实验十三 免疫化学实验 免疫化学实验包括免疫血清的制备、沉淀反应定量法、对流免疫电泳、单向定量免疫电泳（火箭电泳）、双向定量免疫电泳（交叉免疫电泳）、微量免疫电泳以及单向双向免疫扩散、酶联免疫吸附测定等。从内容上看这几个实验具有一定的连贯性，是免疫化学最基本的实验方法。 实验(一) 免疫血清的制备 一. 实验目的：制备抗特定抗原的动物抗血清。 二. 器材与试剂： 1. 实验动物：兔子（2500~3000克） 2. 抗原：（小牛血清） 3. 佐剂：福氏完全佐剂 4. 乳化搅拌器 5. 注射器及针头 6. 手术器械：剪刀，手术刀，线，血管钳，塑料导管（(2mm） 7. 恒温箱 8. 离心机及离心管 9. 三角瓶（100ml） 10. 酒精棉球 11. 叠氮化钠(NaN3) 12. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS） 三. 实验方法 制备高效价和高特异性的免疫血清是免疫化学实验的第一步，免疫血清也是免疫学实验必不可少的生物制剂。实验程序包括动物免疫注射，抗血清效价的测定，全部放血及血清的分离与保存四步。 1.免疫兔子 免疫周次 不完全佐剂(ml)  抗原 小牛血清(ml)  PBS(ml) 灭活结核杆菌 免疫用量 ml/只  注射部位   石蜡油 羊毛脂       一 0.5 1.5 1.5 0.5 0.1-0.2mg/ml  2 四只脚掌  二 0.5 1.5 1 1   2 腋窝 腹股沟 脊背  三   1 1   2 腹腔  四   0.3 0.2   0.5 耳缘静脉   福氏完全佐剂常用的制备方法有研磨法和注射器法两种。研磨法方法如下：将经高压除菌的石蜡油0.5ml和羊毛脂1.5ml放入无菌的乳钵内，再慢慢滴入小牛血清。PBS及已灭活的结核杆菌，边滴边研磨，直至成为乳白色粘稠的油包水乳剂。检验方法是取一滴乳剂滴入水面（冷水），如不扩散，则完全佐剂已研磨成功。此配方为一只兔子的免疫用量，也可按比例多组联合研磨。 注射器法：将两个注射器中间接上一根短的胶皮，注射器左右推拉，使注射器内的溶剂充分乳化，直至形成油包水乳剂。 2. 免疫血清效价的测定 第四周时通过耳缘静脉采血1ml，先将血液置室温30分钟，离心（3500rpm）10分钟，取出血清。用双向免疫扩散法测定抗血清的效价，以确定免疫效果。 3. 颈动脉采血 将禁食12小时或隔夜的兔子仰面固定于固定板上，头部放低，暴露出颈部，剪开颈中部皮肤，约10cm长。沿气管分离皮下组织，直至暴露气管前的胸锁乳突肌。仔细分开胸锁乳突肌（注意勿剪断小血管），在肌束下面靠近气管两侧，可以看到搏动的颈动脉。取二把血管钳在血管的远心端（近头部）夹紧，一把夹住近心端的血管（在近心端用线扎好与血管相连的神经，然后用剪子在二把血管钳中间的血管上剪一小口插入塑料放血管（用线固定），轻轻放开近心端的止血钳，使血很快射入三角瓶中。直至血流缓慢时（也可用同法在另一侧动脉内插管放血）将固定板后肢端抬高，增加放血量。 将三角瓶盖好，放置室温一小时，再放4℃过夜，待血块收缩后分离血清（离心3500rpm,　10分钟）。 4．血清的保存 如要长时间存放，56℃灭活，在血清里添加0.1%叠氮化钠，将血清进行小量分装，放置低温冰箱内保存。 Some commonly used adjuvants Adjuvant Composition and use  Freund’s complete adjuvant(FCA) Mineral oil containing heat-killed mycobacteria(Mycobacterium tuberculosis) Used as emulsion with aqueous antigen  Freund’s incomplete adjuvant(FIA) Mineral oil Used as emulsion with aqueous antigen  Alum Complex aluminium salts. There are various versions of the adjuvant: some can be purchased ready for use(e.g. Alhydrogel); others can be prepared in the laboratory by mixing various salts, e.g. NaHCO3, and aluminium potassium sulphate. Aqueous antigen is absorbed to gel  Bentonite Wyoming sodium bentonite(Montmorillonite) as gel. Aqueous antigen adsorbed to surface  Quil A Saponin derived from Quillaja saponana Molina(South American tree). Mixed to form a complex with aqueous antigen.  Muramyl dipeptide(MDP) N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine. Mixed with aqueous antigen. Various derivations of MDP are aqueous antigen  Monophosphoryl lipid A(MPL) Used in various formulations, often as an emulsion with oils. Antigen included in emulsion  Bacillus pertussis Killed organisms mixed with aqueous antigen   FCA is probably the most potent adjuvant but may be inappropriate for some purposes. Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford. Examples of immunization protocols that have been used successfully Species Priming Rest period(weeks) First boost Rest period(weeks) Subsequent boosts  Mice, rats and guinea pigs 5-100?g antigen in FCA or other adjuvant, s.c. or i.m. 2-3 50-100?g antigen in FIA, other adjuvant or PBS, i.m. or s.c. 3 5-100?g antigen in FIA or PBS, i.p., s.c., i.m. or i.v.  