第二章 天然产物有效成分的分离、检测和毒理学安全性与功效性评价 天然产物化学的研究是从有效成分或生理活性化合物的提出、分离工作开始的。在进行提出之前，应对所用材料的基源（如动、植物的学名）、产地、药用部位、采集时间与方法等进行考查，并系统查阅文献，以充分了解、利用前人的经验。 目的物为已知成分或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素或从植物中提取某类成分如总生物碱或总酸性成分时，工作比较简单。一般宜先查阅有关资料，搜索比较该种或该类成分的各种提取方案，尤其是工业生产方法，在根据具体条件加以选用。从天然产物中寻找未知有效成分或有效部位时，情况比较复杂。只能根据预先确定的目标，在适当的活性测试体系指导下，进行提取、分离并以相应的动物模型筛选、临床验证、反复实践，才能达到目的。 天然产物的有效成分往往需要从复杂的均相或非均相体系中提取出来，然后通过分离和去除杂质以达到提纯和精制的目的。 教学目的与要求： 掌握天然药物化学成分提取分离的原理及方法 内容与时间分配：（4学时） 天然产物有效成分分离方法的原理 ——溶剂提取法与水蒸气蒸馏法的原理、操作及其特点 二、天然产物有效成分分离与精制 ——天然产物有效成分各种分离方法的原理 重点与难点： 重点：讲解各种层析方法（硅胶、聚酰胺、葡聚糖凝胶、离子交换树脂、大孔树脂法及分配层析）和两相溶剂萃取法的原理及方法 难点：讲解各种层析方法和两相溶剂萃取法的原理 第一节 天然有效成分的提取 （30分钟） 溶剂法 1、溶剂类型 2、提取范围 3、常用提取方法 水蒸气蒸馏法 升华法 一、溶剂提取法： 　　1．溶剂提取法的原理：溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。当溶剂加到天然产物原料（需适当粉碎）中时，溶剂由于扩散、渗透作用逐渐通过细胞壁透入到细胞内，溶解了可溶性物质，而造成细胞内外的浓度差，于是细胞内的浓溶液不断向外扩散，溶剂又不断进入药材组织细胞中，如此多次往返，直至细胞内外溶液浓度达到动态平衡时，将此饱和溶液滤出，继续多次加入新溶剂，就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。 ??? 天然产物成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲本性有机溶剂及亲脂性有机溶剂，被溶解物质也有亲水性及亲脂性的不同。 　　有机化合物分子结构中亲水性基团多，其极性大而疏于油；有的亲水性基团少，其极性小而疏于水。这种亲水性、亲脂性及其程度的大小，是和化合物的分子结构直接相关。一般来说，两种基本母核相同的成分，其分子中功能基的极性越大，或极性功能基数量越多，则整个分子的极性大，亲水性强，而亲脂性就越弱，其分子非极性部分越大，或碳键越长，则极性小，亲脂性强，而亲水性就越弱。 ??? 各类溶剂的性质，同样也与其分子结构有关。例如甲醇、乙醇是亲水性比较强的溶剂，它们的分子比较小，有羟基存在，与水的结构很近似，所以能够和水任意混合。丁醇和戊醇分子中虽都有羟基，保持和水有相似处，但分子逐渐地加大，与水性质也就逐渐疏远。所以它们能彼此部分互溶，在它们互溶达到饱和状态之后，丁醇或戊醇都能与水分层。氯仿、苯和石油醚是烃类或氯烃衍生物，分子中没有氧，属于亲脂性强的溶剂。 这样，我们就可以通过对天然产物成分结构分析，去估计它们的此类性质和选用的溶剂。例如葡萄糖、蔗糖等分子比较小的多羟基化合物，具有强亲水性，极易溶于水，就是在亲水性比较强的乙醇中也难于溶解。淀粉虽然羟基数目多，但分子大大，所以难溶解于水。蛋白质和氨基酸都是酸碱两性化合物，有一定程度的极性，所以能溶于水，不溶于或难溶子有机溶剂。甙类都比其甙元的亲水性强，特别是皂甙由于它们的分子中往往结合有多数糖分子，羟基数目多，能表现出较强的亲水性，而皂甙元则属于亲脂性强的化合物。多数游离的生物碱是亲脂性化合物，与酸结合成盐后，能够离子化，加强了极性，就变为亲水的注质，这些生物碱可称为半极性化合物。所以，生物碱的盐类易溶于水，不溶或难溶于有机溶剂；而多数游离的生物碱不溶或难溶于水，易溶于亲脂性溶剂，一般以在氯仿中溶解度最大。鞣质是多羟基的化台物，为亲水性的物质。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性的成分。 　　 总的说来，只要天然产物成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自天然产物中提取所需要成分的依据之一。 　　2．溶剂的选择：运用溶剂提取法的关键，是选择适当的溶剂。溶剂选择适当，就可以比较顺利地将需要的成分提取出来。选择溶剂要注意以下三点：①溶剂对有效成分溶解度大，对杂质溶解度小；②溶剂不能与中药的成分起化学变化；③溶剂要经济、易得、使用安全等。 常见的提取溶剂可分为以下三类： 　　1）水：水是一种强的极性溶剂。天然产物中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及甙类等都能被水溶出。为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水及碱水作为提取溶剂。酸水提取，可使生物碱与酸生成盐类而溶出，碱水提取可使有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分溶出。但用水提取易酶解甙类成分，且易霉坏变质。某些含果胶、粘液质类成分的天然产物，其水提取液常常很难过滤。沸水提取时，天然产物中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的天然产物，不宜磨成细粉后加水煎煮。中药传统用的汤剂，多用中药饮片直火煎煮，加温可以增大中药成分的溶解度外，还可能有与其他成分产生“助溶”现象，增加了一些水中溶解度小的、亲脂性强的成分的溶解度。但多数亲脂性成分在沸水中的溶解度是不大的，既使有助溶现象存在，也不容易提取完全。如果应用大量水煎煮，就会增加蒸发浓缩时的困难，且会溶出大量杂质，给进一步分离提纯带来麻烦。天然产物水提取液中含有皂甙及粘液质类成分，在减压浓缩时，还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难。通常可在蒸馏器上装置一个汽一液分离防溅球加以克服，工业上则常用薄膜浓缩装置。 ?　　2）亲水性的有机溶剂：也就是一般所说的与水能混溶的有机溶剂，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，以乙醇最常用。