实验五 小牛胸腺DNA的制备 一、实验目的 1. 了解DNA的存在状态，增加感性认识。 2. 掌握DNA的制备方法以及细胞分级，细胞核制备，细胞膜裂解和解离DNA-蛋白复合体（DNP）的技术。 3. 学习用紫外分光光度计测定DNA含量的方法。 二、实验原理 核酸是重要的生物大分子。在细胞核内，核酸通常是与某些组织蛋白质结合成复合物，即以脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在。因此，在提取和制备DNA时，首先必须设法将这两类核蛋白分开。 在不同浓度的盐溶液中，RNP与DNP的溶解度有很大的差别。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随着NaCl浓度的增加而逐渐下降，当NaCl 浓度为0.14mol/L时，DNP的溶解度仅为其在纯水中溶解度的1%，而当NaCl浓度继续增加时，DNP的溶解度又渐次增大，当NaCl浓度增至0.5 mol/L时，DNP的溶解度约与其在纯水中的溶解度近似，当NaCl浓度继续增加至1.0 mol/L时，DNP的溶解度约为其在纯水中的溶解度的两倍，且随着盐浓度的上升，其溶解度仍继续呈增大的趋势。但RNP则与之不同，在0.14 mol/L的盐溶液中，DNP溶解度很低，而RNP的溶解度仍相当大，因此，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液（1.7 mol/L浓度以上的NaCl）来提取DNP。 提取出DNA-蛋白质复合体（DNP）后，还必须将其中的蛋白质除去，因此，提取纯化DNA要经过以下四个步骤： 1. 制备细胞核； 2. 裂解细胞核； 3. 解离DNA—蛋白质复合体； 4. 从可溶性物质中分离出DNA。 小牛胸腺、猪脾、鱼精子和植物种子的胚胎等生物材料，细胞核含量比例大，因而含有丰富的DNA，是提取DNA的好材料。本实验以小牛胸腺或猪脾为材料。小牛胸腺不仅DNA含最高，而且其脱氧核糖核酸酶（DNase）的活性较低，在制备过程中由此酶所引起的DNA降解损失也较小。为了防止DNase的作用，在用于提取的缓冲液中均含有1mmol/L的EDTA（乙二胺四乙酸）螫合剂，以除去保持 DNase活性所必须的Mg++离子。为防止DNA的变性和降解，操作要尽可能在低温下进行。 本实验通过匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，再加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，然后加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。 提取纯化后的小牛胸腺DNA用紫外分光光度法进行鉴定分析，并计算其收率和纯度。 本实验所得的DNA样品将用于实验五的Tm测定。 三、器材与试剂 器材： 1. 高速冷冻离心机，50ml塑料离心管，300ml塑料离心管 2.食品加工机和高速分散器 3. 恒温水浴 4. 磁力搅拌器 5. 量筒：50ml、250ml、500ml 6. 烧杯：100ml、500ml、1000ml 7. 具塞三角瓶：250ml 8. 小培养皿 9. 吹风机 10. 可扫描的紫外分光光度计 试剂： 0.01M柠檬酸钠－9mg/ml Nacl－1mmol/L EDTA ，pH 7.0，300ml b. 0.15M柠檬酸纳－1mmol/L EDTA，pH 7.0 ，300ml 20% SDS （公用） 氯仿－异戊醇（24 : 1）混合液 500ml 95% 乙醇和无水乙醇 丙酮 0.1mol/L NaOH 四、实验步骤 1.制备细胞核 ⑴ 取小牛胸腺（或猪脾）在冰块上去除脂肪和结缔组织，切碎，称10g，放入食品加工机，加入予冷的试剂a.溶液60ml，打碎三次，每次20秒，仃20秒。将打碎后溶液倒入小烧杯，用高速分散器匀浆三次，每次20秒，仃20秒。 ⑵ 将匀浆后溶液分装于两个50ml离心管，仔细平衡后，用高速冷冻离心机，4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清（脂肪层等）留沉淀。 ⑶ 将沉淀置于小烧杯，加50ml予冷a液，用高速分散器同样再匀浆分散三次，同样4℃，10000r/min，离心10min，弃去上清留沉淀。 ⑷ 取出沉淀加60ml予冷b液，再高速分散二至三次，每次分散10秒，仃10秒。 2. 裂解细胞核 将悬浮液移入250ml烧杯中，在磁力搅拌器上边搅拌边滴入8ml 20% SDS，应观察到溶液明显变粘稠（报告中回答：为什么？）。用55℃水浴温热10min～15min，然后在搅拌下缓慢加入8～10g NaCl，再搅拌10min，使NaCl全溶，此时应观察到溶液变稀（为什么？）。冷却至室温。 3. 解离DNA—蛋白质复合体 ⑴ 将溶液倒入250ml具塞三角瓶中，加入此溶液二分之一体积的d液（氯仿用于变性蛋白质，异戊醇用于消除泡沫，也可用异丙醇、异丁醇），剧烈振荡10min，倒入300ml离心管中，4℃，10000r/min，离心5～10min，用滴管取出上层水相，中层蛋白质界面弃去，下层有机相倒入回收并。 ⑵取出的上层水相重复加d液、振荡、离心，至中层界面无混浊为止。 4. 提取DNA ⑴ 将取出的水相滴入予冷的95%乙醇中，边滴加边用玻璃棒搅拌起白色纤维状DNA沉淀。