〔Ⅰ〕 理论部分 1. 绪论 欢迎同学们到生物化学实验室来！对于大多数学生来说，这不是第一次做化学实验，但是我们相信，生物化学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的、在生物化学的科学研究中最常用的实验方法。同学们在生物化学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。 当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出“克”数量级的产物。同学们将进行的是“毫克”和“微克”数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的生物化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到“眼睛”的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。 同学们通过生物化学实验应该做到：①学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。②训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。③学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。④掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。 预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！ 1.1 生物化学实验技术发展简史 生物科学在20世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。 20年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相对离心力的超离心机(相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”)，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。 30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。 40年代： 层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。 “电泳技术”是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。 60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。 1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。 此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。 70年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。 1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。 1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。 1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。 除上述历史以外，还可以列出许多生物化学发展史上的重要成就，例如： 美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。 美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。 英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。 英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。 1959年，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。 美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。 法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。 1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40～70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。 由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。 1.2 实验室规则 ⑴ 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。 ⑵ 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。 ⑶ 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。 ⑷ 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。 ⑸ 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。 ⑹ 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。 ⑺ 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。 ⑻ 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和ＨＰＬＣ等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。 ⑼ 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。 ⑽ 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。 ⑾ 每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。 ⑿ 每位学生要熟悉实验室内电闸的位置，烘箱和电炉用毕必须立即断电，不得过夜使用， 要严格遵守实验室安全用电规则和其他安全规则。 ⒀ 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。 1.3 实验室安全及防护知识 在生化实验室中可以说是“五毒”俱全，即着火、爆炸、中毒、触电、和割伤的危险均时刻存在。因此每一位在生化实验室工作的人员都必须有充分的安全意识，严格的防范措施和丰富实用的防护救治知识，一旦发生意外能正确地进行处置，以防事故进一步扩大。 