Rabbits 50-250?g antigen in FCA or other adjuvant, i.d., i.m. or s.c. 3-4 50-250?g antigen in FIA or other adjuvant or PBS, i.m., or s.c. 4 or longer 50-250?g antigen in FIA or PBS, i.m., s.c. or i.v.  Sheep and goats 250?g-10mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d. 4 250?g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c. 4-8 or longer 250?g-10mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m., s.c.or i.v.  Horses and donkeys 250?g-50mg antigen in FCA or other adjuvant, i.m.,s.c. or i.d. 4 250?g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c. 4-8 or longer 250?g-50mg antigen in FIA or other adjuvant, i.m.or s.c.  Primates 50?g-1mg antigen in adjuvant, i.m. or s.c.  50?g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.v. 4-8 or longer 50?g-1mg antigen in adjuvant or PBS, i.m., s.c.or i.d..  Chickens 30-200?g antigen in FCA or other adjuvant, i.m. 2-3 30-200?g antigen in FIA or other adjuvant, i.m. 3 or longer 30-200?g antigen in FIA or other adjuvant or PBS, i.m.   FCA, Freund’s complete adjuvant; FIA, Freund’s incomplete adjuvant; PBS, phosphate-buffered saline; i.p., intraperitoneally; s.c., subcutaneously; i.m., intramuscularly; i.v., intravenously; i.d., intradermally. Source: Reproduced from M.A.Kerr and R.Thorpe, Immunochemistry Labfax(1994), Bios Scientific, Oxford. 实验(二) 沉淀反应定量法 一．实验目的：测定抗血清中特异性抗体的浓度。 二．器材与试剂: 1．37℃恒温箱 2．紫外分光光度计 3．冰箱 4．塑料离心管（15ml） 5．抗原（小牛血清） 6．免疫血清 7．pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS） 8．0.1M NaOH 9．高速离心机 三．实验方法 在10支塑料离心管里分别加入1，10，20，50，100，150，250，350，450(l的抗原溶液，用PBS将每支离心管里的溶液总量加至450(l 。然后分别向各支离心管里再加入100(l的抗血清，充分混合后在37℃的恒温箱内保温一小时，再在4℃的冰箱内放一夜。通过离心（10000rpm，20分钟）将沉淀和上清分开。将沉淀用冰冷的缓冲液洗涤三次后加入1ml 0.1M NaOH使之溶解，然后用紫外分光光度计测定A280nm处的光吸收。 四.数据处理 以抗体和牛血清白蛋白在A280=1.0时浓度分别为0.695 和1.886mg/ml计算，作出以抗原量为X轴，沉淀的总蛋白量为Y轴的沉淀曲线图。通过从图中最高值中减去抗原的量,计算出抗血清中特异的抗体的含量。 实验(三) 双向免疫扩散法 双向扩散法（double diffusion）又称琼脂扩散法，是利用琼脂凝胶为介质的一种沉淀反应，扩散作用使分处两处的抗原和相应抗体相遇，形成抗原—抗体复合物，比例合适时将出现沉淀现象。 一. 实验目的：测定免疫血清的效价 二. 器材与试剂 1. 载玻片 2. 打孔器 3. 微量取液器 4. 稀释板 5. 培养器或带盖培养皿 6. 抗原 7. 免疫血清（抗血清） 8. 琼脂糖（或进口分装琼脂粉） 9. pH 7.2磷酸缓冲生理盐水（PBS）100ml 三. 实验方法 琼脂凝胶板的制作 称取0.6g琼脂粉放入三角瓶中，加入50ml PBS, 加热溶解成1.2%的琼脂溶液（冬天则琼脂的浓度为1%），用5~10ml小量筒量取4ml倾入洁净水平放置的载玻片中，凝固后用打孔器按图1打孔。 2. 抗血清的稀释 采用二倍连续稀释法，先在稀释板的六个孔里加100(l的PBS，然后取等量的抗血清与第一孔里的PBS混合，从第一孔里吸取100(l加入第二孔中，充分混合，依次类推从而得到2倍，4倍，8倍……，即2n的释释血清。 3. 免疫双扩散 按照抗血清稀释倍数的顺序用微量取液器依次取一定量的稀释抗血清加在琼脂板上外周的孔内（充满平），然后在中心的孔里加入抗原，加样完毕后把琼脂板放入湿润密闭的培养皿中放置24-48小时即可观察到沉淀线。 免疫血清效价的判断方法，就是能够观察到沉淀线的免疫血清的最大稀释倍数，称为免疫血清的效价。 实验(四) 对流免疫电泳 对流免疫电泳（counter immunoelectrophoresis）通过外加电场以限制抗原、抗体的自由扩散，提高抗原、抗体的局部浓度，加快两者的移动速度。由于血清抗原在碱性缓冲液中（pH8.6）带负电荷，由负极向正极移动，血清抗体由于接近等电点，由正极向负极渗透（电渗效应），比例合适时，二者相遇形成白色沉淀线。此法可定性或定量。 一. 