜检,镜检时先用低倍，再用高倍，
最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色
反应性。
? ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净,
? a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。
? b.用擦镜纸沾少许 乙醚 -乙醇混合液 将镜头擦
2-3次。
? c.再用干净的擦镜纸将镜头擦 2-3次。注意擦
镜头时向一个方向擦拭。将显微镜小心轻拿，
按号放入显微镜柜中。
? ②观察后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净，
放入回收容器内。
（ 10)实验完毕后的处理,
? 1.革兰氏染色成败的关键是 酒精脱色 。
如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色
而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰
氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱
色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量
多少等因素的影响，难以严格规定。
？ （五）注意事项
? 2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲
洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色
液被稀释而影响染色效果。
? 3.选用幼龄的细菌。 G+菌培养 12h-16h，
E.coli培养 24h。 若菌龄太老，由于菌体
死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性
反应。
? 绘出 葡萄球菌 和 大肠杆菌 的形态图，并
注明两菌的革兰氏染色的反应性。
（六）实验作业
实验三 霉菌的制片与观察
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
学习霉菌制片并观察霉菌的形态。
曲霉 根霉 青霉
（一）实验目的,
? 曲霉的分生孢子
? 根霉的孢子囊和孢子囊梗
? 孢子梗
? 孢子囊
? 孢子
囊轴
分生孢子
分
生
孢
子
梗
分生孢子梗
? 分生孢子
? 霉菌的营养体是分枝的 丝状体 。其个体比细菌和
放线菌大得多，分为 基内菌丝 和 气生菌丝 。气生
菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝
可以形成不同的孢子。
? 霉菌菌丝较粗大，细胞易收缩变形，且 孢子 容易
飞散，所以制标本时要注意的是：尽量保持细胞
不变形，我们根据这一要求，利用胶带纸粘取霉
菌，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌
形态。
（二）实验原理,
? 1.活材料,在马铃薯琼脂平板上培养 3— 4
天的 曲霉 （ Aspergillus sp.）, 根霉
（ Rhizpus sp.）, 青霉 （ Penicillum
sp.）。
? 2.染色液,美蓝（或结晶紫、复红）染色
液。
? 3.器材,剪刀、镊子、载玻片、胶带纸、
显微镜，吸水纸，擦镜纸。
（三）实验器材
? 胶带纸观察法,在载玻片上滴加一滴染色液，
用胶带纸从生长有霉菌的平板中粘取少量带有
孢子的霉菌菌丝（注意应从基部粘取，避免只
粘取到孢子），压在染液上（勿使产生气泡，
且不要再移动盖玻片），先用 低倍镜,必要时
转换 高倍镜 镜检并记录观察结果。
? 注意观察菌丝 有无隔膜, 有无假根, 足细胞 等
特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状
和构造，孢子着生的方式和孢子的形态、大小
等。
（四）实验方法
? 给出 曲霉, 根霉, 青霉 的个体形态图，并
注明各部位名称。
（五）实验作业,
实验四 放线菌和酵母菌形态观察
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.学习放线菌的印片染色法和胶带纸
粘菌染色法。
? 2.学习自制水浸片法观察酵母菌。
（二）实验原理
? 1.放线菌的孢子丝形状和孢子排列情况是放线
菌分类的重要依据，为了不打乱孢子的排列情
况，常用印片染色法和胶带纸粘菌染色法进行
制片观察。
? 2.酵母菌可以用单纯的水制成水浸片观察，也
可以用染色液制成水浸片观察。
放线菌菌落形态
放线菌形态
酵母菌菌落形态
酵母菌形态
（三）实验器材
? 1.活材料：放线菌培养物，酵母菌斜面
培养物。
? 2.染色液：复红染色液（或结晶紫，美
兰）
? 3.器材：载玻片，胶带纸，小刀，接种
环，吸水纸，擦镜纸，酒精灯，香柏油，
乙醚 -乙醇混合液，显微镜。
（四）实验方法
? 印片, 取干净载玻片一块，用小刀切取
放线菌培养体一块，放在载玻片上，用
另一块载玻片对准菌块的气生菌丝轻轻
按压，然后将载玻片垂直拿起。注意不
要使培养体在玻片上滑动，否则会打乱
孢子丝的自然形态；
印片 → 微热固定 → 石炭酸复红染色
1min→ 水洗 → 晾干 → 镜检
1.印片法,
? 微热固定,将印有放线菌的涂面朝上，
通过酒精灯火焰 2-3次加热固定；
? 染色,石炭酸复红染色 1min；
? 水洗, 水洗后晾干；
? 镜检, 先用低倍镜后用高倍镜，最后用
油镜观察孢子丝、孢子的形态及孢子排
列情况。
2.胶带纸法,
? 粘菌, 用胶带纸在放线菌培养体上粘取
菌体，注意，压取时从菌落边顺着菌体
生长方向，避免从菌落上面压取，以免
取得的全是孢子 。
? 染色, 将粘有菌体的胶带纸压在事先 准
备好的滴油染液的载玻片上 。 将多余染
色液用滤纸吸掉。
? 镜检, 同上。
? 在载玻片上滴加一滴蒸馏水或一滴染色
液，用接种环钓取少许酵母菌放入上述
液滴里，盖上盖玻片，（勿使产生气泡，
且不要再移动盖玻片），先用低倍镜，
后用高倍镜镜检并记录观察结果。注意
观察酵母菌的 大小，芽体，死菌体和活
菌体 。
3.水浸片法观察酵母菌,
（五）实验作业
? 1.绘出放线菌孢子丝和孢子形态图。
? 2.绘出酵母菌形态图。
实验五 微生物的显微直接计数法
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
? 了解 血球计数板 的构造、计数原理和
计数方法，掌握显微镜下直接计数的技
能。
一、实验目的
? 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用
的有 显微直接计数法 和 平板计数法 。
?血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有 4
条槽构成 3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一
短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区。
二、实验原理
? 计数区的刻度有两种：一种是计数区分为
16个大方格（大方格用三线隔开），而每
个大方格又分成 25个小方格；另一种是一
个计数区分成 25个大方格（大方格之间用
双线分开），而每个大方格又分成 16个小
方格。
? 但是不管计数区是哪一种构造，它们都有
一个共同特点，即计数区都由 400个小方格
组成。
? 使用血球计数板计数时，先要测定每个小
方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌
液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
? 计数区边长为 1mm,则计数区的面积为 lmm2，
每个小方格的面积为 1/400mm2。 盖上盖玻
片后，计数区的高度为 0.1mm,所以每个计
数区的体积为 0.1mm3,每个小方格的体积
为 1/4000mm3。
? 所以,1mm3体积应含有小方格数为
1000mm3/1/4000mm3=4× 106个小方格，即
系数 K=4× 106 。
? 因此,每 ml菌悬液中含有细胞数 = 每个
小格中细胞平均数（ N）× 系数（ K）×
菌液稀释倍数（ d）
? 1．活材料,酿酒酵母 （ Saccharomyces
cerevisiae） 菌液。
? 2．器材：显微镜、血球计数板、盖玻片,
吸水纸、计数器、滴管、擦镜纸。
三、实验器材
? 1.取洁净的 血球计数板 一块，在计数区
上盖上一块 盖玻片 。
四、实验方法
? 2.将 酵母菌悬液 摇匀，用滴管吸取少许，从计
数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘
摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体