乙醇的溶解性能比较好，对天然产物细胞的穿透能力较强。亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多能在乙醇中溶解。难溶于水的亲脂性成分，在乙醇中的溶解度也较大。还可以根据被提取物质的性质，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取比用水量较少，提取时间短，溶解出的水溶性杂质也少。乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。由于这些原因，用乙醇提取的方法是历来最常用的方法之一。甲醇的性质和乙醇相似，沸点较低（64℃），但有毒性，使用时应注意。 　　3）亲脂性的有机溶剂：也就是一般所说的与水不能混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯乙烷等。这些溶剂的选择性能强，不能或不容易提出亲水性杂质。但这类溶剂挥发性大，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求较高，且它们透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。如果药材中含有较多的水分，用这类溶剂就很难浸出其有效成分，因此，大量提取天然产物原料时，直接应用这类溶剂有一定的局限性。 ? 　3．提取方法：用溶剂提取天然产物成分，、常用浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法及连续回流提取法等。同时，原料的粉碎度、提取时间、提取温度、设备条件等因素也都能影响提取效率，必须加以考虑。 ?　　1）浸渍法：浸渍法系将天然产物粉末或碎块装人适当的容器中，加入适宜的溶剂（如乙醇、稀醇或水），浸渍药材以溶出其中成分的方法。本法比较简单易行，但浸出率较差，且如用水为溶剂，其提取液易于发霉变质）须注意加入适当的防腐剂。 ?　　2）渗漉法：渗漉法是将天然产物粉末装在渗漉器中，不断添加新溶剂，使其渗透过药材，自上而下从渗漉器下部流出浸出液的一种浸出方法小当溶剂渗进药粉溶出成分比重加大而向下移动时，上层的溶液或稀浸液便置换其位置，造成良好的浓度差，使扩散能较好地进行，故浸出效果优于浸渍法。但应控制流速，在渗渡过程中随时自药面上补充新溶剂，使药材中有效成分充分浸出为止。或当渗滴液颜色极浅或渗涌液的体积相当于：原药材重的10倍时，便可认为基本上已提取完全。在大量生产中常将收集的稀渗淮液作为另一批新原料的溶剂之用。 　　3）煎煮法：煎煮法是我国最早使用的传统的浸出方法。所用容器一般为陶器、砂罐或铜制、搪瓷器皿，不宜用铁锅，以免药液变色。直火加热时最好时常搅拌，以免局部药材受热太高，容易焦糊。有蒸汽加热设备的药厂，多采用大反应锅、大铜锅、大木桶，或水泥砌的池子中通入蒸汽加热。还可将数个煎煮器通过管道互相连接，进行连续煎浸。 　　4）回流提取法：应用有机溶剂加热提取，需采用回流加热装置，以免溶剂挥发损失。小量操作时，可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。瓶内装药材约为容量的％～％，溶剂浸过药材表面约1～2cm。在水浴中加热回流，一般保持沸腾约：小时小放冷过滤，再在药渣中加溶剂，作第二、三次加热回流分别约半小时，或至基本提尽有效成分为止。此法提取效率较冷浸法高，大量生产中多采用连续提取法。 　　5）动连续提取法：应用挥发性有机溶剂提取天然产物有效成分，不论小型实验或大型生产，均以连续提取法为好，而且需用溶剂量较少，提取成分也较完全。实验室常用脂肪提取器或称索氏提取器。连续提取法，一般需数小时才能提取完全。提取成分受热时间较长，遇热不稳定易变化的成分不宜采用此法。 二 水蒸气蒸馏法： 水蒸气蒸馏法，适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的天然产物成分的提取。此类成分的沸点多在100℃以上，与水不相混溶或仅微溶，且在约100℃时存一定的蒸气压。当与水在一起加热时，其蒸气压和水的蒸气压总和为一个大气压时，液体就开始沸腾，水蒸气将挥发性物质一并带出。例如天然产物中的挥发油，某些小分子生物碱一麻黄碱、萧碱、槟榔碱，以及某些小分子的酚性物质。牡丹酚（paeonol）等，都可应用本法提取。有些挥发性成分在水中的溶解度稍大些，常将蒸馏液重新蒸馏，在最先蒸馏出的部分，分出挥发油层，或在蒸馏液水层经盐析法并用低沸点溶剂将成分提取出来。例如玫瑰油、原白头翁素（protoanemonin）等的制备多采用此法。 三 升华法： 固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。天然产物中有一些成分具有升华的性质，故可利用升华法直接自天然产物中提取出来。例如樟木中升华的樟脑（camphor），在《本草纲目》中已有详细的记载，为世界上最早应用升华法制取药材有效成分的记述。茶叶中的咖啡碱在178℃以上就能升华而不被分解。游离羟基蒽醌类成分，一些香豆素类，有机酸类成分，有些也具有升华的性质。例如七叶内酯及苯甲酸等。 升华法虽然简单易行，但天然产物炭化后，往往产生挥发性的焦油状物，粘附在升华物上，不易精制除去，其次，升华不完全，产率低，有时还伴随有分解现象。 四、影响提取效果的因素 溶剂提取的效果主要取决于选择合适的溶剂和提取方法。此外，原料的粉碎程度，提取温度，浓度差，提取时间，操作压力，原料与溶剂的相对运动等因素也不同程度地影响提取效果。 原料的粉碎程度： 原料经粉碎后粒度变小，表面能增加，浸出速度加快，但粉碎度过高，样品粉粒表面积过大，吸附作用增强，反而影响扩散速度，并不利于浸出，许多不溶性高分子物质微粒进入浸出液中，给过滤造成困难；样品过细在渗滤过程中易堵塞，在渗漉法浸提时，原料粒度过细造成溶剂流经原料层的空隙过小，造成溶剂流动阻力大，影响传质。一般而言粒度以20~60目为适。 浸出温度：温度增加可增大可溶性成分的溶解度、扩散系数。扩散速度加快有利于浸提，并且温度适当升高，可使原料中的蛋白质凝固、酶破坏而增加浸提液的稳定性，但温度过高，会破坏不赖热的成分，并且导致浸提液的品质劣变。提取的杂质含量增高，给后道精制工序带来困难，一般浸出温度控制在60~100℃。 浓度差：浓度差是原料组织内的浓度与外周溶液的浓度差异。浓度差越大，扩散推动力越大，越有利于提高浸出效率。当内外浓度达到平衡时，扩散停止，成分不再浸出。在浸出过程中不断搅拌或更换新溶剂或采取流动溶剂的渗漉法，可以增大扩散层中有效成分的浓度差，以提高浸提效果。 浸提时间：原料中的成分随提取时间延长，提取的得率增加，但时间过长，杂质成分溶解也随之增加，给后序提取精制造成困难，一般而言，热提1~3h，乙醇加热回流提取1~2h。 