1.3.1 着火 生化实验室经常使用大量的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而实验室又经常使用电炉、酒精灯等火源，因此极易发生着火事故。常用有机溶剂的易燃性列表如下： 表1—1 常见有机液体的易燃性 名 称 沸 点/℃ 闪 点※/℃ 自燃点※※/℃ 乙 醚 34.5 －40 180 丙 酮 56 －17 538 二硫化碳 46 －30 100 苯 80 －11 乙醇（95％） 78 12 400 ※ 闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。 ※※ 自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。 由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。 预防火灾必须严格遵守以下操作规程： ⑴严禁在开口容器和密闭体系中用明火加热有机溶剂，只能使用加热套或水浴加热。 ⑵废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道。 ⑶不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。 ⑷在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。 灭火方法： 实验室中一旦发生火灾切不可惊慌失措，要保持镇静，根据具体情况正确地进行灭火或立即报火警（火警电话119）。 ⑴容器中的易燃物着火时，用灭火毯盖灭。因己确证石棉有致癌性，故改用玻璃纤维布作灭火毯。 ⑵乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。 ⑶导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用1211灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。 ⑷个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。 1.3.2 爆炸 生物化学实验室防止爆炸事故是极为重要的，因为一旦爆炸其毁坏力极大，后果将十分严重。生物化学实验室常用的易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限（体积％）见 表1—2。 加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物～氧化铜、 浓硫酸～高锰酸钾、 三氯甲烷～丙酮等。 常见的引起爆炸事故的原因有：①随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。 ②在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。 ③在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器 ，或反应过于激烈而失去控制。 ④易燃易爆气体大量逸入室内。 ⑤高压气瓶减压伐摔坏或失灵。 表1—2 易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限 名 称 爆炸极限（体积百分数） 名 称 爆炸极限（体积百分数） 乙醚 1.9～36.5 丙酮 2.6～13 甲醇 6.7～36.5 乙醇 3.3～19 氢气 4.1～74.2 乙炔 3.0～82 1.3.3 中毒 生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴乙锭等。 剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈 、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。 中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。 中毒的预防： ①保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行。 ②取用毒品时必须配戴橡皮手套。 ③严禁用咀吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋。 ④不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。 中毒急救的方法主要有：①误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服Mg(OH)2乳剂，最后饮些牛奶。②吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法。③ 砷和汞中毒者应立即送医院急救。 1.3.4 外伤 ⑴ 化学灼伤： ①眼睛灼伤或掉进异物：眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗十五分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。若有玻璃碎片进入眼内则十分危险，必须十分小心谨慎，不可自取，不可转动眼球，可任其流泪，若碎片不出，则用纱布轻轻包住眼睛急送医院处理。若有木屑、尘粒等异物进入，可由他人翻开眼睑，用消毒棉签轻轻取出或任其流泪，待异物排出后再滴几滴鱼肝油。 ②皮肤灼伤： (a)酸灼伤：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。 (b)碱灼伤：先用大量水冲洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。 (c)溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用20％硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。 ⑵烫伤：使用火焰、蒸汽、红热的玻璃和金属时易发生烫伤，应立即用大量水冲洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上纱布后就医，轻度烫伤可涂抹鱼肝油和烫伤膏等。 ⑶割伤： 这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，切不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，就医时务必检查伤部神经是否被切断。 实验室应准备一个完备的小药箱，专供急救时使用。药箱内备有：医用酒精、红药水、紫药水、止血粉、创口贴、烫伤油膏（或万花油）、鱼肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氢钠溶液、20％硫代硫酸钠溶液、医用镊子和剪刀、纱布、药棉、棉签、绷带等。 