的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用
吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。
? 也可以将菌悬液直接滴加在计数区上，不要使
计数区两边平台沾上菌悬液，以免加盖盖玻片
后，造成计数区深度的升高。然后加盖盖玻片
（勿使产生气泡）。
? 3．计数时若计数区是由 16个大方格组成，
按对角线方位，数左上、左下、右上、右
下的 4个大方格（即 100小格）的菌数。如
果是 25个大方格组成的计数区，除数上述
四个大方格外，还需数中央 l个大方格的
菌数（即 80个小格）。
? 如菌体位于大方格的双线上，计数时则数
上线不数下线，数左线不数右线，以减少
误差。
? 4．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞
大小一半时，即可作为两个菌体计算。
每个样品重复计数 2-3次（每次数值不应
相差过大，否则应重新操作），求出每
一个小格中细胞平均数（ N）,按公式计
算出每 ml（ g） 菌悬液所含酵母菌细胞数
量。
? 5．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球
计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹
擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾
干或用吹风机吹干，放入盒内保存。
计数
次数
每个大方格菌数
稀
释
倍
数
试管斜
面中的
总菌数
平均
值
1
2
3
4
5
第一次
第二次
将实验结果填入下表中,
五、实验作业,
实验六 微生物细胞大小测定
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
一、实验目的
? 了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造和
使用原理，掌握微生物细胞大小的测定
方法。
二、实验原理
微生物细胞的大小是微生物重要的形态
特征之一，由于菌体很小，只能在显微镜下
来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有
目镜测微尺和镜台测微尺。
目镜测微尺是一块圆
形玻片，在玻片中央
把 5mm长度刻成 50等分，
或把 10 mm长度刻成
100等分。测量时，将
其放在接目镜中的隔
板上 (此处正好与物镜
放大的中间像重叠 )来
测量经显微镜放大后
的细胞物象。
? 由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相
同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不
一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时
须先用臵于镜台上的镜台测微尺校正，以
求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小
格所代表的相对长度。
? 镜台测微尺（图 20-2）是中央部分刻有精确等分线
的载玻片，一般将 lmm等分为 100格，每格长 l0μm
（ 即 0.0lmm）,是专门用来校正目镜测微尺的。校
正时，将镜台测微尺放在载物台上。
? 由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位臵，都要
经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，即镜台
测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此
从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小。
? 所以用镜台测微尺的已知长度在一定放
大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目
镜测微尺每格所代表的长度，然后移去
镜台测微尺，换上待测标本片，用校正
好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量
微生物大小。
三、实验器材
? 1．活材料,酿酒酵母 (Saccharomyces
cerevisiae)斜面菌种。
? 2．器材：显微镜、目镜测微尺、镜台测微
尺、盖玻片、载玻片、滴管、双层瓶、擦
镜纸。
四、实验方法
? 1．目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋
下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入
目镜的隔板上，把镜台测微尺臵于载物台
上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦
距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转
动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻
度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使
两尺的, 0” 刻度完全重合。
? 定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合
的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微
尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜
台测微尺的刻度每格长 l0μm, 所以由下
列公式可以算出目镜测微尺每格所代表
的长度。
? 例如目镜测微尺 5小格正好与镜台测微尺 5小
格重叠，已知镜台测微尺每小格为 l0μm, 则
目镜测微尺上每小格长度为 =5× 10μm/5 ＝
10μm 。
? 用同法分别校正在 高倍镜 下和 油镜 下目镜测
微尺每小格所代表的长度。
? 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同，
因此校正目镜测微尺必须针对特定的显
微镜和附件（特定的物镜、目镜、镜筒
长度）进行，而且只能在特定的情况下
重复使用，当更换不同放大倍数的目镜
或物镜时，必须重新校正目镜测微尺每
一格所代表的长度。
2．细胞大小的测定
? (1)将酵母菌斜面制成一定浓度的菌悬液
? (2)取一滴酵母菌菌悬液制成水浸片。
? (3)移去镜台测微尺，换上酵母菌水浸片，
先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜
下用目镜测微尺来测量酵母菌菌体的长，
宽各占几格（不足一格的部分估计到小数
点后一位数）。
? 测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正
值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌
体的大小要在同一个标本片上测定 10-20
个菌体，求出 平均值,才能代表该菌的
大小。而且一般是用对数生长期的菌体
进行测定。
五、实验作业,
物镜（ μm） 目尺格数 台尺格数 目尺校
正
10×
40×
100×
目镜测微目尺校正结果
将实验结果填入下列表格
酵母菌大小测定记录 （格）
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 平均值
长
宽
? 结果计算 长 μm ＝ 平均格数×校正值
? 宽 μm ＝ 平均格数×校正值
? 大小表示：宽 μm × 长 μm
实验七 培养基的制备
? （一）实验目的
? （二）实验内容及原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1,了解配制培养基的原理和基本程序，
熟悉常用培养基的名称。
? 2.掌握培养基酸碱值的测定。
? 3.了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用
范围，并掌握其具体操作方法。
（二）实验内容及原理
? 1.培养基,用人工方法将多种营养物
质按微生物生长代谢的需要配制成的
一种营养基质。
? 2.培养基营养物质来源,水，碳源，
氮源，矿质营养，生长因素或生长因
子。
? 3.培养基的分类,
? 按照配制培养基的营养物质来源可分为,
? ⑴ 天然培养基,利用天然的有机物配制而成的
培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基。
? ⑵ 半合成培养基,既有天然物质又含化学试剂
的培养基称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养
