实验七 脱辅基血红蛋白的制备和重组 一、实验目的 了解生物化学中典型的血红蛋白的性质和结构以及结合在蛋白上的辅基的作用。 学习一种生物无机生化科研中常用的为金属酶和蛋白质代换金属离子的方法。 学习快速扫描分光光度计的使用及紫外可见吸收光谱的应用。 学习柱层析和透析袋脱盐的方法。 二、实验原理 血红蛋白(Hemoglobin)是由二价铁Fe(Ⅱ)血红素作为辅基与多肽链结合组成的一种结合蛋白，它是由四个亚基组成的四聚体，分子量大约为65000。四个亚基中，两个亚基具有相同的氨基酸序列，称为α—亚基，每条链含141个氨基酸，另外两个氨基酸序列相同的亚基，称为β—亚基，各含146个氨基酸。两种亚基有其各自的二级、三级空间结构，亚基之间以非共价键结合在一起。每个亚基中均含有一个血红素辅基，血红素是一个铁原卟啉Ⅳ，它处于一个疏水环境，此疏水环境对血红蛋白的可逆载氧功能起着非常重要的作用。Fe(Ⅱ)在血红蛋白中始终是以+2价还原态存在的，若被氧化成Fe(Ⅲ)，则称为高铁血红蛋白，它就失去了可逆载氧功能。 血红素辅基与血红蛋白均以非共价键相连，其中包括 Fe(Ⅱ)与近端组氨酸(F8His)上的Nε上的配位键；卟啉环侧链丙酸阴离子与蛋白氨基酸侧链之间的盐桥；以及卟啉环中乙烯基与蛋白的疏水相互作用。在酸性条件下，由于蛋白的变性而使这些作用变得很弱，以至于高铁血红素可以从血红蛋白的疏水区中游离出来。利用高铁血红素在丁酮中的溶解度大大高于它在水溶液中的溶解度的性质，用多次丁酮萃取的方法将血红素与蛋白分离。分离得到的脱辅基血红蛋白(ApoHb)可以用金属卟啉化合物(例如高铁血红素、钴卟啉、铜卟啉等)进行重组，生成各种不同金属卟啉的血红蛋白。 由于高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱中，在405nm处有很强的特征吸收峰，而脱辅基血红蛋白只在280nm处有蛋白的特征吸收峰，当将高铁血红素加入ApoHb溶液中后，重组成功的高铁血红蛋白又会在405nm处出现它的特征吸收峰，因而血红蛋白的脱辅基与重组试验均可用紫外可见分光光度计进行检测。 三、实验方法 1. 氧合血红蛋白的制备(供全班学生使用) 在市血站购买一袋人血，用高速冷冻离心机4000r/min离心10min，取下层血球加四倍体积的0.9% NaCl洗血球，再用4000r/min离心10min，如此重复2～3次，取下层血球，按1∶1(v/v)体积比加甲苯，振荡2分钟以上，使血球破膜，8000r/min离心20min，弃去上层甲苯和中层脂肪，取下层血球沉淀，加10分之一沉淀体积的9% NaCl，激烈振荡混合，4000r/min离心10min，弃沉淀，取上层红黑色血红蛋白溶液，再用8000r/min离心10min，弃上层，取下层血红蛋白溶液用滤纸过滤，因过滤很慢，可放4℃冰箱内过滤过夜，然后装透析袋，4℃对H2O透析除NaCl和甲苯，换2～3次予冷的H2O，由透析袋内取出血红蛋白溶液置入一锥形瓶，取样分析血红蛋白(Hb)的浓度：取5(l Hb，加3.0ml H2O(稀释601倍)，用分光光度计作250nm～700nm的扫描，并检测Hb在415nm、541nm和576nm处的三个特征峰值：A415、A541和A576，已知这三个特征峰的吸光系数值为： (415 =125 l/mmol、(541 =13.5 l/mmol、(576 =14.6 l/mmol。 由公式： 浓度C=(A×稀释倍数)/ (，即可计算出制备的氧合血红蛋白Hb的浓度CHb。 2. 氧合血红蛋白(Hb)氧化成高铁血红蛋白 取已知浓度(约3～6 mmol/L)的氧合血红蛋白2 ml，置于5 ml小烧杯或10 ml试管内放入冰浴，用下式计算需加入过量1.3倍的K3Fe(CN)6 的量 (10mg/ml)(Mw=329.26)：  用移液管吸取所需加入的K3Fe(CN)6，在缓慢搅拌下滴入Hb内，直到血红蛋白的颜色从鲜红色变成棕黑色。 装一根1.8cm×22cm的Sephadex G-25凝胶脱盐柱，用10mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液平衡脱盐柱，将制成的高铁血红蛋白溶液全部上柱，用4℃H2O洗脱，用量筒收集高铁血红蛋白，再用H2O将其稀释至1.0～1.5mmol/L (因为过浓不利于脱辅基，太稀又会脱不完全)，记录总体积，取样稀释200～300倍，作250～700nm的扫描，得重组前高铁血红蛋白的紫外可见吸收光谱图，检测峰值A405。 3.脱辅基 (以下步骤均在冰浴或4℃下进行) 高铁血红蛋白用1.0mol/L HCl粗调，再用0.1mol/L HCl细调溶液pH=1.8～2.0 (这一步是关键，pH太高，脱辅基不完全，pH过低蛋白会变性)，将溶液置入具塞试管内，加入等体积予冷丁酮，手摇振荡萃取，静止分层，弃上层丁酮，取下层溶液，如此反复萃取几次，直至上层丁酮无色为止。 取下层浅绿色脱辅基后蛋白溶液装透析袋，4℃对 1L 5 mmol/L NaHCO3透析0.5～1 h，以除HCl，再对H2O(4℃)透析两次，以除丁酮，再对4℃ 200 ml 0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液透析1 h，中间取出透析袋倒置二次（此时会出现少量白色变性蛋白沉淀）。 取出袋内溶液，用8000r/min离心10 min(4℃)，取上层清液，测体积(脱辅基血红蛋白ApoHb)，立即存于冰浴。取样稀释10～20倍，作250nm-700nm扫描，作峰检测得A278蛋白吸收峰值，(以0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液作参比)。计算脱辅基血红蛋白(ApoHb)的浓度CApoHb：  （ApoHb的 (278=13.1 L/mmol） 4. 重组高铁血红蛋白 取3.0ml ApoHb，用0.01mol/L NaOH配制5mg/ml的高铁血红素(Hemin，Mw=651.5) ，计算Hemin的加入量(过量1.5倍)：  缓慢搅拌下，用10～15min滴加所需体积的Hemin到3.0ml ApoHb中，并在冰浴中再放置1 h，用1mol/L NaOH粗调和0.1mol/L NaOH细调溶液pH=9～10，溶液颜色变为棕黑色。 再用G-25脱盐柱脱去过量的Hemin等，脱盐柱用0.1mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液平衡和洗脱，用量筒收集重组后的高铁血红蛋白，测量总体积，取样稀释后作250nm～700nm扫描，测峰值A405，最后计算重组率：   由扫描所得的各个紫外可见吸收光谱图，可以清楚地看到血红蛋白脱辅基前后和重组后的效果。