1.3.5 触电： 生物化学实验室要使用大量的仪器、烘箱和电炉等，因此每位实验人员都必须能熟练地安全用电，避免发生一切用电事故，当50HZ的电流通过人体25mA电流时呼吸会发生困难，通过了100mA以上电流时则会致死。 ⑴防止触电：①不能用湿手接触电器。②电源裸露部分都应绝缘。③坏的接头、插头、插座和不良导线应及时更换。④先接好线路再插接电源，反之先关电源再拆线路。⑤仪器使用前要先检查外壳是否带电。⑥如遇有人触电要先切断电源再救人。 ⑵防止电器着火：①保险丝、电源线的截面积、插头和插座都要与使用的额定电流相匹配。②三条相线要平均用电。③生锈的电器、接触不良的导线接头要及时处理。 ④电炉、烘箱等电热设备不可过夜使用。⑤仪器长时间不用要拔下插头，并及时拉闸。⑥电器、电线着火不可用泡沫灭火器灭火。 1.4 实验记录与实验报告 1.4.1 实验记录 详细、准确、如实地作好实验记录是极为重要的，记录如果有误，会使整个实验失败，这也是培养学生实验能力和严谨的科学作风的一个重要方面。 ⑴ 每位同学必须准备一个实验记录本，实验前认真预习实验，看懂实验原理和操作方法，在记录本上写好实验预习报告， 包括详细的实验操作步骤(可以用流程图表示)和数据记录表格等。 ⑵ 记录本上要编好页数，不得撕缺和涂改，写错时可以划去重写。不得用铅笔记录，只能用钢笔和园珠笔。记录本的左页作计算和草稿用，右页用作预习报告和实验记录。同组的两位同学合做同一实验时，两人必须都有相同、完整的记录。 ⑶ 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据，条理清楚，字迹端正，切不可了草以致日后无法辨认。实验记录必须公正客观，不可夹杂主观因素。 ⑷ 实验中要记录的各种数据，都应事先在记录本上设计好各种记录格式和表格，以免实验中由于忙乱而遗漏测量和记录，造成不可挽回的损失。 ⑸ 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。 ⑹ 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其重量等；试剂的规格、化学式、分子量、试剂的浓度等，都应记录清楚。二人一组的实验，必须每人都作记录。 1.4.2 实验报告 实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对有关生物化学与分子生物学原理和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。实验报告的格式应为： ⑴ 实验目的；⑵ 实验原理；⑶ 仪器和试剂；⑷ 实验步骤；⑸ 数据处理；⑹ 结果讨论。 每个实验报告都要按照上述要求来写，实验报告的写作水平也是衡量学生实验成绩的一个重要方面。实验报告必须独立完成，严禁抄袭。写实验报告要用实验报告专用纸，以便教师批阅，不要用练习本和其他片页纸。 为了使实验结果能够重复，必须详细记录实验现象的所有细节，例如，若实验中生成沉淀，那麽沉淀的真实颜色是什麽，是白色、淡黄色或是其他？沉淀的量是多还是少，是胶状还是颗粒状？什麽时候形成沉淀，立即生成还是缓慢生成，热时生成还是冷却时生成？在科学研究中，仔细地观察，特别注意那些未予想到的实验现象是十分重要的，这些观察常常引起意外的发现，报告并注意分析实验中的真实发现，对学生将是非常重要的科学研究训练。 实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键，各种实验数据都要尽可能整理成表格并作图表示之，以便比较，一目了然。实验作图尤其要严格要求，必须使用坐标纸，每个图都要有明显的标题，坐标轴的名称要清楚完整，要注明合适的单位，坐标轴的分度数字要与有效数字相符，并尽可能简明，若数字太大，可以化简，并在坐标轴的单位上乘以10的方次。实验点要使用专门设计的符号，如：○、●、□、■、△、▲等，符号的大小要与实验数据的误差相符。不要用“×、＋”和“·”小园点。有时也可用两端有小横线的垂直线段来表示实验点，其线段的长度与实验误差相符。通常横轴是自变量，往往知道的很准确，纵轴是应变量，是测量的数据。曲线要用曲线板或曲线尺画成光滑连续的曲线，各实验点均匀分布在曲线上和曲线两边，且曲线不可超越最后一个实验点。两条以上的曲线和符号应有说明。 实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。 1.5 实验室基本操作 1.5.1 玻璃仪器的清洗 实验中所用的玻璃仪器清洁与否，直接影响实验的结果，往往由於仪器的不清洁或被污染而造成较大的实验误差，有时甚至会导致实验的失败。 做生物化学实验对玻璃仪器清洁程度的要求，比一般化学实验的要求更高。这是因为：①生物化学实验中蛋白质、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”计的，稍有杂质，影响就很大。②生物化学实验对许多常见的污染杂质十分敏感，如金属离子（钙、镁离子等）、去污剂和有机物残基等，因此玻璃仪器（包括离心管等塑料器皿）是否彻底清洗净就是非常重要的。 ⑴ 初用玻璃仪器的清洗 新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。 ⑵ 使用过的玻璃仪器的清洗 先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。 ⑶ 石英和玻璃比色皿的清洗 决不可用强碱清洗，因为强碱会浸蚀抛光的比色皿。只能用洗液或1％ ～2％的去污剂浸泡，然后用自来水冲洗，这时使用一支绸布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果会更好，清洗干净的比色皿也应内外壁不挂水珠。 1.5.2 塑料器皿的清洗 聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用10—3 mol/L EDTA 除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5％的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。 1.5.3 洗液的配制 因己确定铬有致癌作用，因此配制和使用洗液时要极为小心，常用两种配制方法如下： ⑴ 取100mL 工业浓硫酸置于烧杯内，小心加热，然后慢慢加入5g重铬酸钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解并缓慢冷却后，贮存在磨口玻璃塞的细口瓶内。 ⑵ 称取5g重铬酸钾粉末，置于250mL 烧杯中，加5mL 水使其溶解，然后慢慢加入100mL 浓硫酸，溶液温度将达80℃，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。 1.5.4 其他洗涤液 ⑴ 工业浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀。 ⑵ 5％草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾的痕迹。 ⑶ 5％～10％磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）溶液：可洗涤油污物。 ⑷ 30％硝酸溶液：洗涤二氧化碳测定仪及微量滴管。 ⑸ 5％～10％乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁的白色沉淀物。 ⑹ 尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样的容器。 ⑺ 有机溶剂：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脱油漆的污垢。 ⑻ 氢氧化钾的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：这是两种强碱性的洗涤液，对玻璃仪器的侵蚀性很强，可清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。 1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥： 生化实验中用到的玻璃和塑料器皿经常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干机在110℃～120℃进行干燥，而不要用丙酮荡洗再吹干的方法来干燥，因为那样会有残留的有机物覆盖在器皿的内表面，从而干扰生物化学反应。硝酸纤维素的塑料离心管加热时会发生爆炸，所以决不能放在烘箱中干燥，只能用冷风吹干。 1.5.6 移液 准确的分析方法对于生物化学实验是极为重要的，在各种生物化学分析技术中，首先要熟练掌握的就是准确的移液技术。为此要用到各种形式的移液管，其中有一些是学生们在化学实验中未用过而在生化实验中是常用的。下图列出了一些生化实验中常用的移液器具。 ⑴ 滴管（图1 中(E)） 使用方便，可用于半定量移液，其移液量为1mL—5mL，常用2mL，可换不同大小的滴头（图1 中(A)）。滴管有长、短两种，新出一种带刻度和缓冲泡的滴管，可以比普通滴管更准确地移液，并防止液体吸入滴头。 ⑵ 移液管（吸管） 吸管使用前应洗至内壁不挂水珠，1mL 以上的吸管，用吸管专用刷刷洗，0.1mL、0.2mL和0.5mL 的吸管可用洗涤剂浸泡，必要时可以用超声清洗器清洗。由于铬酸洗液致癌，应尽量避免使用。若有大量成批的吸管洗后冲洗，可使用冲洗桶，将吸管尖端向上置于桶内，用自来水多次冲洗后再用蒸馏水或无离子水冲洗。 吸管分为两种，一种是无分度的，称为胖肚吸管（图1 中(F)），精确度较高，其相对误差A级为0.7％ ~ 0.8％，B级为1.5％ ~ 0.16％，液体自标线流至口端（留有残液），A级等待15s，B级等待3s。 另一种吸管为分度吸管（图1 中(G)），管身为一粗细均匀的玻璃管，上面均匀刻有表示容积的分度线，其准确度低于胖肚吸管，相对误差A级为0.8％ ~ 0.2％，B级为1.6％—0.4％，A级、B级在吸管管身上有A、B字样，有“快”字则为快流式，有“吹”字则为吹出式，无“吹”字的吸管不可将管尖的残留液吹出。吸、放溶液前要用吸水纸擦拭管尖。 图1 生化实验中常用的移液器具 图1 (H)为血清吸管，其刻度一直刻到管端出口处，由于没有管尖，不会残留液体，但需在液体流完后仃留15～20秒，常用于吸取血清等粘度大的液体。 图1 (I)是微量λ吸管，用于1～500(l （1λ= 1(l）的移液，用吸水纸蘸出多吸的液体。 图1 (J)是毛细微量吸管，用于1～20(l的移液，常用于薄层层析和纸层析。 吸管吸取溶液最常用的是洗耳球（图1 中(B)）。此外，为便于移液，还可以使用新式的吸液球（图1 中(C)），球上有A、B、C三个玻璃珠阀门，吸液之前，先用拇指和食指按捏A阀，用其他手指挤压球体，由A阀排气，使球内形成负压，插入吸管吸液时，用拇指和食指按捏B阀，将溶液吸至所需刻度，放液时按捏C阀，直至溶液流尽，若需吹出管尖残液时，可在按捏C阀的同时，用中指挤压C阀前面的小球泡，即可吹出管尖残液。 还有一种“吸管泵”（图1 中(D)）使用更为方便，插入吸管后，用拇指转动上部的小轮，即可使园柱形泵内的柱塞上下移动，将溶液吸入或排出吸管，尤其是在移取10mL 以上的溶液时，用“吸管泵”最为方便。 ⑶ 微量进样器 微量进样器常用作气相和液相色谱仪的进样器，在生化实验中主要是用作电泳实验的加样器，通常可分为无存液和有存液两种。 1) 0.5(L ～5(L无存液微量进样器： 进样器的不锈钢芯子直接通到针尖端处，不会出现存液，所以可用于5(L以下的极微量液体进样。 2) 10(L～100(L有存液微量进样器： 不锈钢的针尖管部分是空管，进样器的柱塞不能到达，因而管内会存有空气或液体，其使用注意事项是：① 不可吸取浓碱溶液，以免腐蚀玻璃和不锈钢零件。 ② 因为有存液，所以吸液时要来回多拉几次，将针尖管内的气泡全部排尽。 ③ 针尖管内孔极小，使用后，尤其是吸取过蛋白质溶液后，必须立即清洗针尖管，防止堵塞。若遇针尖管堵塞，不可用火烧，只能用φ0.1mm的不锈钢丝耐心串通。 ④ 进样器未润湿时不可来回干拉芯子，以免磨损而漏气。 ⑤ 若进样器内发黑，有不锈钢氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，来回拉几次即可除之。 ⑷ 自动取液器 这种取液器在生化实验中大量地使用，它们主要用于多次重复的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的准确度（即容量误差）为 ±(0.5％～1.5％)，移液的精密度（即重复性误差）更小些，为 ≤0.5％。 取液器可分为二种：一种是固定容量的，常用的有100(l 、200(L和1000(L等几种；另一种是可调容量的取液器，常用的有200(L、1000(L和5000(L等多种规格。每种取液器都有其专用的聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性使用，当然也可以超声清洗后重复使用，而且此种吸头还可以进行120℃高压灭菌。 可调式自动取液器的操作方法是用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮，使数字窗口出现所需容量体积的数字，在取液器下端插上一个塑料吸头，并旋紧以保证气密，然后四指并拢握住取液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮，向下按到第一停点，将取液器的吸头插入待取的溶液中，缓慢松开按钮，吸上液体，并停留1～2秒钟（粘性大的溶液可加长停留时间），将吸头沿器壁滑出容器，用吸水纸擦去吸头表面可能附着的液体，排液时吸头接触倾斜的器壁，先将按钮按到第一停点，停留一秒钟（粘性大的液体要加长停留时间），再按压到第二停点，吹出吸头尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸头，可按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。 自动取液器的使用注意事项是： ① 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 ② 为获得较高的精度，吸头需予先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。