此外，对于一些组织坚实，浸出溶剂较难浸润时，往往施加一定的压力，增大压力虽对扩散速度没有影响，但在压力的作用下可使某些原料组织内细胞壁破坏，有利于有效成分的溶解。近年来，超生波、电磁场、电磁振动、脉冲技术等应用于浸提工艺中获得良好效果。 第二节 天然产物有效成分的分离与精制 （30分钟） (一) 根据物质溶解度差别进行分离 结晶、重结晶法 沉淀法（ 溶剂沉淀） 酸溶碱沉法 —— 提取生物碱 金属盐沉淀法 (二) 根据物质在两相溶剂中的分配系数不同进行分离（20分钟） 1、液—液萃取与分配系数 K值 2、分离难易与分离因子 β 3、分配比与PH对酸碱两性化合物的影响（以酸性成分为例） 4、逆流分溶法 （CCD ） 5、液－液萃取与PC 6、液－液分配柱色谱 7、液滴逆流色谱（DCCC）及高速逆流色谱（HSCCC） (三) 根据物质的吸附性差别进行分离 （90分钟） 附规律及极性强弱的判断 分离对象及分离方法 聚酰按吸附色普法 4、大孔树脂 根据物质分子量大小差别进行分离 (10分钟) 根据物质解离程度不同进行分离 （5分钟） 色谱分离法小结 （15分钟） 　?? 天然产物提取液或提取物仍然是混合物，需进一步除去杂质，分离并进行精制。具体的方法随各天然产物的性质不同而异，以后将通过实例加以叙述，此处只作一般原则性的讨论。 一、根据物质溶解度的差别进行分离 利用温度不同引起溶解度的改变以分离物质，如常见的结晶与重结晶等操作。 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出， 从而实现分离。 如在药材浓缩水提取液中加入数倍量的高浓度的乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水/醇法）；或在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/水法）；或在乙醇浓缩液中加入数倍量乙醚（醇/醚法）或丙酮（醇/丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等杂质则留在母液中等。 3、对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸或碱以调节溶液的pH值，改变分子存在的状态（游离型或离解型），从而改变溶解度而实现分离。 例如，一些生物碱类在用酸性水从药材中提出后，加碱调至碱性即可从水中沉淀析出（酸/碱法）。至于提取黄酮、蒽醌类酚酸性成分时采用的碱/酸法，以及调节至等电点使蛋白质沉淀的方法等也均属于这一类型。这种方法因简便易行，在工业生产中用得很广。 4、酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀剂使之生成水不溶性的盐类等沉淀析出。 例如酸性化合物可形成钙盐、钡盐、铅盐等，碱性化合物如生物碱等，则可形成苦味酸盐、苦酮酸盐等有机酸盐或磷钼酸盐、磷钨酸盐、雷氏盐等无机酸盐。得到的有机酸金属盐类（如铅盐）沉淀悬浮于水或含水的乙醇中，通入硫化氢气体进行复分解反应，使金属硫化物沉淀后，即可回收得到纯化的游离的有机酸类化合物。至于生物碱等碱性有机化合物的有机酸盐类则可以悬浮于水中，加入无机酸，使得有机酸游离后先用乙醚萃取除去，然后再进行碱化、有机溶剂萃取，回收有机溶剂即可得到纯化了的碱性有机化合物。 （二）根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 常见的方法有简单的液-液萃取法、反流分布法（Counter Current Distribution，CCD）、液滴逆流色谱法（DCCC）、高速逆流色谱（HSCCC）、气液分配色谱（GC或GLC）及液液分配色谱（LC或LLC）等。 以下就液液萃取的基本原理及方法作一简单概括。 1、液-液萃取与分配系数K值 将两种相互不能任意混合的溶剂（如氯仿与水）置分液漏斗中充分振荡，放置后即可分成两相。此时，如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定的温度及压力下为一常数，可用下式表示： K=CU/CL （2-1） K：表示分配系数；CU：表示溶质在上相溶剂中的浓度；CL：表示溶质在下相溶剂中的浓度。 假定A、B两种溶质用氯仿及水进行分配，如A、B的重量均为1.0g，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3/VH2O=1，则分液漏斗做一次振摇分配平衡后，约90%的溶质A将分配在上相溶剂（水）中，约10%的溶质A则分配到下相溶剂（氯仿）中。同理，KB=0.1=1/10，在振摇平衡后，则溶质B的分配将与A相反。留在水中的约为10%，约90%分配在氯仿中。这说明，在上述条件下，A、B两种溶质在氯仿及水中仅作一次分配就可实现 90% 的分离。 2. 分离难易与分离因子β 现在，我们可以用分离因子β值来表示分离的难易。分离因子β可定义为 A 、B 两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。 即： β=KA/KB( 注：KA >KB ) （2-2） 上例中，β=KA/KB=10/0.1=100。 就一般情况而言，β≧100，仅作一次简单萃取就可实现基本分离； 但100≧β≧10，则需萃取10~12 次，β≦2 时，要想实现基本分离，须作100次以上萃取才能完成；β≌1时，则KA≌KB，意味着两者性质极其相近，即使作任意次分配也无法实现分离。而实际分离工作中，我们总是希望选择分离因子β值大的溶剂系统，以求简化分离过程，提高分离效率。 3. 分配比与pH 对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统 pH 的影响。 因为pH变化可以改变它们的存在状态(游离型或离解型)，从而影响在溶剂系统中的分配比。以酸性物质 (HA) 为例，其在水中的离解平衡及离解常数K可用下式表示： HA+H2O A-+H3O+   Ka及pKa均可表示酸性物质的酸性强弱。若使该酸性物质完全离解，即使HA均转变成A-则：  使该酸性物质完全游离，即使A-均转变成HA， 则：  因为酚类化合物的pKa值一般为9.2~10.8，羧酸类化合物的pKa值约为5，故pH值为3以下，大部分酚酸性物质将以非离解形式（HA）存在，易分配于有机溶剂中；而pH12以上，则将以离解形式（A-）存在，易分配于水中。 同理，对于碱性物质（B）：  Ka为碱性物质（B）的共轭酸（BH+）的离解常数。 显然，碱性越强，则其共轭酸的Ka值越小，pka 值越大。