实验目的：学习快速测定免疫效价的方法。 二. 器材与试剂 1. 电泳仪 2. 平板电泳槽 3. pH 8.6电板缓冲液（巴比妥缓冲液）离子强度0.05(。取巴比妥（MW184.19）1.84g, 巴比妥钠（M.W.206.20）10.3g溶于蒸馏水，定溶至1升。这是电泳槽用液。制备琼脂溶液时需要将上述缓冲稀释一倍，离子强度为0.025(。 其它器材和试剂同实验三。 三. 实验方法 铺制琼脂板 用离子强度 (=0.025的巴比妥缓冲液配制琼脂溶液20ml，按双向免疫扩散法中描述的方法铺制琼脂板，按图2打孔。 2. 加样 在靠正极的孔内加稀释抗体，在靠负板的孔内加抗原。 3. 电泳 在平板电泳槽里倒进离子强度(=0.05的巴比妥缓冲液。将凝胶板平放在电泳槽中的隔板上。琼脂的两端用浸温的滤纸做桥与电泳槽的电极缓冲液相连接，抗体端接正极。通电，电流强度按琼脂板的宽度计算（1-2mA/cm）。观察到白色沉淀线时，即电泳完毕（一般1小时左右）。 可快速测定抗体效价。 实验(五) 微量免疫电泳 免疫电泳法（immunoulectrophoresis）是把蛋白质电泳分离技术（琼脂电泳）和免疫学检测技术（双向扩散）结合起来的检测方法。此法在微量的基础上具有分辨率高，灵敏度高，时间短，是很理想的分离和鉴定蛋白质混合物的方法。用于抗原、抗体定性及纯度的测定。在临床诊断方面也有应用价值。 一. 实验目的 学习凝胶内分离蛋白质的电泳技术与利用抗原抗体的特异性反应的免疫扩散技术结合起来,分析鉴定抗原或者抗体的免疫化学方法。 二. 器材及试剂 1. 指示蛋白：溴酚蓝染色的牛血清白蛋白 2. 切割琼脂板的小刀 3. 牙签 4. 其它的器材与试剂同实验四 三. 实验方法 1. 琼脂板的铺制 如实验四铺好琼脂板，然后按图3的图样打孔划槽，电泳时不要把槽中的琼脂挑出来（槽的二竖边先不划开）。 2. 加样 使琼脂板的上孔里充满抗原溶液，下孔里充满着指示蛋白。 3. 电泳 如实验四的操作方法，调电流强度为2~4mA/cm。当指示蛋白质到达滤纸的边缘时就可以停止电泳。一般需要40~60分钟。 4. 扩散 电泳结束后，从琼脂板中间的槽里用牙签挑出琼脂凝胶，并加入免疫血清。将琼脂板置温盒内（或培养皿中），盖好盖子放置一夜。次日可以观察到凝胶内出现的沉淀线。一般情况下每一沉淀线即代表一种抗原成分。根据沉淀的数量.位置可以判断抗原的纯度以及抗原蛋白质的种类。微量免疫电泳常用于分析样品的血清成分。 5. 观察 免疫电泳的图谱可以直接观察到抗原抗体沉淀线，也可以用0.1%的氨基黑染色后观察。如果需要保存了的话可以拍照。 实验(六) 单向定量免疫电泳（火箭电泳） 火箭电泳（rocket immunoelectrophoresis）又称单向定量免疫电泳。在琼脂内掺入适量的抗体，在电场作用下，定量的抗原泳动遇到琼脂内的抗体，形成抗原—抗体复合物沉淀下来。走在后面的抗原继续在电场作用下向正极泳动，遇到琼脂内沉淀的抗原—抗体复合物，抗原量的增加造成抗原过量，使复合物沉淀溶解，一同向正极移动而进入新的琼脂内与未结合的抗体结合，又形成新的抗原—抗体复合物沉淀下来，不断地沉淀—溶解—再沉淀，直至全部抗原和抗体结合，在琼脂内形成锥形的沉淀峰，称火箭电泳。火箭峰的长度与标准抗原比较，可计算待测抗原的浓度。 一. 实验目的：学习单向扩散与电泳技术相结合的免疫技术及学习定量抗原的方法。 二. 器材与试剂 1. 玻璃板：8×8cm（或×7.5cm） 2. 其他器材试剂与实验(五)同。 三.实验方法 1. 抗体琼脂板的制备 将融化的琼脂冷却到55℃，加入适量（看免疫血清的效价高低而定）的抗体，立即混匀（不要出现泡沫），将上述的抗体琼脂（大约20ml）制成琼脂板，冷却后按图4打孔备用。 2. 加样 在各孔里加入按二倍连续稀释法稀释的抗原。 3. 电泳 方法如实验四。通电后调电压为10V/cm ，或电流强度为2~4mA/cm时间约1~5小时。 4. 观察 在电场作用下，定量的抗原在含有定量的琼脂中泳动后，比例合适时，可在短时间内出现锥形沉淀，此沉淀线形似火箭，抗原浓度越高，“火箭”面积愈大。但抗体效价要高。 5. 定量抗原 在电泳一定时间后可以观察到火箭状的白色沉淀峰。电泳完毕后可以用肉眼观察量出已知抗原量的各个火箭的高度，画出标准曲线，便可测出未知浓度的抗原量。如果精确计算的话，可用求积仪测定峰的面积。影响单向定量免电泳的因素很多，主要是要选择好抗体浓度，使抗原抗体浓度比例合适。这就需要根据免疫血清的效价来定所加入琼脂中的抗体量，如效价高，则免疫血清琼脂的比例为1：5-9，如效价低，则免疫血清与琼脂的比例为2：5。另外，抗原含量也要注意,过高过低都影响火箭峰形。如抗原含量过低，则峰形太矮，如抗原浓度过高，则火箭峰不封口。一般抗原抗体量合适的话，泳动的距离大约为2~5cm.。 实验(七) 双向免疫电泳（交叉免疫电泳） 双向定量免疫电泳又称交叉电泳（crossed electrophoresis）。分两步进行，先将抗原进行电泳分离各组分，然后再放在抗体琼脂板上，使各组分在垂直方向再泳动一次，根据各组分的沉淀峰便可定性定量抗原。 实验目的：学习交叉免疫电泳技术。 二. 器材与试剂同实验(六) 三. 实验方法 取一块8cm×7.5cm的洁净的玻璃板，在此板上制备3.5×7.5cm的琼脂板。冷凝后在距上边1cm处如图5打一个孔，在孔中加入抗原，走第一相电泳，电压为10V/cm，大约电泳60分钟。电泳完毕，在玻板的另一端铺上适当比例（看抗体效价高低而定）的含抗体的琼脂胶，走第二相电泳，抗原端接负极，电压10V/cm ,或电流强度为2~4mA/cm，通电2~5小时，观察抗原抗体沉淀线的形成。 实验(八) 酶联免疫吸附实验 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)--待测抗体(抗原)--酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。 一． 酶的交联 用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶交联在抗体上的方法主要有两种，即戊二醛法和过碘酸氧化法。 1．戊二醛法 戊二醛作为双活性试剂可将酶与抗体交联在一起，但戊二醛与蛋白质反应的机理各说不一，有的认为可能形成Michael加合物： 也有人认为可能是产生不饱合醛，再与－NH2反应成双Schiff碱蛋白衍生物： 戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定量的酶，抗体和戊二醛同加入溶液中，在一定温度下反应一段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。