基。
? ⑶ 合成培养基,采用多种化学试剂配制的，各
种成分及其用量都确切知道的培养基。如高氏
一号培养基。
? 根据培养基制成后的物理状态可分为,
? ⑴ 液体培养基,呈液体状态的培养基。
? ⑵ 固体培养基,外观呈固体状态的培养
基。
? ⑶ 半固体培养基,将各种营养成份按比
例配制成营养液后，加入适量固化剂,
处于半固体状态的培养基。
? ⑴ 基础培养基, 含有多数有机营养型细菌所需
养分。
? ⑵ 加富培养基, 加入有利于某类微生物生长繁
殖所需的营养物质，使其增值速度快于其他微
生物。
? ⑶ 选择培养基,加入某些物质或除去某些营养
物质以阻抑其他微生物生长，从而有利于某一
类群或某一目标微生物生长。
? ⑷ 鉴别培养基,用来检查微生物的某些代谢特
性。
根据培养基的功能和用途可分为,
4.灭菌实验原理
? 高压蒸汽灭菌法是在密闭的加压容器内
进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于
密闭，增加了器内的压力，使水的沸点
升高，从而获得高于 100度的蒸汽温度，
导致菌体蛋白质凝固变性 而达到灭菌的
目的。
? 高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点
有三,一湿热灭菌时菌体蛋白容易变性，
二湿热穿透力强，三蒸气变成水时可放
出大量热增强杀菌效果,因此，它是效
果最好的灭菌方法。
? 适用于一般培养基、玻璃器皿、无菌水、
金属用具。一般培养基在 121,3℃ 灭菌
20分钟即可。
? 手提式高压蒸汽灭菌器示意图
?加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器
盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀
门，排净 其中冷空气。
?待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排
出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至
所需压力时 (一般是 101.53kPa,即 15磅 /英寸 2，温度
为 121.3℃ )，开始计时，维持 15-30min。 灭菌时间到
达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，
排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时
突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。
高压蒸汽灭菌器使用方法
5.培养基的制备原则
? ⑴ 有供微生物生长发育的各种营养物质
及足够的水分；
? ⑵ 有合适的酸碱度；
? ⑶ 绝对无菌；
? ⑷ 均质透明。
（三）实验器材
? 1.药品和试剂,牛肉膏、蛋白胨、氯化
钠、蒸馏水、琼脂,1mol氢氧化钠,
1mol盐酸。
? 2.器材,天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、
电炉,PH试纸、试管、三角瓶、分装漏
斗、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。
? 1.称量
按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸
中。
? 配方：牛肉膏 5.0g,蛋白胨 10.0g,NaCl5.0g,
琼脂 20.0g,蒸馏水 1000ml,pH7.0。
（四）实验方法
培养基的制备过程
称量 ---溶解 ----调节 pH值 ----过滤 ---
-分装及包扎 ----灭菌 ----灭菌后试管
摆放斜面
? 2.溶解
? 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加
热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂
的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不
要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补
足所失水分。
? 3.调节 pH值
? 用玻璃棒沾少许液体，测量 PH值。用氢氧化
钠和盐酸调节 PH。
? 4.过滤
用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要
求可省去。
? 5.分装及包扎
? 根据不同的需要，可将制好的培养基分
装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，
管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将
棉塞部分包好。
? 6.灭菌,高压蒸汽灭菌,1210C灭菌 20分
钟。
? 7.灭菌后试管摆放斜面 。
（五）实验作业
? 1.思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种
培养基？
? 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有
效？
实验八 微生物的分离、纯化和接种
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解微生物分离和纯化的原理
? 2.掌握倒平板的方法和几种常用的分
离纯化接种培养的基本操作技术，掌
握微生物的无菌操作技术。
? 微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得
所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种
时不慎污染时也需予以分离。
? 分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待
分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细
胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使
其长成一个个纯种单菌落。上述工作又离不
开接种，即将一种微生物移接到另一灭菌培
养基上的过程。
（二）实验原理
? 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株
微生物的过程称为微生物 分离 与 纯化 。平板分离
法普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理是
选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成
分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂
造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生
长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
? 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，
通常是由一个细胞繁殖而成的集合体 。 因此 可
通过挑取单菌落而获得一种纯培养 。 获取单个
菌落的方法可通过 稀释涂布平板 或 平板划线 等
技术完成。
? 将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到
培养基上的操作技术称之为 接种 。接种的关键
是 要严格的进行无菌操作。
（三）实验器材
? 牛肉膏蛋白胨培养基、接种环、酒精
灯、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、接
种环、无菌培养皿、涂布器、恒温培
养箱等。
（四）实验方法 倒平板 → 划线 → 培养 → 挑单菌落 → 接种
移植 → 保存
? 右手持盛培养基的三角瓶臵火焰旁边，用左手将试
管塞或瓶塞轻轻地拨出，试管或瓶口保持对着火焰；
然后左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，
迅速倒人培养基约 15ml,加盖后轻轻摇动培养皿，
使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平臵于桌面
上，待凝后即为平板。
1.倒平板
? 平板培养基具有较大的表面积，用于从混
杂的检查材料中分离出纯种细菌,其要点
是如何获得较多的孤立菌落。
2.平板划线分离
? 最常用的平板接种法是划线法。先将接
种环用火焰灭菌，待冷却后挑取检查材
料，涂于平板的上端，随即向下连续平
行划线至平板的底部，划线时接种环与
平板表面所成的角度要小，以免划破琼