与酸性物质相同，我们也可以由文献上给出的pka值求出各碱性物质呈游离型或离解型时的pH条件。 一般 pH<3时，酸性物质多呈非离解状态(HA)、碱性物质则呈离解状态 (BH+) 存在，但pH>12,则酸性物质呈离解状态(A-)、碱性物质则呈非离解状态(B)存在。据此,可采用图1-1所示在不同pH的缓冲溶液与有机溶剂中进行分配的方法,使酸性、碱性、中性及两性物质得以分离。 试样水溶液 pH3，有机溶剂提出 水相 有机相 pH12，有机溶剂提取 pH9，缓冲溶液提取（NaHCO3水溶液） 水 有机物 水相 有机相 糖类等极性 碱性物质 pH3，有机溶剂提取 pH13，缓冲溶液提取 中性物质 水相 有机相 水相 有机相 两性物质 酸性有机物（有机酸等） pH6有机溶剂提取 中性物质 水相 有机相 酸性物质（酚类等） 图2-1 利用pH值梯度萃取分离物质的模式图 4. 逆流分溶法(CCD) 液-液萃取分离中经常遇到的情况是分离因子β值较小, 故萃取及转移操作常须进行几十次乃至几百次。此时简单萃取已不能满足需要, 而要采用逆流分溶法( countercurrent distribution,简称CCD)。 CCD 法是一种多次、连续的液-液萃取分离过程。如图2-2所示，在多个分 液漏斗中装入固定相，在No.0 漏斗中溶入溶质并加入流动相溶剂。振摇使两相溶剂充分混合。静置分层后，分出流动相，令其移入 N0.1 管 , 再在 N0.0 管中补加新鲜流动相。再次振摇混 合 , 静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去 , 溶质即在两相溶剂相 对作逆流移动过程中 , 不断地重新分配并达到分离的目的。进行多次转移时,使用分液漏斗十分不便,而须采用Craig逆流分溶仪,该仪器为由上百个萃取单元组成的全自动连续液-液萃取装置。每个单元相当于一个分液漏斗。 图 2-3反映了振摇萃取(a)→静置分层(b) →两相分开(c)→ 转移(d)几个操作程序的连接过程。 流动相溶剂 （相对密度大）      固定像溶剂 （相对密度小） 0 1 2 3 n 图2-2 CCD法的分离过程示意图 CCD 法因为操作条件温和、试样容易回收,故特别适于中等极性、不稳定物质的分离。另外,溶质浓度越低,分离效果越好。但是,试样极性过大或过小,或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易采用此法分离。易于乳化的萃取溶剂系统也不宜采用。    a b c d 图2-3 逆流分溶仪萃取单元的工作过程 5、液液分配色谱柱 液-液分配柱色谱逆流分溶法分离物质在分液漏斗中或 Craig逆流分溶仪中进行时,前者手工操作,比较费时；后者因仪器自身的问题, 在振摇时容易引起破损及漏液,又因溶剂消耗量大,振摇过程中又易于乳化,故现在已很少应用,多改用其它装置。如将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂 (流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。 （1）正相色谱与反相色谱：液-液分配柱色谱用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。通常,分离水溶性或极性较大的成分如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物时,固定相多采用强极性溶剂,如水、缓冲溶液等,流动相则用氯仿、乙酸乙醋、丁醇等弱极性有机溶剂,称之为正相色谱；但当分离脂溶性化合物,如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等时,则两相可以颠倒,固定相可用石蜡油,而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂,故称之为反相分配色谱 (reverse phase partition chromatography)。 （2）加压液相柱色谱： 经典的液液分配柱色谱中用的载体（如硅胶）颗粒直径较大（100~150μm），流动相仅靠重力作用自上而下缓缓流过色谱柱，流出液用人工分段收集后在进行分析，因此柱效率低费时较长，近年来已逐渐被各种加压液相色谱所代替。加压液相色谱用的载体多为颗粒直径较小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，因而柱效率大大提高。 此外，在色谱柱出口处常常配以高灵敏度的检测器，以及自动描记、部分收集的装置，并用计算机进行色谱条件的设定 沉淀分离是在溶液中加入溶剂或沉淀剂，通过化学反应或改变溶液的pH值、温度、压力等条件，使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。能否将分离物从溶液中析出，取决于分离物的溶解度或溶度积，关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件，沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质，或是将已纯化的产品由液态变成固态。在运用沉淀分离技术时，需要考虑三种因素：（1）沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，才能使目标成分得到较好的分离，纯度较高。（2）对于一些活性物质（如酶、蛋白质等）的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏；（3）对食品和医药中的目标成分的沉淀分离，必须充分估量残留物对人体的危害。 根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀分离方法大致分以下几种。 溶剂沉淀 溶剂沉淀在有机化合物（如蛋白质、酶、多糖、核酸等）水溶液中加入有机溶剂（如乙醇、丙酮等）后，显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。其优点在于选择性好、分辨率高。因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀，溶剂易除去易回收，但条件控制不当容易使待分离物质（如蛋白质）变性。 影响溶剂沉淀的操作条件有以下几点。 