搅拌速度对产率有影响，若产出减少可补加或换新乙醇。（观察并解释实验现象）（回收乙醇）。 ⑵ 搅起的DNA 置于已称重的小培养皿内，依次用95%乙醇和无水乙醇清洗纤维状DNA沉淀至无浑浊为止，最后再用丙酮清洗一次，用吹风机将DNA吹干。 ⑶ 称重，并计算产率。 5. 测定DNA ⑴ 准确称取50～100mg DNA，加少量0.1mol/L NaOH溶解，加H2O定容至50ml。 ⑵ 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA的紫外吸收曲线，测定A260和A280，并计算比值：A260/A280，纯DNA的此比值约为1.8。 ⑶ 根据：每毫升1微克的纯DNA的A260值= 0.020，计算所得DNA的纯度，并讨论纯度较低的原因和解决办法。 实验六 小牛胸腺DNA熔解温度的测量 一、实验目的 1. 了解DNA的变性性质，及其熔解温度的意义和用途。 2. 掌握测量熔解温度的方法。 二、实验原理 当DNA暴露在变性环境（加热，有机溶液等）中时，其紫外吸收曲线就会显著改变。如下图所示，从25℃加热至80℃，光吸收变化很小，但是当温度继续上升时，紫外吸收急剧增加，然后趋向一个恒定的A260 值，这条曲线叫做DNA的熔解曲线，曲线中吸收增加的中点所对应的温度，定义为熔解温度（Tm）。大多数DNA的熔解温度都在80 ~ 90℃之间，光吸收通常增加40%。DNA分子中GC碱基对的含量越高，其双螺旋结构就越稳定，Tm也就越高；DNA样品中的杂质越多，光吸收的增加也就越小。每种DNA分子都有其特有的 Tm，可以用于DNA的鉴定与特征分析。 DNA的熔解曲线 本实验将采用热变性的方法测量小牛胸腺DNA的熔解温度，有两种方法可供选择。 方法一：需要一台带有超级恒温水浴和恒温样品池架的分光光度计，其温度在 25～100℃之间可调，要使用高沸点溶剂（如乙二醇）作为循环液体。把装有DNA标准溶液的石英比色杯放入分光光度计的恒温样品池架中，按不同的温度间隔升高温度，平衡后，测量其260nm处的紫外吸收（A260）。要考虑到，在加热过程中，水体积增加会使DNA浓度降低。 另一种方法是，取一支装有DNA溶液的试管，测量其2 5℃时的A260。然后将几管装有同样DNA溶液的试管在不同温度的恒温水浴中加热。15分钟后迅速将试管放在冰浴中冷却，然后迅速测量其A260。这种方法的主要缺点是变性DNA冷却后引起DNA双链的部分再结合，所以A260的增加一般只有10～20%。 三、器材与试剂 1. 紫外分光光度计 2. 超级恒温水浴 3. 普通恒温水浴 4. 石英比色杯（带盖） 5. 冰浴桶 6. 水浴锅 7. 试管 8. 缓冲液：0.015mol/L柠檬酸钠—0.15mol/L氯化钠溶液 9. DNA溶液：用实验五所得小牛胸腺DNA和缓冲液，配制A260= 0.4左右的DNA 标准溶液。溶解此DNA需较长时间的搅拌。 四、操作步骤 方法一：用超级恒温水浴测量Tm 打开分光光度计，予热20分钟，将超级恒温水浴的温度设为25℃，以测量起始的光吸收，将装有柠檬酸钠缓冲液的参照比色杯和装有标准DNA溶液的样品比色杯放入分光光度计的样品池架中的相应位置。放置3分钟，使比色杯内外的温度达到平衡，将此时的参照杯A260调为零，记下此时的DNA的样品的A260，这个测量要十分小心，因为所有测量值都要与25℃的这个值进行比较。然后，将温度升至50℃，取出比色杯，轻叩杯壁以去除内壁上的气泡。将比色杯放回样品池架，测量后继续加热至80℃，平衡5分钟后，记下其A260，再升高2℃，平衡5 分钟后记下其A260，重复此操作步骤至A260达到恒定值。可以注意到在一个5~10℃的温度范围内，A260有一个较大幅度的增加。根据不同温度下水的体积变化对不同温度下的A260（即A260,T）进行补偿后，以 A260,T / A260,25℃作纵轴，T作横轴，画出小牛胸腺DNA的熔解曲线，并求出Tm。 方法二：用普通恒温水浴的方法测量Tm。 将恒温水浴的温度分别设为50℃、70℃、80℃、82℃、84℃、86℃、88℃、90℃、92℃、94℃、96℃、98℃和100℃，往15支试管中各加入标准DNA溶液3ml，盖上橡皮塞或包上塑料薄膜。100℃水浴锅中放两支，其余12个恒温浴中各放一支。剩下一支室温放置，并测量其A260，即为基准值A260,25℃。将100℃水浴锅中的一支试管，连同水浴锅一起在室温下缓慢冷却至室温，放置1小时后再测其A260。其余试管均温浴15分钟后，取出迅速放入冰水中，冷却10分钟以上，由冰水中取出就立即测量A260，即为各A260,T。 紫外分光光度计要提前打开，调好零点，做好准备。用溶解DNA的缓冲液作参比。 测完后，以A260,T/ A260,25℃为纵轴，T为横轴作图（去除100℃加热，室温下缓慢冷却的点），求出小牛胸腺DNA的Tm。（取曲线上直线部分延长线的交点之间的中点求出Tm。） 五、思考问题 1、DNA变性后，为什么会产生增色效应？ 2、予测并解释下列条件对天然DNA的Tm的影响。 （1）pH=12的缓冲液 （2）蒸馏水 （3）50% 的甲醇 （4）1% SDS－0.15mol/L NaCll－0.015mol/L柠檬酸钠（pH7.0） 3、根据%GC=2.4（Tm－69.3）,计算小牛胸腺DNA的GC碱基对的含量，并解释为什么GC碱基对的含量与Tm呈正比关系。 4、100℃温浴15分钟后，迅速冷却与缓慢冷却的DNA溶液的A260有什么不同？为什么？