脂。划线要密而不重复，充分利用平板
的表面。划线完毕，先盖好平板，再将
接种环上残留的细菌用火焰灭菌。
? 培养后可观察有无孤立菌落生长，每一孤
立菌落即为一纯种细菌。一般病原菌的菌
落数少于杂菌，故在分离培养时，应力求
出现较多的孤立菌落，以提高病原菌检出
率。
平板划线分离培养结果
? 斜面培养基不易污染，常用于培养纯种
细菌。斜面培养基通常也采用划线接种
法。接种时，右手持接种环，先将接种
环灭菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的
细菌。
3.斜面接种法
? 将平板放回原处后，用左手取斜面培养基，用
右手小指和手掌拔去试管棉塞，将试管口通过
火焰略微加热灭菌，再将接种环插入试管 (勿
触碰管壁 )，从斜面底部向上连续平行划线 (图
2-2)。划线完毕，再将试管口通过一下火焰，
棉塞灭菌后，塞好棉塞，最后将接种环上的残
留细菌用火焰灭菌。
? 所接种的细菌经培养生长为均质的菌苔。此培
养物来自孤立菌落，为纯种，可用于该菌的各
种生物学性状检查。
接种环灭菌法 细菌培养物的取材
双管移植法
双管移植法
? 多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养
菌接种液体培养基进行生化试验，用接种环
从斜面上沾取少许菌苔，将接种环在液体内
振摇几次即可。
4.液体接种法
半固体培养基穿刺接种法
5.培养
? 分离好的平板做好标记,倒置 于 37℃ 温箱培养
18～ 24h 。
? 接种好的斜面、液体、半固体培养基做好标记，
放 37℃ 温箱培养 18～ 24h 。
（五）实验作业
? 1、细菌分离培养的原理？
? 2、细菌分离培养及移植应注意哪些事
项？
实验九 细菌的培养特性观察及显微镜检查
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.掌握细菌在培养基上的生长表现。
? 2.学习对孤立菌落进行染色镜检。
（二）实验原理
? 细菌的培养特性包括细菌的生长条件和生长表
现，单个细菌或单种细菌在固体培养基表面生
长繁殖，形成肉眼可见的菌落，各种细菌所形
成的菌落特征是不同的，按照各种细菌所形成
的菌落特征，可以在鉴别细菌中作为依据。
? 通过对单个菌落染色镜检达到进一步认识该细
菌的目的。
（三）实验器材
? 细菌分离培养物、酒精灯、玻璃铅笔、
火柴、试管架、接种环、显微镜。
（四）实验内容及方法
? 首先一般先观察整个平板培养基上的菌落
形态及种类，然后再选有代表性的各种孤
立菌落做如下的详细观察。
? 其项目有 大小、形态、隆起、边缘、表面
状况、质地、颜色、透明度 等 。
1.菌落形态
? 大小,一般可描述为针尖大、粟粒大等，也可
按实测 mm数表示之。
? 形状,点状、圆形、卵圆形、叶状等。
? 边缘,整齐、锯齿状、毛发状等。
? 表面,光滑、皱纹、湿润、干燥等。
? 隆起度,凸起、扁平、中心凹陷等。
? 结构,均质性、颗粒状等。
? 色调,无色、白色、黄色、褐色等。
? 透明度,透明、半透明、不透明等。
菌落形态
? 注意,观察菌落时，不要将空气中落入培
养基而生长的杂菌误认为目的细菌。杂菌
一般生长于划线痕迹外，或为个别的形状
异常的孤立菌落。另外观察时，也要注意
保护好平板，勿使再落入杂菌。
? 选择经肉眼详细观察过的不同种类的孤立菌落
各一个，用特殊铅笔在平皿底部作圈记并编号，
然后再涂膜，做革兰氏染色。
? 染色后镜检，注意观察视野内是否为形态相同
的纯种细菌，注意其形态、排列、染色性等，
如有不同，则可能挑菌时触碰其它菌落，应另
选菌落涂片染色。
2,染色镜检
（五）实验作业
? 1,将细菌菌落观察结果绘图记录。
? 2,将染色镜检结果绘图记录。
实验十 稀释平板测数法
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
一、实验目的
? 了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹
平板培养法和混合平板培养法，认识
细菌、放线菌、霉菌的菌落特征。
二、实验原理
? 稀释平板计数 是根据微生物在固体培养基上所形成
的单个 菌落,是由一个 单细胞 繁殖而成这一培养特
征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。
? 计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，
尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞
存在 （否则一个菌落就不只是代表一个细胞），
再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，
使其均匀分布于平板中的培养基内。
? 经培养后，由 单个细胞生长繁殖形成菌
落，统计菌落数目，即可计算出样品中
的含菌数 。
? 此法所计算的菌数是培养基上长出来的
菌落数，故又称 活菌计数 。一般用于某
些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制
品检验、土壤含菌量测定及食品、水源
的污染程度的检验。
三、实验器材
? 1．活材料：土壤
? 2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基
? 3．器材,100ml无菌水,9ml无菌水、无菌平皿、
lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲
等。
四、实验方法
1.样品稀释液的制
备 准确称取待测样
品 l0g,放入装有 90ml
无菌水并放有小玻璃
珠的 250ml三角瓶中，
振荡，使微生物细胞
分散，静臵 20-30s，
即成 10-1稀释液；再
用 1ml无菌吸管，吸取
10-1稀释液 lml,移入
装有 9ml无菌水的试管
中,
四、实验方法
吹吸 3次，让菌液混合
均匀，即成 10-2稀释
液；再换一支无菌吸
管吸取 10-2稀释液 1
ml,移入装有 9ml无菌
水的试管中，也吹吸
三次，即成 l0-3稀释
液；
以此类推，连续
稀释，制成 10-4,10-
5,10-6等一系列稀释
菌液
? 用 稀释平板计数 时，待测菌稀释度的选
择应根据样品确定。样品中所含待测菌
的数量多时，稀释度应高，反之则低。
测定土壤细菌数量时，采用 10-4, 10-5,
10-6稀释度。
2．平板种接培养
? 平板接种培养有 混合平板培养法 和 涂抹
平板培养法 两种方法。
? （ 1） 混合平板培养法 将无菌平板编上
10-4, 10-5, 10-6号码，每一号码设臵
三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求
吸取 10-6稀释液各 1ml放入编号 10-6的 3个
平板中,
? 同法吸取 10-5稀释液各 lml放入编号 10-5的 3
个平板中，再吸取 10-4稀释液各 lml放入编号
10-4的 3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸
管可不必更换） 。
? 然后在 9个平板中分别倒入已融化并冷却至
45— 50℃ 的细菌培养基，轻轻转动平板，使
菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒臵，适温
培养。至长出菌后即可计数
（ 2）涂抹平板计数法
? 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所
不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无
菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌
吸管吸取 0.1ml菌液，对号接种在不同稀
释度编号的琼脂平板上（每个编号设三
个重复）。
? 用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，
每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释
度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向
高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。
? 将涂抹好的平板平放于桌上 20-30min，
使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒
转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
五、实验作业,
稀释度 10-4 10-5 10-6
菌落数
1 2 3 4 平均 1 2 3 4 平均 1 2 3 4 平均
1g样品活菌数
将实验结果填入下表
? 计算结果时，常按下列标准从接种后的 3个稀释度
