樊 庆 杰
qjfan@126.com
第一节 显微技术
? 显微镜是观察细胞的主要工具。
? 根据光源不同，可分为 光学显微镜 和 电子显微镜 两大
类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，
后者则以电子束为光源。
第
二
章
研
究
方
法
一、光学显微镜
? 普通光学显微镜
? 荧光显微镜
? 激光共聚焦扫描显微镜
? 暗视野显微镜
? 相差显微镜
NEXT
普通光学显微镜
? 普通生物显微镜由 3 部分构成，即：① 照明系统,包
括光源和聚光器；② 光学放大系统,由物镜和目镜组
成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和
物镜都由复杂的透镜组构成；③ 机械装置,用于固定
材料和观察。
? 显微镜物象是否清楚不仅决定于 放大倍数,还与显微
镜的分辨力（ resolution） 有关。 分辨力 是指显微镜
（或人的眼睛距目标 25cm 处）能分辨物体最小间隔的
能力。
荧光显微镜
? 细胞中有些物质，如叶绿素
等，受紫外线照射后可发荧
光；另有一些物质本身虽不
能发荧光，但如果 用荧光染
料或荧光抗体染色后,经紫
外线照射亦可发荧光，荧光
显微镜就是对这类物质进行
定性和定量研究的工具之一。
激光共聚焦扫描显微镜
? 激光共聚焦扫描显微镜用激
光作扫描光源，逐点、逐行、
逐面快速扫描成像。
? 统经一次调焦，扫描限制在
样品的一个平面内。调焦深
度不一样时，能显示细胞样
品的立体结构。
暗视野显微镜
? 暗视野显微镜（ dark field microscope） 的聚光镜中央有
挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本
反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，
物体的边缘是亮的。
? 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子，分辨
率可比普通显微镜高 50 倍。
相差显微镜
? 相差显微镜（ phasecontrast microscope） 由 P,Zernike
于 1932年发明，并因此获 1953 年诺贝尔物理奖。
? 这种显微镜最大的特点是 可以观察未经染色的标本和
活细胞。
二、电子显微镜
? 透射电子显微镜
? 在光学显微镜下无法看清小于 0.2μm 的细微结构，这
些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结
构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分
辨率。
? 1932 年 Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微
镜（ transmission electron microscope,TEM）。 目前
TEM 的分辨力可达 0.2nm。
二、电子显微镜
? 扫描电子显微镜
? 在光学显微镜下扫描电子显微镜（ scanning electron
microscope,SEM） 于 20 世纪 60 年代问世，用来观察
标本的表面结构。
? 其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品
表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本
的表面结构。
三、显微操作技术
? 显微操作技术（ micromanipulation technique） 是指在
高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期
胚胎操作的一种方法。
? 显微操作器 是用以控制显微注射针在显微镜视野内移
动的机械装置。
? 显微操作技术包括 细胞核移植, 显微注射, 嵌合体技
术, 胚胎移植 以及 显微切割 等。
第二节 生物化学与分子生物学技术
一、细胞化学技术
? 组织化学或细胞化学染色 是利用染色剂可同细胞的某
种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性
或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分
几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、
脂类、核酸、酶等。
第
二
章
研
究
方
法
二、显微光谱分析技术
? 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白
质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
? 例如，核酸的吸收波长为 260nm,而蛋白质的则为
280nm。 有的成分经组织化学染色后，对可见光有特
定的吸收光谱。
? 根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显 微分光光
度计 对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。
三、放射自显影技术
? 放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和
细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机
理、作用部位等等。
? 其原理是将 放射性同位素 （如 14C 和 3H） 标记的化合
物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片
或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，
组织中的放射性即可使乳胶感光。
第三节 细胞分离技术
一、离心技术
? 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和
微体，以及各种大分子基本手段。
? 一般认为，转速为 10~25Kr/min 的离心机称为高速离心
机；转速超过 25Kr/min,离心力大于 89Kg者称为超速
离心机。
第
二
章
研
究
方
法
（一）、差速离心
? 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分
离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉
降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶
体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。
（二）、密度梯度离心
? 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度
梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重
力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
? 这类分离又可分为 速度沉降 和 等密度沉降平衡 两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
? 速度沉降 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或
细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的
最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
? 等密度沉降 适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞
器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间
则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在
那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。
二、细胞电泳
? 在一定 PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能
在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞
电泳（ cell electrophoresis）。
? 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有
所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒
定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，
因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的 ξ 电位。
第四节 细胞培养与细胞融合
一、细胞培养
? 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研
究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困
难的。但是如果把活细胞拿到体外培养进行观察和研
究，则要方便得多。
? 所以 细胞培养技术 （ cell culture） 就是选用最佳生存条
件对活细胞进行培养和研究的技术。
第
二
章
研
究
方
法
二、细胞融合
? 通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核
或多核细胞的过程称为 细胞融合 （ cell fusion） 或
细胞杂交 （ cell hybridization）。
Now,Have a rest!