溶剂的选择及其添加量 样品浓度的确定 温度的调节 pH质的调节 氨基酸可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）或双极性离子（dipolar ion）及负电和荷（anion）等三种，若在酸性溶液中带正电电荷，則在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的缘故，大部份蛋白质于等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子所帶净电荷必为同号，彼此之间有相斥力，不会凝结。所以，将pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质将会沉淀，这种现象可以应用于估算某蛋白质的等电点. 离子强度的调节 盐析沉淀 在较低浓度的盐溶液中，酶和蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增大，这称之为盐溶。当浓度增大至一定程度后，酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出，这称之为盐析。 盐析作用的实质，主要是高分子化合物与溶剂（水）间的相互作用被破坏，盐的加入使高分子化合物分子脱溶剂化。盐的加入还使一部分溶剂（水）与它们形成溶剂（水）化离子，致使这部分溶剂（水）失去溶解高分子化合物的性能。溶剂（水）被电解质夺去，高分子化合物沉淀析出。所以盐类的水化作用越强，其盐析作用也越强。 盐析效应的特点是，同价同符号的不同离子，对盐析效应的能力不一样。 　　已发现各种盐的盐析能力，其阴离子的能力有如下次序： 　　1/2SO42-＞OAc-＞CL-＞NO2-＞Br-＞I-＞SCN- 　　其阳离子则有如下次序： 　　Li+＞Na+＞K+＞NH4+＞1/2Mg2+ 盐析法是在天然产物的水提液中加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。例如三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸按盐析制备。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。 影响盐析效果的因素有离子类型、离子浓度、pH值、温度等。 沉淀剂沉淀 添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液 中沉淀析出的方法，称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离金属离子沉淀法，酸类及阴离子沉淀法，非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。 金属离子沉淀法 蛋白质在碱性溶液中带负电，金属离子与蛋白质中的-COOH、-OH、-NH2、 -SH等基团反应生成难溶性的复合盐而析出。 金属离子沉淀分离效果除与金属离子的种类、蛋白质的性质、离子化程度以及相互结合的位置等因素有关，沉淀的复合物的溶解度与溶液的介电常数相关，介电常数减小则溶解度降低。一般而言，金属离子的浓度调节在0.02mol/L左右。浓度过高，易引起共沉淀，并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、四级空间结构，引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除，可通入H2S形成硫化物去除或添加螯和剂EDTA。 金属离子沉淀法常有共沉淀现象和吸附作用，同时有一些金属盐的溶解度相对也比较大，因此分离效果受到影响，实践中一般用作初步分离，并且通常是与其他分离方法配合使用。 2、酸沉淀法 一些含氮的有机酸如苦酸、苦酮酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出，但这种盐复合物沉淀往往是属于不可逆反应，引起蛋白质发生变性，因此需要采取预防蛋白质变性的措施，如采用温和的反应条件，并加入一定量的稳定剂（如抗坏血酸等）。 许多无机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀，如磷钨酸、砷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷砷硼硅的钼酸或矾酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由乙酸萃取出来。 3、非离子型聚合物沉淀法 4、均相沉淀法 两相溶剂萃取法： 1．萃取法：两相溶剂提取又简称萃取法，是利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高、如果在水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取，如果有效成分是偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就需要改用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。还可以在氯仿、乙醚中加入适量乙醇或甲醇以增大其亲水性。提取黄酮类成分时，多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。不过，一般有机溶剂亲水性越大，与水作两相萃取的效果就越不好，因为能使较多的亲水性杂质伴随而出，对有效成分进一步精制影响很大。 　　两相溶剂萃取在操作中还要注意以下几点： 　　1）先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 　　2） 水提取液的浓度最好在比重1.1～1.2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。 　　3） 溶剂与水溶液应保持一定量的比例，第一次提取时，溶剂要多一些，一般为水提取液的1/3，以后的用量可以少一些，一般1/4-1/6。 4）一般萃取3～4次即可。但亲水性较大的成分不易转入有机溶剂层时，须增加萃取次数，或改变萃取溶剂。 　　 萃取法所用设备，如为小量萃取，可在分液漏斗中进行；如系中量萃取，可在较大的适当的下口瓶中进行。在工业生产中大量萃取，多在密闭萃取罐内进行，用搅拌机搅拌一定时间，使二液充分混合，再放置令其分层；有时将两相溶液喷雾混含，以增大萃取接触，提高萃取效率，也可采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 2．逆流连续萃取法：是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多的萃取管。