在蛋白质与戊二醛的交联反应中，蛋白质赖氨酸基团是戊二醛最可能的反应部位，组成辣根过氧化物酶（HRP）的300多个氨基酸中只有6个赖氨酸。市售的HRP中，只有1－2个赖氨酸基团可供交联，而抗体分子中，赖氨酸基团含量要大得多，因此在一步交联中，HRP反应性不强，抗体分子在戊二醛作用下易形成聚合物，因此交联反应后必须用50％饱和硫酸铵沉淀或用凝胶过滤除去聚合物。一步法酶结合物产率仅6－7％，其中HRP约占5％。在正常情况下，HRP只有一个戊二醛分子的一个醛基反应，而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应，即不发生聚合，故可将戊二醛先与HRP反应，透析除去未反应的戊二醛，再加入抗体，这样就不会产生聚合现象，此为二部交联法。产生的酶结合物中，其酶和抗体的mol比接近1：1，标记活性的损失比一步法少，但该法效率也不高，仅有2－5％的HRP标记在抗体分子上，标记的抗体只占25％，酶结合物的产率仅为10－15％。在实际运用中，酶与抗体mol比在1－2之间为宜，但未标记的抗体严重干扰检测结果，常用聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶(Ultrogel ACA-4A)过滤法除去未标记的抗体，无上述凝胶，也可Sephadex G-200代替。 2．过碘酸盐氧化法 辣根过氧化物酶是一种带糖的酶。糖含量约占18％，过碘酸盐可将糖中的羟基氧化成醛基，再与抗体直接连接。然后加硼氢化钠还原形成稳定的酶结合物。该法交联效果比戊二醛法好，结合物中HRP与抗体的mol比在2－3之间，参与酶结合物中的HRP可达70％，而抗体则可达99％。但在标记过程中，酶活性和抗体的免疫活性损失较多。 用戊二醛交联时，戊二醛的质量至关重要。戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是 酶结合物中HRP浓度(mg/ml)＝ ＝酶结合物的A(1cm 403nm) 0.4×稀释倍数 （已知HRP的A(1cm 403nm 1%)＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5) HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm 纯度RZ（Ｒeinheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。 二． 酶与底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。 免疫技术常用的酶及其底物 酶 底 物 显色反应 测定波长/(nm)  辣根过氧化物酶 (HRP)  邻苯二胺(OPD) 3.3'.5.5'四甲替联苯胺(TMB) 5-氨基水杨酸(5-AS) 邻联苯甲胺(OT) 2,2'-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS) 橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色 492*, 460** 450 449 425 642  碱性磷酸酯酶 4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS－Mx磷酸盐+重氮盐 黄色 红色 400 500  葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 黄色 深蓝色 405,420  β-Ｄ－半乳糖苷酶 4-甲基伞酮基-半乳糖苷(4MuG) 硝基酚半乳糖苷(ONPG) 荧光 黄色 360,450 420   * 终止剂为2mol/L H2SO4 ** 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。 可催化下列反应： HRP+H2O2→复合物 复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+A AH2 ——为无色底物, 供氢体； A—— 为有色产物。 三． ELISA常用的四种方法 直接法测定抗原 将抗原吸附在载体表面； 加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 2．间接法测定抗体 将抗原吸附于固相载体表面； 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。 3．双抗体夹心法测定抗原 将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 4. 竞争法测定抗原 将抗体吸附在固相载体表面; B.(1) 加入酶标抗原； B.(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 四. 操作步骤 1. 包被抗原：用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1～10微克/孔，每孔加200微升，37℃温育1小时后，4℃冰箱放置16～18小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 加封闭液200微升，37℃放置一小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37℃放置2小时。 6. 洗涤同2。 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37℃ 1小时。 8. 洗涤同2。 9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10--15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。 五. 仪器和材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。 4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4℃，保存,　Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。 5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween—20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。 