中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含
菌数。
? （ 1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太
悬殊。
? （ 2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿 30—
300个菌落为宜，霉菌以每皿 10— 100个菌
落为宜。
? 选择好计数的稀释度后，即可统计在平板
上长出的菌落数，统计结果按下式计算。
? 混合平板计数法,
? 每克样品的菌数 =同一稀释度几次重复的
菌落平均数×稀释倍数
? 涂抹平板计效法,
? 每克样品的菌数 =同一稀释度几次重复的
菌落平均数× 10×稀释倍数
实验十一 物理因素对微生物的影响
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验内容及方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 了解物理因素抑制或杀死微生物的作用
及其试验方法。
（二）实验原理
? 采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微
生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为 灭
菌 。用较温和的物理或化学方法杀死物体上绝
大多数微生物的方法称为 消毒 。
? 微生物广泛存在于周围环境中，消毒灭菌主要
是通过理化因素使微生物的主要代谢发生障碍，
或菌体蛋白质变性凝固，或破坏其遗传物质，
导致微生物死亡。
? 这里主要介绍物理因素杀灭微生物的几
种方法，以及相关器材的使用。在微生
物的生长范围内有 最高、最适、最低生
长温度,一旦超过最低和最高生长温度，
微生物均不能生长，或处于休眠状态，
甚至死亡。
（三）实验器材
? 1.菌种：大肠杆菌 24h培养物。
? 2.培养基：普通琼脂培养基、无菌水。
? 3.器材：无菌培养皿、无菌三角玻棒、
无菌五角星黑纸、无菌吸管、镊子、恒
温培养箱、高压灭菌器。
（四）实验内容及方法
1.温度对微生物的影响
高
温
灭
菌
干热灭菌
湿热灭菌
火焰灭菌 ★
烘箱内干燥热空气灭菌 ★
巴斯德消毒法
间歇灭菌法
高压蒸汽灭菌法 ★★
干热灭菌,
? ① 火焰灭菌,常用酒精灯、接种环
? 特点：彻底、迅速。
? ② 干燥热空气箱 灭菌,
? 用法, 干燥热空气杀死微生物，通常将灭菌
物品臵于鼓风干燥箱内,160 ℃ -170 ℃ 加热
2h以达到灭菌目的。玻璃器皿、金属用具常用
此方法灭菌 。
? 特点, 由于空气传热穿透力差，菌体在脱水
状态下不易杀死。所以温度高、时间长。
? 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升,以达
到高温灭菌目的的方法。
? a,方法：一般 121℃ （ 15磅 /英寸 2）
? 时间,20-30min。
? 器材,高压灭菌器
? 加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌
器盖，拧紧螺旋使之密闭。灭菌器下用煤气或电
炉等加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气，
否则压力表上所示压力并非全部是蒸汽压力，灭
菌将不完全。
湿热灭菌 (moist heat sterilization)
? 待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续
排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐
渐升至所需压力时 (一般是 101.53kPa,即 15磅 /英
寸 2，温度为 121.3℃ )，调解炉火，保持压力和温
度（注意压力不要过大，以免发生意外），维持
20-30min。
? 灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，
慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。 切不可
在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免
灭菌器中液体喷出。
? b 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养
皿。
? c 注意事项,
? 1.灭菌开始排净冷空气；
? 2.灭菌终了，缓慢降压回；
? 3.灭菌结束，趁热取出物品。
? 湿热灭菌较干热灭菌效果好
1.特点,
温度低、时间短、灭菌效果好。
2.灭菌效果好的原因,
a.菌体内含水量越高凝固温度越低；
b.蒸汽冷凝会放出潜热。
c.饱和水蒸汽穿透力强。
d.湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主
要破坏氢键结构。
? 紫外线 对微生物有明显的致死作用，波长
260nm紫外线具有最高的杀菌效应。剂量
高、时间长、距离短时就易杀死它们。
? 光复活现象,经紫外线照射后受损害的细
胞，如立即暴露在可见光下，则有一部分仍
可恢复正常活力。
2.紫外线对微生物的影响
? 实验方法,将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按
无菌操作制成平板，用无菌移液管吸取
0.1mL大肠菌液涂布于平板上（用无菌三角
玻棒）。
? 在无菌室中，将无菌五角星牛皮纸放置于平
板，在距离紫外灯的 30cm处照射 20min，
去牛皮纸加皿盖（如图）。于 37 ℃ 温箱中
倒置培养 24h后记录结果。
紫外线对微生物的影响
1.牛皮纸 2.紫外线照射区 3.遮牛皮纸处有细菌处
4.紫外线照射处无细菌生长
（五）实验作业
? 1.高温对微生物生长各有何影响？为
什么？
? 2.紫外线照射时，为什么要除掉皿
盖？
实验十二 药敏试验
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解化学药剂的杀菌和消毒作用，学
习纸片扩散法测定该细菌对某种药物的
敏感程度。
? 2.掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。
（二）实验原理
? 一些化学药剂对微生物的生长有抑制或杀
死作用。因此，在实验室内和生产中常利
用某些化学药剂进行杀菌或或消毒。不同
的药剂或同一药剂对不同微生物的杀菌能
力不同，此外，药剂浓度、作用时间及环
境条件不同，其效果也不同。
? 本实验所用的方法为 Bauer-Kirby法，即
常用的纸片法。其原理是将干燥的浸有
一定浓度抗菌药物的滤纸片放在已接种
一定量某种细菌的琼脂平板上。
? 经培养后，可在纸片周围出现无细菌生
长区，称 抑菌环 。测量抑菌环的大小，
即可判定该细菌对某种药物的敏感程度。
（三）实验器材
? 1.活材料,培养 24h的大肠杆菌或葡萄球菌、
沙门氏菌斜面菌种。
? 2.培养基和试剂,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，
药敏片（ 1g/L HgCl2,0.2mg/L链霉素,
0.2mg/L青霉素,50g/L石炭酸，或其它种类消
毒剂、抗生素。）
? 3.器材,无菌平皿，无菌水，无菌吸管，玻璃
刮铲，无菌镊子。
（四）实验方法
? 1.制平板,取无菌平皿，将已溶化并冷却至
50oC左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基按无菌
操作法倒入平皿中,使之冷凝成平板。
? 2.制备菌悬液,取无菌水，用接种环取菌种
1-2环接入无菌水中，充分摇匀，制成菌悬液。
制平板 — 制备菌悬液 — 接种 — 加药片 — 培养
? 3.接种,用无菌吸管吸取已制好的菌悬
液 0.1ml接种于平板上，用无菌玻璃刮铲
涂匀。
? 4.加药片,用无菌镊子将浸药滤纸片分
别平铺于含菌平板上，注意药片放好后
不要移动，并在平皿背面做好标记。
? 5.培养,将平皿臵于 37oC下培养 24h观察
结果。
? 药物敏感试验（纸片扩散法）
1.滤纸片 2.有菌区 3.抑菌区
（五）实验作业
? 取出培养平皿，观察滤纸片周围有无抑菌
圈产生，并测量抑菌圈的大小。将测量结
果记录下来。
? 附录,药物纸片的制备：取普通滤纸用打
洞机打成直径 6mm的圆形纸片，浸于一定浓
度的抗生素中。
实验十三 细菌的生化试验
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解几种常用的细菌生化试验方法。
? 2.了解这些生化试验的原理。
（二）实验原理
? 各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。
由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种
差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用
糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以
其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不
同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物
学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生
化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
? 细菌具有分解某些糖类的特定酶，可根据细菌
分解利用糖能力的差异，表现出是否 产酸产气
作为鉴定菌种的依据。
? 是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴
甲酚紫（即 B.C.P指示剂，其 pH在 5.2以下呈黄
色,pH在 6.8以上呈紫色），经培养后根据指
示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵
培养基中放入倒置杜氏小管观察。
? 本试验采取的方法是在做好的发酵管中加入
0.5%的 琼脂粉,使发酵管成为 半固体状态,培
养后观察培养基产生气泡的状态判断产气情况。
1,糖类发酵试验原理
2.甲基红试验（ M.R.）
? 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄
糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖
代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸
和甲酸等大量酸性产物，可使培养基 pH值下降
至 pH4.5以下。
? 有机酸的产生可由加入的甲基红指示剂变色进行检验，甲基红变色范围为 pH4.2（ 红） —
pH6.3（ 黄），细菌分解葡萄糖产酸，使甲基
红指示剂变红，将培养液由原来的橘黄色变为
红色，则 M.R.（ +） 反应。
3.V.P.试验
? 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能
分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，
脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境
下，被空气中氧气氧化为二乙酰，二乙
酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，
称 V.P.（ +） 反应。
4.吲哚试验
? 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨
中的色氨酸生成吲哚 (靛基质 )。吲哚本
身没有颜色，不能直接看见，但当加入
对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与
吲哚作用，形成 红色 的玫瑰吲哚。
（三）实验器材
? 1.活材料：大肠杆菌（ E,coli）,沙门氏杆菌
? 2.培养基
糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽
糖、蔗糖）
葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基
? 3.试剂
甲基红试剂,V.P.试剂、吲哚试剂。
? 4, 器材
接种环、酒精灯、恒温培养箱。
（四）实验方法
? 1,试管标记,取葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘
露醇、麦芽糖发酵试管和 M.R.,V.P.,吲哚
培养液试管各一支，标记上所要接种的菌
种。
? 2,接种,以无菌操作分别接种少量菌苔至以
上各相应试管中，糖发酵管为半固体培养基，
用穿刺接种法接种。
? 3.培养,臵 37℃ 恒温箱中培养，糖发酵管在
培养 24h后观察结果,M.R.和 V.P.在培养 48h
后观察结果，吲哚在培养 72h后观察结果。
培养液试管 → 标记 → 接种 → 培养 → 观察 → 记录
? 与对照管比较，若糖发酵管保持原有颜色，其
反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，
记录用,－,表示；如呈黄色，反应结果为阳
性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用,＋,
表示。
? 培养基中有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖
能产酸并产气，记录用,⊕,表示；没有气泡
为阴性反应，记录用,－,表示。
4,结果观察
糖发酵管结果观察
M.R.试验结果观察
? 于 M.R.培养液中，各加入 2～ 3滴甲基红指示剂，
注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培
养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄
色，则为阴性反应，分别用, ＋, 或, －, 表
示。
V.P.试验结果观察
? 取 V.P.试管，加入等量 V.P.试剂，摇匀，以使
空气中的氧溶入，静臵于 37℃ 恒温箱中保温
15～ 30min后，若培养液呈红色，记录为 V.P.
试验阳性结果（用, ＋, 表示）；
? 若不呈红色，仍未为黄中带蓝色者记录为 V.P.
试验阴性结果（用, －, 表示）。
吲哚试验结果观察
? 在培养液中加入乙醚 1～ 2ml,经充分振荡使吲
哚萃取至乙醚中，静臵片刻后乙醚层浮于培养
液的上面，此时沿管壁缓慢加入 1ml吲哚试剂
（ 加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙
醚层影响结果观察 ）。
? 如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲
哚试验阳性反应，仍呈黄色为阴性反应，阳性
用, ＋,,阴性用, －, 表示。
（五）实验作业
? 1.以上生理生化反应能用于鉴别细菌，其
原理是什么？
? 2.细菌生理生化反应试验中为什么要设
对照？
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
试验十四 酸乳的制作
（一）实验目的
? 学习并掌握酸奶制作的基本原理和方法。
（二）实验原理
? 酸奶是以牛奶等为原料，经乳酸菌发酵而成的
一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制
品，是具有一定保健作用的食品。
? 其基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产
生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白变形凝固而使整
个牛奶呈凝乳状态。同时通过发酵还可形成酸
奶特有的香味和风味。
（三）实验器材
? 1.活材料,一般选用保加利亚乳杆菌和
嗜热链球菌，本试验采用市场购买的酸
乳成品。
? 2.培养基,鲜牛奶，白糖,pH自然。
? 3.器材,铝锅，燃气灶，铝勺，塑料杯，
无菌盖纸，塑料吸管。
（四）实验方法
牛奶加热灭菌 → 加糖 → 冷却 →
接种 → 分装 → 封口 → 保温发酵
?1.牛奶加热至 85-90℃,加入 8%的白砂糖，继续
加热至煮沸,5-8分钟。
?2.冷却至 43-45 ℃,接种，将成品酸乳按照 1比
10加入牛奶中，搅匀。
? 3.分装入清洗过的塑料杯，加无菌封口
纸封口。
? 4.发酵：放入 41.5 ℃ 恒温箱培养 3-4h，
检查是否凝固，取出后放入 2-5 ℃ 冷却
后风味更好，品尝。
（五）实验作业
? 品尝自己做的酸乳，判断其感官品质是
否达到要求，若达不到要求，分析其原
因。
实验十五 水中细菌总数和大肠菌群的检测
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解和学习水中细菌总数和大肠菌群的测定原
理和测定意义。
? 2.学习和掌握用稀释平板计数法测定水中细菌总
数的方法。
? 3.学习和掌握水中大肠菌群的检测方法。
（二）实验原理
? 水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来
自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。
水中微生物种类及数量因水源不同而异。一般
地面水比地下水含菌数量多，并易被病原菌污
染。
? 水的微生物学检查，常用测定细菌总数和大肠
杆菌菌群数，来判断水的污染程度,目前我国
规定生活饮用水的标准为 1m1水中细菌总数不
超过 100个；每 1升水中大肠菌群数不超过 3个。