管内用小瓷圈或小的不锈钢丝圈填充，以增加两相溶剂萃取时的接触面。例如用氯仿从川楝树皮的水浸液中萃取川楝素。将氯仿盛于萃取管内，而比重小于氯仿的水提取浓缩液贮于高位容器内，开启活塞，则水浸液在高位压力下流入萃取管，遇瓷圈撞击而分散成细粒，使与氯仿接触面增大，萃取就比较完全。如果一种天然产物的水浸液需要用比水轻的苯、乙酸乙酯等进行萃取，则需将水提浓缩液装在萃取管内，而苯、乙酸乙酯贮于高位容器内。萃取是否完全，可取样品用薄层层析、纸层析及显色反应或沉淀反应进行检查。 3．逆流分配法（CounterCurrentDistribution，CCD）：逆流分配法又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法。逆流分配法与两相溶剂逆流萃取法原理一致，但加样量一定，并不断在一定容量的两相溶剂中，经多次移位萃取分配而达到混合物的分离。本法所采用的逆流分布仪是由若干乃至数百只管子组成。若无此仪器，小量萃取时可用分液漏斗代替。预先选择对混合物分离效果较好，即分配系数差异大的两种不相混溶的溶剂。并参考分配层析的行为分析推断和选用溶剂系统，通过试验测知要经多少次的萃取移位而达到真正的分离。逆流分配法对于分离具有非常相似性质的混合物，往往可以取得良好的效果。但操作时间长，萃取管易因机械振荡而损坏，消耗溶剂亦多，应用上常受到一定限制。 4．液滴逆流分配法：液滴逆流分配法又称液滴逆流层析法。为近年来在逆流分配法基础上改进的两相溶剂萃取法。。对溶剂系统的选择基本同逆流分配法，但要求能在短时间内分离成两相，并可生成有效的液滴。由于移动相形成液滴，在细的分配萃取管中与固定相有效地接触、摩擦不断形成新的表面，促进溶质在两相溶剂中的分配，故其分离效果往往比逆流分配法好。且不会产生乳化现象，用氮气压驱动移动相，被分离物质不会因遇大气中氧气而氧化。本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小（1克以下），并要有一定设备。应用液滴逆流分配法曾有效地分离多种微量成分如柴胡皂甙原小檗碱型季铵碱等。液滴逆流分配法的装置，近年来虽不断在改进，但装置和操作较繁。目前，对适用于逆流分配法进行分离的成分，可采用两相溶剂逆流连续萃取装置或分配柱层析法进行。 5、超临界流体萃取技术 超临界流体萃取是以某一介质作为萃取剂，在其临界温度和临界压力之上的条件下，从液体或固体物料中萃取出待分离的组分的一种方法。 超临界流体具有的性质：一方面有和液体相近密度和溶解度，另一方面具有气体的优点：黏度小、扩散系数大，与其他气体的互溶性强等。 超临界流体萃取的特点 （二）超临界流体萃取的应用 三、分子蒸馏 分子蒸馏原理 　　分子蒸馏技术不同于一般蒸馏技术,它是一种利用不同物质分子运动自由程的差别,对含有不同物质的物料在液-液状态下进行分离的技术。它能使液体在远低于其沸点的温度下将其所含的不同物质分离 , 鉴于其在高真空下运行 ,且因其特殊的结构型式 ,因而它又具备蒸馏压强低、受热时间短、分离程度高等特点 ,能大大降低高沸点物料的分离成本 ,极好地保护热敏性物质的品质。从而能解决大量常规蒸馏技术所不能解决的问题。 　　为了实现分子蒸馏 ,各国研制了多种结构的分子蒸馏体系 ,主要表现三种类型： 一是降膜式,二是刮膜式,三是离心式。降膜式装置为早期形式,结构简单,但由于液膜厚,效率差,现在世界各国很少采用。刮膜式分子蒸馏装置,形成液膜薄,分离效率高,但较降膜式结构复杂。离心式分子蒸馏装置离心力成膜,膜薄,蒸发效率高。但结构复杂,制造及操作难度大。为了提高分离效率,往往需要采用多级串联使用。即离心薄膜式和转子刷膜式 ,前一种体系的处理量大 ,适用于工业 ;实验室用的多为刮 (刷 )膜蒸发器。不管何种形式的分子蒸馏 ,其原理都是相同的。 　　分子运动自由程 　　分子碰撞 : 分子与分子之间存在着相互作用力。当两分子离得较远时 ,分子之间的作用力表现为吸引力 ,但当两分子接近到一定程度后 ,分子之间的作用力会改变为排斥力 ,并随其接近程度 ,排斥力迅速增加。当两分子接近到一定程度 ,排斥力的作用使两分子分开 ,这种由接近而至排斥分离的过程就是分子的碰撞过程。 　　分子有效直径 :分子在碰撞过程中 ,两分子质心的最短距离 ,即发生斥离的质心距离。 　　分子运动自由程 :一个分子相邻两次分子碰撞任一分子在运动过程中都在变化自由程，而在一定的外界条件下 ,不同物质的分子其自由程各不相同。就某一种分子来说 ,在某时间间隔内自由程的平均值称为平均自由程。 　　根据分子运动理论 ,液体混合物的分子受热后运动会加剧 ,当分子获得足够能量时 ,就会从液面逸出而成为气相分子。随着液面上方气相分子的增加 ,有一部分气体就会返回液体。在外界条件保持恒定情况下 ,最终会达到分子运动的动态平衡 ,从宏观上看 ,液体系统达到了平衡。 　　分子蒸馏的基本原理是 : (1)分子蒸馏中要考虑的参数是分子运行的平均自由程 λｍ , 　　λｍ =Ｖｍ/ｆ 　　 　　式中 :Ｖｍ是分子的平均运动速度 ,ｆ是分子碰撞频率。 由热力学原理可知 , 　　ｆ=21/2Ｖｍπｄ2 ｐ/ＫＴ ,则得到λｍ为 : λｍ =ＫＴ/ 21/2πｄ2 ｐ 　　 　　式中 :ｄ是分子平均直径 ,ｐ是分子的环境压强 ,Ｔ是分子的环境温度 ,Ｋ是玻尔兹曼常数。 　　从公式可以看到 ,混合液中的不同组成分子的有效直径和分子自由程不同 ,轻分子的平均自由程大 ,而重分子的平均自由程小 ,如果冷凝面与蒸发面的间距小于轻分子的平均自由程 ,而大于重分子的平均自由程 ,这样轻分子被冷却收集而重分子又返回到蒸发面 ,从而实现了分离。这就是分子蒸馏的基本原理。 　　从公式中可知 ,λｍ与温度成正比 ,而与压强及分子直径成反比 ,所以设计时要考虑真空度越高越利于蒸发 ,而温度不能过高 ,以避免热分解。 另一个重要的因素是分子蒸馏利用液膜受热使分子扩散而不同于沸腾蒸发 ,液膜厚度不能太厚 ,一般在几十到几百微米 ,所以设计研制分子蒸馏的技术关键是真空度和液膜。 　　分子蒸馏技术的核心是分子蒸馏装置。液体混合物为达到分离的目的，首先进行加热 ,能量足够的分子逸出液面 ,轻分子的平均自由程大 ,重分子的平均自由程小 ,若在离液面小于轻分子的平均自由程而大于重分子平均自由程处设置一捕集器 ,使得轻分子不断被捕集 ,从而破坏了轻分子的动平衡而使混合液中的轻分子不断逸出 ,而重分子因达不到捕器很快趋于动态平衡 ,不再从混合液中逸出 ,这样 ,液体混合物便达到了分离的目的。分子蒸馏装置在结构设计中 ,必须充分考虑液面内的传质效率及加热面与捕集面的间距面内的传质效率及加热面与捕集面的间距。 分子蒸馏技术的核心是分子蒸馏装置。