6. 洗涤液：同稀释液 7. 封闭液：0.5%鸡卵清蛋白，pH7.4 PBS。 8. 邻苯二胺溶液(底物)：临用前配制 0.1M 柠檬酸(2.1g/100ml), 6.1ml 0.2M Na2HPO4.12H2O　(7.163g/100ml)　6.4ml, 蒸馏水12.5ml, 邻苯二胺10mg, 溶解后, 临用前加30%H2O2 40 微升。 9. 终止液：2mol/LH2SO4。 ELISA PROCEDURE A. Antigen Coating Prepare an antigen solution at the appropriate concentration in carbonate-bicarbonate buffer (coating buffer), e.g. human IgG (0.025mg/ml) in coating buffer (antigen solution). Pipette 0.2 ml of the above solution to each well of the microtiter plate. Incubate at 370C for 30 min., or incubate overnight at 40C. Remove the coating solution. Wash three times with PBS-T. Blocking step: 0.5% Ovalbumin-PBS (0.2ml/well) at room temperature for 1 hour (an additional blocking step may be required to block non-specific binding). B. Primary Antibody Reaction 1. Dilute the primary (first) antibodies in PBS-T, e.g. Rabbit-anti-human IgG antiserum. Add 0.2 ml of the diluted first antibody to each well. Negative control should be included. Incubate at room temperature for 2 hours. Wash three times with PBS-T. C. Application of Secondary Antibody Dilute the peroxidase conjugated secondary antibody in PBS-T, e.g. Goat-anti-rabbit IgG-HRP(1:1000). Add 0.2 ml of this solution to each well. Incubate at room temperature for 1.5 hour. Wash three times with PBS-T. D. Substrate Preparation During the last incubation and immediately before use, dissolve o-Phenylenediamine in Citric acid-sodium hydrogen phosphate buffer, add 30% H2O2 before use. E. Development Add 0.2 ml of the freshly prepared substrate to each well. Orange-yellow color should develop in positive wells after 15 minutes. Stop reaction with 50 ?l per well of preferred stopping reagent and read at 490nm in a microplate reader. REAGENTS Coating buffer (Carbonate-Bicarbonate buffer, pH 9.6) : Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g, add H2O to 100ml (pH 9.6). Phosphate buffered saline (PBS): NaCl 8g, KCl 0.2g, KH2PO4 0.24g, Na2HPO4. 12 H2O 2.9g, add H2O to 1000ml (pH 7.4). Washing buffer (PBS-T): PBS + 0.05% Tween 20. Blocking solution: 0.5% Ovalbumin in PBS. First antibody: Rabbit-ani-human IgG antiserum (1:32). Peroxidase conjugated secondary antibody: Goat-anti-rabbit IgG-HRP (1:1000). Substrate: substrate buffer(fresh): 0.1M Citric acid (2.1g/100ml), 6.1ml; 0.2M Na2HPO4. 12 H2O(7.163g/100ml), 6.4ml; add H2O 12.5ml, dissolve 10mg o-Phenylenediamine, and add 40?l of 30% H2O2 before use. Stopping reagent: 2M H2SO4. 实验(九) 蛋白质转移（Western Blotting） Western Blotting是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应以及显色系统分析此印迹。免疫印迹的实验包括5个步骤： 固定（immobilization）：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。 封闭（Blocked）：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上，并与蛋白质反应。 初级抗体（第一抗体）是特异性的。 第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。 