超过此数，表示水源可能受粪便等污染严重，
水中可能有病原菌存在。
? 细菌总数, 指 1ml或 1g检样中所含细菌菌
落的总数，所用的方法是稀释平板计数法。
? 大肠菌群, 是指在 37℃24 h内能发酵乳糖
产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽
孢杆菌的总称, 主要由肠杆菌科中的四个
属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬
酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
? 水的大肠菌群数, 指 100ml水样内含有大
肠菌群实际数值，以 MPN表示, 水中大肠
菌群的数量，是直接反映水源被人畜排
泄物污染的一项重要指标，国际上公认
大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因
此，必须对饮用水进行大肠菌群的检查 。
（三）实验器材
? 1.菌落总数的测定,
? （ 1）培养基：牛肉膏蛋白胨培养基；
? （ 2）器材：灭菌三角瓶，灭菌平皿，灭
菌吸管，试管,5支 9ml无菌水等。
? 2.大肠菌群测定,
? （ 1）培养基,
? a.乳糖胆盐蛋白胨培养基 ；
? b.伊红美兰琼脂培养基；
? c.乳糖发酵管。
? （ 2）材料：灭菌三角瓶，灭菌平皿，灭
菌吸管，试管,9ml无菌水等。
（四）实验方法
? 1.水样的采集, 本实验采集的是池水，在
距岸边 5米处，距水面 10-15cm的深水水样，
将灭菌的三角瓶瓶口向下浸入水中，然后
翻转过来，盛满后，将瓶塞盖好。
? 2.细菌总数的测定,
? ① 样品稀释, 以无菌操作方法吸取 1ml充
分混匀的水样，注入盛有 9ml灭菌水的试管
中，混匀成 1,10稀释液。
水源水 1ml 1ml 1ml
1ml 1ml 1ml
池塘水
1ml 1ml 1ml 1ml
10-1 10-2 10-3 10-4
? 吸取 1,10的稀释液 1ml注入盛有 9ml灭菌水的
试管中，混匀成 1,100稀释液。按同法依次稀
释成 1,1000,1,10000稀释液等备用。 吸
取不同浓度的稀释液时必须更换吸管。
? ② 接种, 用灭菌吸管取 2～ 3个适宜浓度的稀
释液 1ml，（ 一般选择 1,100, 1,1000,1：
10000稀释液）分别注入灭菌平皿。
? 倾注约 15ml已融化并冷却到 45℃ 左右的营养琼脂培养
基，并立即旋摇平皿，使水祥与培养基充分混匀。每
个样品做两个平皿接种。
? ③ 培养,待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，
臵于 37℃ 恒温箱内培养 24h,进行菌落计数，即为水
样 1ml中的细菌总数。
? ④ 计数方法,作平皿菌落计数时，可用眼晴直接观
察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿
的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一
步计算时应用。
⑤ 计数的报告
? 应选择菌落数在 30-300之间的平板作为菌落总
数测定标准，在求同稀释度的平均数时，若其
中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采
用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释
度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，
而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此
半皿计数后乘 2以代表全皿菌落数。然后再求
该稀释度的平均菌落数。
3.细菌总数的报告
? 菌落计数的报告：菌落数在 100以内时按
实有数报告，大于 100时，采用二位有效
数字，在二位有效数字后面的数值，以
四舍五入方法计算，为了缩短数字后面
的零数也可用 10的指数来表示。
2.大肠菌群的测定 （多管发酵法）
? 1.初步发酵实验,
? 方法,将 10-2,10-3,10-4水样各取 1ml接种于
乳糖胆盐蛋白胨培养液中，内有倒臵杜氏小
管,37℃ 培养 24hr,观察产酸和产气情况。
产酸产气初步确定有大肠菌群。
? 产酸：溴甲酚紫作指示剂，培养基由紫色变
为黄色。
? 产气：杜氏小管顶端有气泡。
初步发酵实验 → 平板分离 → 复发酵实验 → 报告
2,平板分离
? （ 1）划线分离,将第一步产酸产气的
菌落划线接种在伊红美兰固体培养基表
面,37℃ 培养 24hr,目的阻止厌氧芽
孢杆菌生长。大肠菌群在 EMB平板上，
菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有
金属光泽，或者呈紫红色，仅中间颜色
较深。
（ 2）革兰氏染色
? 取有典型菌落特征的单个菌落进行革兰
氏染色。
? 大肠菌群和好氧芽孢杆菌生长。同时大
肠菌群有特征性菌落出现。
? 大肠菌群：革兰氏阴性菌、不生芽孢、
好氧。
? 好氧芽孢杆菌：革兰氏阳性菌、生芽孢、
好氧 。
3,复发酵试验
? 将可疑菌落（革兰氏阴性、伊红美兰特征
菌落）移接于单倍乳糖发酵管中，每管可
接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌
落 1-3个,37℃ 培养 24h。
? 产酸产气者确定为有大肠菌群存在。
4,根据有大肠菌群的阳性管数查表计算。
（五）实验作业
? 记录实验结果，并对所测样品作出评
价。
实验十六 病毒的鸡胚培养
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验作业
（一）实验目的
? 1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方
法。
? 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病
毒的操作技术。
（二）实验原理
? 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡
胚培养两种方法，而鸡胚培养更为常
见。一般而言，禽病毒病大部分可经
鸡胚分离病毒，其他动物病如犬瘟热
也可经鸡胚分离病毒。
? 鸡胚接种技术是养禽业中一种相对新的
疫苗接种方法。这种方法就是对孵化后
期的鸡胚接种某些活的病毒疫苗。这些
病毒疫苗不会对孵化率产生不利的影响，
通过这种方式接种疫苗后孵出的雏鸡具
有免疫保护力。
（三）实验器材
? 1.鸡胚, 要选择 SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所
以要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽
流感病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖
致死鸡胚。
? 孵化前的鸡胚应注意消毒，臵 37-38℃, 相对
湿度 45-60%的孵卵器中孵育，每日翻蛋数次，
孵蛋第 4天开始照蛋，弃去无精蛋和死胚。多
采用 9-11日龄的活胚接种。
2.接种材料,
? 本实验采用 新城疫弱毒活疫苗 作试验用。
? 3.各种器材,
? 孵蛋器、照蛋器、蛋托、打孔器,1ml注
射器,41/2针头、镊子,3%碘酊,75%酒精
棉球、记号笔、固体石蜡、酒精灯、剪刀、
眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管。
（四）实验方法
? 1.接种前的准备,
? a.鸡胚的准备,选择 9-11日龄的鸡胚，在照
蛋时以记号笔勾出气室，于气室稍下方胚胎活
跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划
上记号，作为接种部位。用 3%碘酊对接种部位
进行消毒，再用 75%酒精棉球擦一遍，在接种
定位处打孔，气室向上竖放于蛋托上。
鸡胚的模式结构
1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔
4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白
? b.病毒材料的准备,要分离培养的病毒材料
应是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严
格按照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按
照每 1000羽份配成 250ml,为达到无菌的目的，
可在每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各
100-5000IU,臵室温中 1h处理。
2.接种
? 鸡胚接种的方法有几种,