液体混合物为达到分离的目的，首先进行加热，能量足够的分子逸出液面，轻分子的平均自由程大，重分子的平均自由程小，若在离液面小于轻分子的平均自由程而大于重分子平均自由程处设置一捕集器，使得轻分子不断被捕集，从而破坏了轻分子的动平衡而使混合液中的轻分子不断逸出，而重分子因达不到捕集器很快趋于动态平衡，不再从混合液中逸出，这样，液体混合物便达到了分离的目的。分子蒸馏装置在结构设计中，必须充分考虑液面内的传质效率及加热面与捕集面的间距面内的传质效率及加热面与捕集面的间距  四、膜分离技术 五、界面力分离 六、色谱分离 一般是将上述总提取物，选用三、四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取分离。水浸膏或乙醇浸膏常常为胶伏物，难以均匀分散在低极性溶剂中，故不能提取完全，可拌人适量惰性填充剂，如硅藻土或纤维粉等，然后低温或自然干燥，粉碎后，再以选用溶剂依次提取，使总提取物中各组成成分，依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。例如粉防己乙醇浸膏，碱化后可利用乙醚溶出脂溶性生物碱，再以冷苯处理溶出粉防己碱，与其结构类似的防己诺林碱比前者少一甲基而有一酚羟基，不溶于冷苯而得以分离。利用天然产物化学成分，在不同极性溶剂中的溶解度进行分离纯化，是最常用的方法。 　　广而言之，自天然产物提取溶液中加入另一种溶剂，析出其中某种或某些成分，或析出其杂质，也是一种溶剂分离的方法。天然产物的水提液中常含有树胶、粘液质、蛋白质、糊化淀粉等，可以加入一定量的乙醇，使这些不溶于乙醇的成分自溶液中沉淀析出，而达到与其它成分分离的目的。例如自天然产物提取液中除去这些杂质，或自白及水提取液中获得白及胶，可采用加乙醇沉淀法；自新鲜括楼根汁中制取天花粉素，可滴人丙酮使分次沉淀析出。目前，提取多糖及多肽类化合物，多采用水溶解、浓缩、加乙醇或丙酮析出的办法。 　　此外，也可利用其某些成分能在酸或碱中溶解，又在加碱或加酸变更溶液的pH后，成不溶物而析出以达到分离。例如内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离；生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。一般天然产物总提取物用酸水、碱水先后处理，可以分为三部分：溶于酸水的为碱性成分（如生物碱），溶于碱水的为酸性成分（如有机酸），酸、碱均不溶的为中性成分（如甾醇）。还可利用不同酸、碱度进一步分离，如酸性化台物可以分为强酸性、弱酸性和酷热酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。有些总生物碱，如长春花生物碱、石蒜生物碱，可利用不同rH值进行分离。但有些特殊情况，如酚性生物碱紫董定碱（corydine）在氢氧化钠溶液中仍能为乙醚抽出，蝙蝠葛碱（dauricins）在乙醚溶液中能为氢氧化钠溶液抽出，而溶于氯仿溶液中则不能被氢氧化钠溶液抽出；有些生物碱的盐类，如四氢掌叶防己碱盐酸盐在水溶液中仍能为氯仿抽出。这些性质均有助于各化合物的分离纯化。 　　 　 五、透析法： ??? 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制：透析是否成功与透析膜的规格关系极大。透析膜的膜孔有大有小，要根据欲分离成分的具体情况而选择。透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。油常多用市售的玻璃纸或动物性半透膜扎成袋状，外面用尼龙网袋加以保护，小心加入欲透析的样品溶液，悬挂在清水容器中。经常更换清水使透析膜内外溶液的浓度差加大，必要时适当加热，并加以搅拌，以利透析速度加快。为了加快透析速度，还可应用电透析法，即在半在半透膜旁边纯溶剂两端 　　放置二个电极，接通电路，则透析膜中的带有正电荷的成分如无机阳离子、生物碱等向阴极移动，而带负电共荷的成分如无机阴离子、有机酸等则向阳极移动，中性化合物及高分子化合物则留在透析膜中。透析是否完全，须取透析膜内溶液进行定性反应检查。 　　一般透析膜可以自制：动物半透膜如猪、牛的膀胱膜、用水洗净，再以乙醚脱脂，，即可供用；羊皮纸膜可将滤纸浸入50％的硫酸15～60分钟，取出铺在板上，以水冲洗制得。其膜孔大小与硫酸浓度、浸泡时间以及用水冲洗速度有关；火棉胶膜系将火棉胶溶于乙醚及无水乙醇，涂在板上，干后放置水中即可供用，其膜孔大小与溶剂种类、溶剂挥发速度有关，溶剂中加入适量水可使膜孔增大，加入少量醋酸可使膜孔缩小；蛋白质胶（明胶）膜可用20％明胶涂于细布上，阴干后放水中，再加甲醛使膜凝固，冲洗干净即可供用。近来商品有透析膜管成品出售，国外习称“ViskingDialysisTubing”，有各种大小厚度规格，可供不同大小分子量的多糖、多肽透析时选用。 六、结晶、重结晶和分步结晶法： ??? 鉴定天然产物化学成分，研究其化学结构，必须首先将天然产物成分制备成单体纯品。在常温下，物质本身性质是液体的化台物，可分别用分馏法或层析法进行分离精制。一般他说，天然产物化学成分在常温下多半是固体的物质，都具有结晶他的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。研究天然产物化学成分时，一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化台物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定。如果鉴定的物质不是单体纯品，不但不能得出正确的结论，还会造成工作上的浪费。因此，求得结晶并制备成单体纯品，就成为鉴定天然产物成分、研究其分子结构重要的一步。 ?　　1．杂质的除去：天然产物经过提取分离所得到的成分，大多仍然含有杂质，或者是混合成分。有时即使有少量或微量杂质存在，也能阻碍或延缓结晶的形成。所以在制备结晶时，必须注意杂质的干扰，应力求尽可能除去。有时可选用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分。有时可用少量活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。有时可通过氧化铝，硅胶或硅藻土短柱处理后，再进行制备结晶。但应用吸附剂除去杂质时，要注意所需要的成分也可能被吸附而损失。此外，层析法更是分离制备单体纯品所常用的有效方法。 　　如果一再处理仍未能使近于纯品的成分结晶化，则可先制备其晶态的衍生物，再回收原物，可望得到结晶。例如游离生物碱可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酸化物，碳基化台物可制备成苯踪衍生物结晶。