被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 一. 操作方法： SDS－PAGE 将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白等用SDS－PAGE分离。 2．转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上 将转移缓冲液冷至4℃。 切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15min直到没有气泡。 切割四张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在转移缓冲液中。 海绵在转移缓冲液中充分浸湿。 在转移槽中倒入200ml转移缓冲液。 电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。 打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入： 浸湿的海绵 两张用转移缓冲液饱和的滤纸 用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡。 放上硝酸纤维素膜 另两张用转移缓冲液饱和的滤纸 浸湿的海绵 小心地合上转移槽的胶板，并立即放入转移槽中。倒入转移缓冲液，使其浸没转移胶板。 插入电极，注意正负极方向（硝酸纤维素膜面向阳极），打开电泳仪开关调至80mA，4h；或调至胶的面积（cm2）×0.8mA，2h。 （10）转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。 3. 免疫印迹膜的处理： 用TBS缓冲液洗膜5－10min。 将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇（37℃）60min。 用TBS缓冲液洗膜三次，每次10min。 将膜置于第一抗体溶液（小牛血清免疫兔的抗血清，1﹕10）中，置摇床上轻摇，37℃摇动2h或4℃过夜。 去掉第一抗体溶液，并用TTBS洗膜3次，每次10min。 将膜置于辣根过氧化酶－羊抗兔IgG溶液（1﹕500）中，37℃轻摇2h。 去掉辣根过氧化酶－羊抗兔IgG溶液，并用TTBS洗膜三次，每次10min。 最后用TBS溶液洗，以转移Tween－20。 加底物溶液反应2～10min，至抗原区带显色清楚为止。 用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。 另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X－光片上留下清晰的图像。 4. 试剂和器材 试剂： 小牛血清免疫兔的抗血清 辣根过氧化酶－羊抗兔IgG（1﹕500稀释） TBS缓冲液：20mM Tris-HCl,500mM NaCl, pH:7.5 TTBS缓冲液：TBS缓冲液加0.05% Tween-20 封闭液：0.5% 鸡卵清蛋白－TBS 底物溶液：临用前配制0.1M柠檬酸6.1ml；0.2M Na2HPO4.12H2O 6.4ml；蒸馏水12.5ml；邻苯二胺10mg。溶解后，临用前再加30% H2O2，40μl。 转移缓冲液：25mM Tris，192mM Glycine，20% Methanol，pH：8.3 器材： 电转移槽 电泳仪电源：直流稳压，500V，150mA。 Immunoblotting The electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gels (SDS-PAGE) to sheets of nitrocellulose was initially referred to as “Western” blotting. In order to avoid this geographical jargon, the term immunoblotting is used. REAGENS AND EQUIPMENT 1. 48mM Tris, 39mM glycine, 0.0375% w/v SDS (Transfer Buffer). 2. Phosphate buffered saline with 0.05% Tween 20 (PBS-T) (Sigma Product No. P 3563) 3. Bovine serum albumin (BSA) (Sigma Product No. A 9647). Nitrocellulose (NC) membrane 0.45 ?m pore size (Sigma Product No. N 8142). 0.2 ?m nitrocellulose membrane may be used for low molecular weight molecules. 5. Blotting paper (Sigma Product No. P 4431). 6. Primary antibody of choice. 7. Alkaline phosphatase conjugated secondary antibody. 8. SIGMA FASTTM BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate Tablets (Sigma Product No. B 5655 or B 1911). 9. Minigel System (Sigma Product No. B 2157). 10. 2000 volt Power Supply (Sigma Stock No. PS2000-1). 11. Semi-dry Blotter (Sigma Product No. B 2529). PROCEDURE SDS-PAGE 1. Carry out SDS-PAGE (cassette size approx. 