同学们，再见！
qjfan@126.com
第一节 显微技术
? 显微镜是观察细胞的主要工具。
? 根据光源不同，可分为 光学显微镜 和 电子显微镜 两大
类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，
后者则以电子束为光源。
第
二
章
研
究
方
法
一、光学显微镜
? 普通光学显微镜
? 荧光显微镜
? 激光共聚焦扫描显微镜
? 暗视野显微镜
? 相差显微镜
NEXT
普通光学显微镜
? 普通生物显微镜由 3 部分构成，即：① 照明系统,包
括光源和聚光器；② 光学放大系统,由物镜和目镜组
成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和
物镜都由复杂的透镜组构成；③ 机械装置,用于固定
材料和观察。
? 显微镜物象是否清楚不仅决定于 放大倍数,还与显微
镜的分辨力（ resolution） 有关。 分辨力 是指显微镜
（或人的眼睛距目标 25cm 处）能分辨物体最小间隔的
能力。
荧光显微镜
? 细胞中有些物质，如叶绿素
等，受紫外线照射后可发荧
光；另有一些物质本身虽不
能发荧光，但如果 用荧光染
料或荧光抗体染色后,经紫
外线照射亦可发荧光，荧光
显微镜就是对这类物质进行
定性和定量研究的工具之一。
激光共聚焦扫描显微镜
? 激光共聚焦扫描显微镜用激
光作扫描光源，逐点、逐行、
逐面快速扫描成像。
? 统经一次调焦，扫描限制在
样品的一个平面内。调焦深
度不一样时，能显示细胞样
品的立体结构。
暗视野显微镜
? 暗视野显微镜（ dark field microscope） 的聚光镜中央有
挡光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本
反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，
物体的边缘是亮的。
? 利用这种显微镜能见到小至 4~200nm 的微粒子，分辨
率可比普通显微镜高 50 倍。
相差显微镜
? 相差显微镜（ phasecontrast microscope） 由 P,Zernike
于 1932年发明，并因此获 1953 年诺贝尔物理奖。
? 这种显微镜最大的特点是 可以观察未经染色的标本和
活细胞。
二、电子显微镜
? 透射电子显微镜
? 在光学显微镜下无法看清小于 0.2μm 的细微结构，这
些结构称为亚显微结构或超微结构。要想看清这些结
构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分
辨率。
? 1932 年 Ruska 发明了以电子束为光源的透射电子显微
镜（ transmission electron microscope,TEM）。 目前
TEM 的分辨力可达 0.2nm。
二、电子显微镜
? 扫描电子显微镜
? 在光学显微镜下扫描电子显微镜（ scanning electron
microscope,SEM） 于 20 世纪 60 年代问世，用来观察
标本的表面结构。
? 其工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品
表面激发出次级电子，图像为立体形象，反映了标本
的表面结构。
三、显微操作技术
? 显微操作技术（ micromanipulation technique） 是指在
高倍复式显微镜下，利用显微操作器进行细胞或早期
胚胎操作的一种方法。
? 显微操作器 是用以控制显微注射针在显微镜视野内移
动的机械装置。
? 显微操作技术包括 细胞核移植, 显微注射, 嵌合体技
术, 胚胎移植 以及 显微切割 等。
第二节 生物化学与分子生物学技术
一、细胞化学技术
? 组织化学或细胞化学染色 是利用染色剂可同细胞的某
种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性
或定位研究的技术。利用这种方法对细胞的各种成分
几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、
脂类、核酸、酶等。
第
二
章
研
究
方
法
二、显微光谱分析技术
? 细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白
质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。
? 例如，核酸的吸收波长为 260nm,而蛋白质的则为
280nm。 有的成分经组织化学染色后，对可见光有特
定的吸收光谱。
? 根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显 微分光光
度计 对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。
三、放射自显影技术
? 放射自显影技术用于研究标记化合物在机体、组织和
细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机
理、作用部位等等。
? 其原理是将 放射性同位素 （如 14C 和 3H） 标记的化合
物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片
或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，
组织中的放射性即可使乳胶感光。
第三节 细胞分离技术
一、离心技术
? 离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和
微体，以及各种大分子基本手段。
? 一般认为，转速为 10~25Kr/min 的离心机称为高速离心
机；转速超过 25Kr/min,离心力大于 89Kg者称为超速
离心机。
第
二
章
研
究
方
法
（一）、差速离心
? 在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分
离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉
降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶
体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。
（二）、密度梯度离心
? 用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度
梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重
力或离心力场的作用使细胞分层、分离。
? 这类分离又可分为 速度沉降 和 等密度沉降平衡 两种。
密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
? 速度沉降 主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或
细胞器。这种降方法所采用的介质密度较低，介质的
最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。
? 等密度沉降 适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞
器在连续梯度的介质中经足够大离心力和是够长时间
则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在
那里达到平衡，从而将不同密度的细胞或细胞器分离。
二、细胞电泳
? 在一定 PH 值下细胞表面带有净的正或负电荷，能
在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞
电泳（ cell electrophoresis）。
? 各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有
所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。在恒
定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，
因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的 ξ 电位。
第四节 细胞培养与细胞融合
一、细胞培养
? 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研
究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困
难的。但是如果把活细胞拿到体外培养进行观察和研
究，则要方便得多。
? 所以 细胞培养技术 （ cell culture） 就是选用最佳生存条
件对活细胞进行培养和研究的技术。
第
二
章
研
究
方
法
二、细胞融合
? 通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核
或多核细胞的过程称为 细胞融合 （ cell fusion） 或
细胞杂交 （ cell hybridization）。
Now,Have a rest!
同学们，再见！