美登碱在原料中含量少，且反复分离精制难以得到结晶，但制备成3一滇丙基美登碱结晶后，再经水解除去澳丙基，美登碱就能制备成为结晶。 　　2．溶剂的选择；制备结晶，要注意选择合宜的溶剂和应用适量的溶剂。合宜的溶剂，最好是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙醋等。但有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶，而在某些溶剂中则易于形成结晶。例如葛根素、逆没食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素（emodin）在吡啶中易于结晶，萱草毒素（hemerocallin）在N，N一二甲基甲酞胺（DMF）中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。 　　3．结晶溶液的制备：制备结晶的溶液，需要成为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。 ?　　“新生态”的物质即新游离的物质或无定形的粉未状物质，远较晶体物质的溶解度大，易于形成过饱和溶液。一般经过精制的化合物，在蒸去溶剂抽松为无定形粉未时就是如此，有时只要加入少量溶剂，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1．5倍量的甲醇溶解，放置后很诀析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液碱化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。 ?　　制备结晶溶液，除选用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置。例如J一细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好的结晶。又如自虎杖中提取水溶性的虎杖甙时，在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性杂质，又可降低水的极性，促使虎杖俄的结晶化。自秦皮中提取七叶甙（秦皮甲素），也可运用这样的办法。 　　结晶过程中，一般是溶液浓度高，降温诀，析出结晶的速度也快些。但是其结晶的颗粒较小，杂质也可能多些。有时自溶液中析出的速度太快，超过化合物晶核的形成劝分子定向排列的速度，往往只能得到无定形粉未。有时溶液太浓，粘度大反而不易结晶化。如果溶液浓度适当，温度慢慢降低，有可能析出结晶较大而纯度较高的结晶。有的化合物其结晶的形成需要较长的时间，例如铃兰毒甙等，有时需放置数天或更长的时间。 　　4．制备结晶操作：制备结晶除应注意以上各点外，在放置过程中，最好先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。如果放置一段时间后没有结晶析出，可以加入极微量的种晶，即同种化合物结晶的微小颗粒。加种晶是诱导晶核形成常用而有效的手段。一般他说，结晶化过程是有高度选择性的，当加入同种分子或离子，结晶多会立即长大。而且溶液中如果是光学异构体的混合物，还可依种晶性质优先析出其同种光学异构体。没有种晶时，可用玻璃棒蘸过饱和溶液一滴，在空气中任溶剂挥散，再用以磨擦容器内壁溶液边缘处，以诱导结晶的形成。如仍无结晶析出，可打开瓶塞任溶液逐步挥散，慢慢析晶。或另选适当溶剂处理，或再精制一次，尽可能除尽杂质后进行结晶操作。 　　5．重结晶及分步结晶：在制备结晶时，最好在形成一批结晶后，立即倾出上层溶液，然后再放置以得到第二批结晶。晶态物质可以用溶剂溶解再次结晶精制。这种方法称为重结晶法。结晶经重结晶后所得各部分母液，再经处理又可分别得到第二批、第三批结晶。这种方法则称为分步结晶法或分级结晶法。晶态物质在一再结晶过程中，结晶的析出总是越来越快，纯度也越来越高。分步结晶法各部分所得结晶，其纯度往往有较大的差异，但常可获得一种以上的结晶成分，在未加检查前不要贸然混在一起。 　　6．结晶纯度的判定：化合物的结晶都有一定的结晶形状、色泽、熔点和熔距，一可以作为鉴定的初步依据。这是非结晶物质所没有的物理性质。化合物结晶的形状和熔点往往因所用溶剂不同而有差异。原托品碱在氯仿中形成棱往状结晶，熔点207℃；在丙酮中则形成半球状结晶，熔点203℃；在氯仿和丙酮混合溶剂中则形成以上两种晶形的结晶。又如N一氧化苦参碱，在无水丙酮中得到的结晶熔点208℃，在稀丙酮（含水）析出的结晶为77～80℃。所以文献中常在化合物的晶形、熔点之后注明所用溶剂。一般单体纯化合物结晶的熔距较窄，有时要求在0．5℃左右，如果熔距较长则表示化合物不纯。 　　但有些例外情况，特别是有些化合物的分解点不易看得清楚。也有的化合物熔点一致，熔距较窄，但不是单体。一些立体异构体和结构非常类似的混合物，常有这样的现象。还有些化合物具有双熔点的特性，即在某一温度已经全部融熔，当温度继续上升时又固化，再升温至一定温度又熔化或分解。如防己诺林碱在1760C时熔化，至200℃时又固化，再在2420C时分解。天然产物成分经过同一溶剂进行三次重结晶，其晶形及熔点一致，同时在薄层层析或纸层层析法经数种不同展开剂系统检定，也为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物。但应注意，有的化合物在一般层析条件下，虽然只呈现一个斑点，但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果砍，异高熊果甙极难用一般方法分离，经反复结晶后，在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成分，但测其熔点在115～125℃，熔距很长。经制备其甲醚后，再经纸层层析检定，可以出现两个斑点，异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。又如水菖蒲根茎挥发油中的α一细辛醚和β一细辛醚，在一般薄层上均为一个斑点，前者为结晶，熔点63℃，后者为液体沸点296℃，用硝酸银薄层或气相层忻很容易区分。有时个别化合物（如氨基酸）可能部分地与层析纸或薄层上的微量金属离子（如Cu）、酸或碱形成络合物、盐或分解而产生复斑。因此，判定结晶纯度时，要依据具体情况加以分析。此外，高压液谱、气相层析、紫外光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。 第三节 检测方法 第四节 毒理学安全性与功效评价