③ 浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。④ 可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g。 图2 自动取液器示意图 1.6 缓冲溶液与pH测定 缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。 缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值： 表1—3 人体体液pH 体 液  pH  体 液 pH   血 清  7.35～7.45  大肠液 8.3～8.4   成人胃液  0.9～1.5  泪 6.6～6.9   唾 液  6.3～7.1  尿 4.8～7.5   胰 液  7.5～8.0  脑脊液 7.35～7.45  1.6.1 基本概念 ⑴ Br(nsted-Lowry酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923年由丹麦化学家J.N.Br(nsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Br(nsted-Lowry酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl—等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 A—H ＋ B— A ＋ B—H 酸1 碱2 碱1 酸2 酸1 是 碱1的共轭酸， 碱2 是 酸2 的共轭碱。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl— ＋ H+ HCl是酸，Cl—是它的共轭碱。 ⑵ 缓冲体系的设计： 强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其盐溶于水时，只有部分HA解离为 H+ 和 A—离子，其平衡方程式如下： K1 HA A— ＋ H+ (1-1) K2 [H+][A—] Ka＝ [HA] [HA] 所以 [H+]＝ Ka (1-2) [A—] [A—] (1-2)式两边取负对数： －lg[H+]＝－lg Ka＋lg (1-3) [HA] (1-3)式中： [HA] — 为弱酸的浓度 [H+] — 为HA解离出的氢离子浓度 [A—] — 为HA的共轭碱的离子浓度 K1 — 为酸解离的速度常数 K2 — 为A—与H+ 缔合的速度常数 Ka — 为反应方程(1-1)达平衡时HA的解离平衡常数 现将HA的pKa 定义为 －lg Ka，将HA溶液的pH定义为 －log[H+]， [A—] 所以，(1-3)式可写为 ：pH＝pKa＋lg (1-4) [HA] [离解形式] 或 pH = pKa + lg [未离解形式] 方程(1-4)称为：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程对于生物化学学科，在理论与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液pH与溶质中可解离基团pKa之间的关系。很明显，当[A—]＝[HA]时： lg[A—]／[HA]＝0 所以 pH ＝ pKa 这就意味着当[HA]有一半解离时，溶液的pH等于 pKa，此弱酸－碱缓冲体系的pKa即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围，通常是在pKa值为中点的两个pH单位范围内，即：缓冲剂的有效pH范围＝pKa±1，所以，当缓冲溶液的pH等于该缓冲剂的pKa时，缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可。 1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： ① pKa值在6～8之间； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 盐效应小；⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；⑨ 易制得高纯度的盐。 按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。 1.6.2 生物化学常用缓冲液 ⑴ 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4， 配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液 　 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即： △pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。 ⑶ 有机酸缓冲液 这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。 甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa1＝3.10， pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。 有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。 ⑷ 硼酸盐缓冲液 常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。 ⑸ 氨基酸缓冲液 此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有： 甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0， 甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，　 　 　 　 甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液）， 组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5， 甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8， 甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。 此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。 ⑹ 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液 1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。 Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。 