80 x 80 mm). For analytical runs, load 5-20 micrograms of protein per well; for preparatory purposes, use 600-800 micrograms of total cell or tissue homogenate per gel. Apply constant voltage at 200V or 1-2 hours until the tracking dye migrates 1.0cm from the gel end. Protein Blotting Build the transfer “sandwich” onto the anode (-) plate as follows: 4 sheets blotting paper soaked in Transfer Buffer (10 min) Gel soaked in Transfer Buffer (10 min) NC membrane pre-wet with Methanol (1 min), then soaked in Transfer Buffer(10 min) 4 sheets blotting paper soaked in Transfer Buffer (10 min) Carry out the transfer at 0.8mA per cm2 of gel area for about 2 hours at room temperature. Immuno-Detection Remove the NC membrane (blot) from the apparatus, block NC blot using 5% w/v BSA in PBS, overnight at 40C or 2 hours at room temperature. Overlay the blot with 5 ml primary antibody at appropriate dilution (generally 1:50-1:500). Incubate for 2 hours at room temperature on shaker. Wash the NC blot three times for 5 min with PBS-T. Incubate the blot for 1.5 hour at room temperature in Alkaline Phosphatase Secondary Antibody Conjugate at an appropriate dilution (1:30,000) in PBS-T. Wash the blot as in step 3. Prepare SIGMA FASTTM BCIP/NBT Tablets according to package directions. Incubate the NC blot in the substrate mixture for 10-30 min until color development. Stop reaction by washing the blot in distilled water. Dry the blot on filter paper and store in the dark in a plastic sleeve. IMMUNOLOGICAL TECHNIQUES For recognizing and quantifying antigens in tissues or fluids many immunological techniques utilize the exquisite specificity of the antigen-antibody bond. 2. Cell populations can be identified and characterized by their surface markers, using the techniques of immunofluorescence or immunohistochemistry. Cell populations can be isolated according to their surface markers, by techniques which include fluorescence-activated cell sorting (FACS), panning and density-dependent centrifugations. The principle assays for lymphocyte function are by antibody or cytokine production, by proliferation in response to antigen, or by cytotoxicity. *ANTIGEN-ANTIBODY INTERACTION Precipitation reactions Haemagglutination and complement fixation Direct and indirect immunofluorescence Immunoassay Immunoblotting and immunoprecipitation *ISOLATION OF PURE ANTIBODIES Monoclonal antibody production *ASSAYS FOR COMPLEMENT *ISOLATION OF LYMPHOCYTE POPULATIONS *EFFECTOR-CELL ASSAYS Lymphocyte migration *GENE TARGETING AND TRANSGENIC ANIMALS 1.Transgenic animals 2.Gene targeting Ouchterlony immunodiffusion Antisera were sometimes tested or antigens detected by Ouchterlony (double radial immunodiffusion) (Clausen, 1969). A 1% agarose gel, 2-3mm thick was poured in a 9cm Petri dish, in the buffer PBS-5mM EDTA. Wells, 3-7mm diameter and < 1.5cm apart, centre-to-centre were punched in the agarose, and antigens (generally at 50??g/ml or greater concentration) were placed in some wells, and antisera (undiluted) in others, samples were allowed to diffuse and form antibody-antigen precipitates for 16h or more at room temperature. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) All procedures were performed at room temperature, unless otherwise stated. To demonstrate the presence of antigen of interest, microtitre plates (Polysorp, Nunc, Kamstrup, Roskilde, Denmark) were prepared by coating each well with 100 ?l of sample containing antigen (approximately 0.5-50 ?g total protein) in coating buffer (0.1M NaHCO3 , pH 9.6) and left overnight at 4oC. The well were first washed once with PBS and then three times with PBS-0.1% w/v Tween-20 (PBS-Tween). Non-specific binding was blocked by coating the whole plate for 30 min with PBS-Tween. The wells were then incubated for 2h with 100 ?l of the specific primary antibody, diluted in PBS-Tween. After washing, 100 ?l of appropriate second antibody alkaline phosphatase conjugate was added and incubated for 2h. Second antibody conjugates were purchased from Sigma, and used at the manufacturer’s recommended concentration. Following further washing with PBS-Tween to remove unbound conjugate, wells were developed by incubation for 30 min in the dark with 100 ?l p-nitrophenyl phosphate substrate (1 mg/ml in 0.2M Tris-HCl, pH 8.0) (pNpp) (Sigma). The absorbancies were read at 405nm using a Titertek Multiscan Plus microtitre plate reader (Helsinki, Finland). Western blotting and ECL detection Western blotting: Proteins to be immunoblotted were run on SDS-PAGE. The gels were removed from the apparatus immediately after electrophoresis, rinsed with 48mM Tris, 39mM glycine, 0.0375% w/v SDS and proteins were electroblotted on to Immobilon P membranes (Millipore) in an LKB 2117 Multiphor II electrophoresis unit. General procedures followed those of Towbin et al.(1979). Electroblotting was carried out at 0.8mA per cm2 of gel area for about 2h. Nonspecific binding sites on Immobilon P membranes were blocked after electroblotting by incubating membranes for 1h at room temperature or overnight at 4 0 C in PBS containing 0.1% w/v Tween 20(PBS-Tween), and 25mg/ml BSA. After electroblotting, the gels were stained with Coomassie Brilliant Blue to assess the extent of protein transfer. Strips from the Immobilon P membranes corresponding to the tracks on the gel were incubated with appropriate first antibodies in PBS-Tween for 2h at room temperature. After washing 5 times for 10 min with PBS-Tween, the membrane strips were incubated with appropriate second antibodies conjugated to alkaline phosphatase (Sigma), for 2h at room temperature. Following extensive washing with PBS-Tween, the blot strips were developed in BCIP/NBT substrate (Sigma). In the later stages of this work, blots were developed with greater sensitivity, using ECL (enhanced chemiluminescence) kits from Amersham. These kits included HRP (horseradish peroxidase)-conjugated second antibodies.