绒毛尿囊腔内接种 ★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
卵黄囊内接种
? 取 10-12日龄的鸡胚，照
蛋选择血管较少的部位做
一记号，用磨蛋器磨一于
纵轴平行的裂痕，小心挑
开蛋壳，将白色的壳膜用
针尖小心挑破，不要伤及
血管丰富而透明的绒毛尿
囊膜，在气室顶端钻一小
孔，用滴管贴近小孔，轻
轻一吸，绒毛尿囊膜便下
陷成一小凹。
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎 2.羊膜腔 3.绒毛尿囊膜
取 10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
放回孵化器，使蛋直立
孵化。
羊膜腔接种
羊膜腔接种
1.鸡胚胎 2.羊膜腔 3.绒毛尿囊膜 4.羊膜
选择 6-8日龄的鸡胚，
照蛋检查，划出气室
和胎位，并以气室向
上竖立在蛋托上，气
室端的蛋壳经消毒后
以打孔器钻一小孔，
将注射针头刺过小孔，
沿着卵的纵轴刺入约
3cm,然后注入
0.2ml的病毒接种液，
用氧化锌胶布及石蜡
封口后放回孵化器中
培养。
卵黄囊内接种
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种
3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
绒毛尿囊腔内接种 ★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
卵黄囊内接种
3.收毒,病毒的收毒根据接种的途径而定。
尿 囊 液
绒毛尿囊膜
羊 水
卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
? 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦
净后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚
胎等残物煮沸消毒后弃去。
（五）实验作业
? 1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意
什么问题？
? 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程
中应注意哪些问题？
实验十七 病毒的血凝实验 （ HA）
? （一）实验目的
? （二）实验原理
? （三）实验器材
? （四）实验方法
? （五）实验要点
? （六）实验作业
（一）实验目的
? 1.掌握病毒的血凝试验的操作方法。
? 2.掌握病毒效价的判定。
（二）实验原理
? 某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症
等，有能凝集动物红细胞的特性，此即
红细胞凝集现象。
? 这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与
动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，
发生红细胞凝集现象。可以利用这一特
性判断被检材料中有无病毒的存在，并
可以测定病毒的效价。
（三）实验器材
? 1.鸡 1%红细胞悬浮液
? 由健康来航公鸡羽根静脉采血迅速臵于
装有 抗凝血剂 （ 3%柠檬酸钠溶液）的离
心管中，用生理盐水洗涤 3次，每次以
3000r/min离心 10分钟，将血浆、白细胞
等充分洗去，根据沉淀的红细胞压积，
用 PH=7的生理盐水稀释成 1%悬浮液。
? 2.病毒：鸡新城疫弱毒疫苗
? 3.0.85%生理盐水，微量移液器,96孔板，
滴头，微量振荡器。
材料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
生理盐
水 (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 对照 病 毒(μl)
1%鸡
红细胞
悬液
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
稀 释
倍 数 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
1/25
6 1/512
1/102
4
1/204
8
结 果 凝 凝 凝 凝 凝 凝 凝 不凝 不凝 不凝 不凝 不凝
弃
（四）实验方法
? 上述材料全部按顺序加完后，振荡 96孔
板，使红细胞与病毒充分接触，然后臵
于 20-22℃ 室温中静臵，自第 15分钟开始
观察结果，每 5分钟检查一次，至 60分钟
结束，观察结果时注意不要摇震 96孔板。
? 如果被检材料中有病毒的存在，就会出
现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集
反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管
底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小
圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上
的红细胞沿倾斜面呈线状流动,
结果观察,
? 1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
? 2．观察实验孔
? ++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，
边缘不整齐，无红细胞沉积。
? +++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但
尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。
? ++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面
积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
? +只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞
在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细
胞在此小圆盘周围。
? -不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆
盘，边缘整齐。
病毒血凝呈现的不同程度凝集强度
? 凝集效价,能使红细胞呈 ++凝集的病毒最高
稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗
原。如上述第 7孔为 ++，则该病毒悬液效价为 1：
128，即病毒稀释到 1,128时，每 50μl 中含一
个血凝单位的病毒。凝集孔数越高,病毒凝集
效价越高,
? 4单位病毒,血凝试验（ HA） 测出病毒的 HA价，
配制成 4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。
材料 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
生理盐
水 (μl) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 对照 病 毒(μl)
1%鸡
红细胞
悬液
50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
稀 释
倍 数 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128
1/25
6 1/512
1/102
4
1/204
8
结 果 凝 凝 凝 凝 凝 凝 凝 不凝 不凝 不凝 不凝 不凝
弃
1单位
病毒 4单位病毒
病毒的血凝实验（ HA） 结果分析
（五）实验要点
? 1.配臵 1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免
把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。
? 2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换
一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验
效果。
? 3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入
下一孔中。
? 4.适时观察结果，如果长时间放臵，凝集的
红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。
（六）实验作业
? 1.报告血凝试验 （ HA） 的血凝效价的判定
结果。
? 2.病毒的血凝试验有何意义?