1.6.3 pH值的测定 测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=1～14、9～14等，只能粗略确定溶液的pH值。另一种是精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2～3个pH单位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸（不可用手拿，以免污染试纸），用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。 精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极（甘汞或银—氯化银电极），现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。 玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有0.1N HCl，上部由银～氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度（活度）的变化而变化。 参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极（Hg/HgCl）或银—氯化银电极（Ag/AgCl）。参比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以4M KCl或饱和KCl，以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶，以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。 现在pH测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH值。 (A) 玻璃电极 (B) 复合电极 (C) 参比电极（银－氯化银电极） 图3 pH电极示意图 测定pH值时，玻璃电极和参比电极同时浸入溶液中，构成一个“全电池”，如下图所示： pH计 Ag/AgCl HCl( 0.1mol/L) 样品 4mol/L KCl或 Ag/AgCl或 溶液 饱和KCl Hg/HgCl 玻璃电极 参比电极 使用时应注意： ⑴经常检查电极内的4mol/L KCl溶液的液面，如液面过低则应补充4mol/L KCl溶液。 ⑵玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。 ⑶复合电极长期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中，使用时取出，用洗并冲洗玻璃泡部分，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸入待测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定。　 　 　 　 ⑷使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。 ⑸使用前要用标准缓冲液校正电极，其数据见书后附录，常用的三种标准缓冲液是pH=4.00、6.88和9.23（20℃），精度为±0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88的标准缓冲液中，用pH计上的“标准”旋钮校正pH读数，然后取出电极洗净，再放入4.00或9.23的标准缓冲液中，用“斜率”旋钮校正pH读数，如此反复多次，直至二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。 ⑹电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2mol/L KCl 溶液中，40℃加热一小时以上，进行电极活化。 pH测定时会有几方面的误差： ⑴钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的碱性溶液，Na+ 的干扰更加明显。例如，当Na+ 浓度为0.1mol/L时，可使pH值偏低0.4～0.5单位。为减少Na+ 对pH测定的干扰，每个复合电极都应附有一条校正Na+干扰的标准曲线，有的新式的复合电极具有Na+ 不透过性能，如无以上两个条件，则可以将电极内的KCl换成NaCl。 ⑵浓度效应： 溶液的pH值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关，因为溶液pH值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高十倍的“贮液”，使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液pH会有变化，因而稀释后仍需对其pH进行调整。 ⑶温度效应：有的缓冲液的pH值受温度影响很大，如“Tris”缓冲液，因而配制和使用都要在同一温度下进行。 1.7 生化实验室的基本设施与装备 1.7.1 温度与环境设施 许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存，实验室必须备有4℃、－20℃、－80℃的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙醇～干冰浴进行样品的快速冷冻分装。 1.7.2 实验室用纯水 生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如15～18 MΩ(cm高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。 实验室制备无离子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯季胺型强碱性阴离子交换树脂填充的阳离子和阴离子交换柱，或是阴、阳离子交换树脂的比例为2∶1的混合柱。无离子水的水质用电阻率表示，最高纯度是18 MΩ(cm（25℃）。虽然无离子水中阴、阳离子的含量可以很低，但用离子交换法却不能去除水中的有机物杂质，离子交换树脂中的低分子有机化合物亦可能溶于水，因此由无离子水的电阻率不能看出水中有机物的污染程度，有机物的污染有可能干扰生化实验中的某些反应，也会使水的紫外吸收增加，对于那些对紫外吸收要求十分严格的实验，应选用蒸馏水而不用无离子水。 实验室中制备蒸馏水，多采用石英管加热的硬质玻璃蒸馏水器，蒸馏时不能用自来水，因为会产生水垢，最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物，可在蒸馏水器中每升水加1g高锰酸钾和1mL 85％的磷酸，以便通过氧化除去有机物。不含金属离子的水，需用亚沸蒸馏水，即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏，其特点是在液面上方加热，但水并不沸腾，只是液面处于亚沸状态，可将水蒸气带出的杂质减至最低，但制水量较小，每小时约1～4升。 实验工作中不应盲目追求水的纯度，水的价格随水质的提高而成倍地增长，因此要根据实际工作的需要，即所用水中应排除的干扰物质的类型，来选用水的种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。 所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的污染；长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中。 1.7.3 消毒系统 生化实验要进行生物培养和生物反应的操作，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。 1.7.4 计量系统 生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。 ⑴ 称量系统：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、电子天平和各种万分之一的单、双盘天平和电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制和标准物质的称量等。 ⑵ 液体体积度量系统：常用的有各种量筒、移液管、容量并、微量进样器和各种自动取液器等。 ⑶ 酸碱度pH测量系统：最常用的是pH试纸和pH计。 ⑷ 液体溶质定量系统：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室必备的仪器分析手段。主要有可见分光光度计、紫外／可见分光光度计和高档的快速扫描紫外／可见分光光度计等。 1.7.5 离心设备 离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。 1.7.6 电泳装置 电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见第4章。 1.7.7 层析装置 层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化实验室最常用的仪器设备。主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见第3章。 1.7.8 光密度仪 激光光密度仪是适用于多种电泳结果分析的仪器。它采用激光为光源，色散性强，线性范围广，分辨率高，所得结果可以在电脑中进行多维的图象处理，并打印出结果，在生化实验室中正得到越来越广泛的使用。 1.7.9 真空印迹系统 该设备是一种利用真空原理将已经分离的生物大分子(蛋白质、核酸)从电泳后的凝胶中转移到膜上的仪器，主要由印迹仪和真空印迹泵组成，印迹效率接近100％，重复性好，方法简易、快速，将转移分子的变性、中和、印迹等所有步骤均在印迹仪中完成，从而避免了凝胶受损。 1.7.10 核酸自动合成仪与测序仪 用于DNA、RNA的自动合成及序列测定。 1.7.11 蛋白质的自动合成与测序仪 用于蛋白质分子的体外合成与序列测定。 1.7.12 PCR仪 PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种仪器，是生化与分子生物学实验常用和必备的设备。 1.7.13 同位素实验设施 生物化学许多实验都要用到放射性同位素，如：生物体分子示踪、分子杂交、放射性检测等，因此实验室必须有安全的同位素实验设施。 ⑴放射源材料存放室：用于放射源材料的存放、保管等，应较僻静。 ⑵操作时的防护设施： 常用的器具有：有机防护并、特制防护衣、防护罩等．接触同位素样品时必须戴防护手套。 ⑶放射性检测、监测器：在操作同位素的地方，应配备检测、监测器，能自动安全报警，随时报告并指示放射源情况。 ⑷放射性核素分析测定仪：用来检测分析实验结果。常用的有液体闪烁计数器，数字式放射自显影分析仪，盖革计数器和Ｘ射线放射显影盒等。 ⑸废物处理器：使用同位素应有能够安全地存放和处理同位素废物的场所，否则严禁使用同位素。 1.7.14 生物培养设施 生物培养是生化实验必不可少的设备。生物材料的培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养等。不同的培养，其对设施的要求也有所不同。 微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床（有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反应器等。 植物细胞及组织培养： 需要恒温恒湿光照培养箱、振荡培养器、生物反应器和植物房等。 动物细胞及动物培养：需要二氧化碳培养箱、电热恒温培养箱和动物房等。 为了对所培养的微生物和动植物细胞进行破碎，提取所需的生物大分子，还必需有各种高效率的细胞破碎装置。 1.7.15 基因导入仪 用于向受体生物细胞中导入基因。常用的导入仪有：电导入仪、基因枪、激光和超声导入仪、原生质体融合仪等。 1.7.16 高效液相色谱仪和毛细管电泳仪 用于各种生物大分子的分析与鉴定。 1.7.17 暗室 在生化实验研究中，必须有一间装备完整的暗室，能对各种照相乳胶和感光材料进行处理，如各种电泳凝胶的照相冲洗和放大，放射性自显影的X射线片及其他感光底片的处理，以及进行核酸与荧光物质（溴化乙锭）结合后在紫外线照射下对电泳结果的观察操作等。 暗室中应装备有：照相装置、放大机、曝光箱、翻拍仪、自动冲片机和紫外透射仪等。 1.7.18 冷室 生化实验一般都要求在低温下进行，由于冰浴太小，冷柜也不能进人操作，因此就需要有一间4℃～10℃的冷室，工作人员可以在其中进行各种柱层析、各种电泳、生物大分子的提取和分离、硫酸铵沉淀蛋白质以及各种物质的透析等操作，并可以贮存各种生物制品和生化试剂。 1.7.19 其他设备 实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备： ⑴通风柜：用于有害和有毒气体的操作。 ⑵微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。 ⑶组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。 ⑷超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头的清洗和高效液相色谱仪所用流动相的脱气等。 ⑸制冰机：为实验室提供足够的碎冰块。 ⑹冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液的冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。 ⑺机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。 ⑻旋转蒸发器：用于各种水溶液和有机溶液的旋转减压蒸馏操作。 ⑼普通显微镜和倒置显微镜：用于对各种细胞和生物材料的观察。 ⑽酶标仪：用于免疫化学实验的酶联免疫吸附测定。 由上述内容可见，生化实验室所需装备的各种仪器设备和设施是多种多样的，因而要求每一位生物化学工作者和学生都必须非常重视这些仪器设备和设施的使用和维护，必须具有较强的实验动手能力。能否正确熟练地使用上述这些仪器设备，在很大程度上将决定他们实验的成败。