生物化学实验讲义（考研资料）：实验九 酵母蔗糖酶(最后)

实验九 酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶（invertase）（(—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的(—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 两种酶的性质对照表如下： 名称  MW  糖含量  亚基 底物为蔗糖的 Km 底物为棉子糖的Km  等电点 pI  最适 pH  稳定 pH 范围  最适温度   外酶  27万(22万)  50%  双  26mM  150 mM  5.0  4.9(3.5～5.5)  3.0～7.5  60℃   内酶  13.5万  ＜3%  双  25mM  150 mM   4.5(3.5 ～5.5)  6.0～9.0    实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。 本实验共有九个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 四、反应时间对产物形成的影响 五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定 六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 （一） 蔗糖酶的提取与部分纯化 一、实验目的： 学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。 二、试剂： 1. 啤酒酵母 2. 二氧化硅 3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下） 4. 去离子水（使用前冷至4℃左右） 5. 冰块、食盐 6. 1N乙酸 7. 95%乙醇 三、仪器： 1. 研钵1个 2. 离心管3个 3. 滴管3个 4. 量筒50ml 1个 5. 水浴锅1个 6. 恒温水浴 7. 烧杯100ml 2个 8. 广泛pH试纸 9. 高速冷冻离心机 四、操作步骤： 1. 提取 （1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要予先研细。 （3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。 （6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。 （7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。 （8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。 2. 热处理 （1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。 （2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。 （3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。 3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。于4℃，10000rpm，离心10min，倾去上清，并滴干，沉淀保存于离心管中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。 废弃上清液之前，要用尿糖试纸检查其酶活性（于下一个实验一起做）。 （二）离子交换柱层析纯化蔗糖酶 一、试剂 1. DEAE纤维素：DE-23 1.5克 2. 0.5N NaOH 100ml 3. 0.5 N HCL 50ml 4. 0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液250ml 5. 0.02 mol/L pH7.3（含0.2 mol/L浓度NaCl）的Tris-HCl缓冲液 50ml 二、仪器 1. 层析柱 2. 部分收集器 3. 磁力搅拌器及搅拌子 4. 50ml小烧杯2个 5. 玻璃砂漏斗 6. 真空泵与抽滤瓶 7. 精密pH试纸或pH计 8. 三通管 9. 止水夹 10. 吸耳球 11. 塑料紫外比色杯 12. 电导率仪 13. 尿糖试纸 14. 点滴板 三、操作步骤 离子交换剂的处理： 称取1.5克DEAE纤维素（DE-23）干粉，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，再用0.5 mol/L NaOH重复处理一次，用去离子水洗至近中性后，抽干备用。（因DEAE纤维素昂贵，用后务必回收）。实际操作时，通常纤维素是已浸泡过回收的，按“碱→酸”的顺序洗即可，因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5 mol/L NaOH－0.5 mol/L NaCl 溶液处理，然后水洗至中性。 装柱与平衡： 先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液洗纤维素几次，用滴管吸取烧杯底部大颗粒的纤维素装柱，然后用此缓冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。 上样与洗脱： 上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采用20ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液和20ml含0.2M浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml小烧杯，一个装20ml含NaCl的高离子强度溶液，另一个装入20ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器上，在低离子强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在细塑料管内放入一小段铁丝，两端用酒精灯加热封口），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸耳球小心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用5ml 0.02mol/L pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解醇级分Ⅲ，（注意玻璃搅棒头必须烧园、搅拌溶解时不可将离心管划伤），若溶液混浊，则用小试管，4000rpm离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分Ⅲ样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含量），将剩余的3.5ml清液小心地加到层析柱上，不要扰动柱床，注意要从上样开始使用部分收集器收集，每管2.5~3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入口的细塑料导管放入不含NaCl的低离子强度溶液的小烧杯中，用胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽后，为洗脱充分，也可将所配制的剩余30ml高离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.5~3.0ml/10min。 测定每管洗脱液的A280光吸收值和电导率。（使用DJS-10电导电极） 测定不含NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液和含0.2mol/L浓度NaCl的0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液的电导率，用电导率与NaCl浓度作图，利用此图将每管所测电导率换算成NaCl浓度，并利用此曲线估计出蔗糖酶活性峰洗出时的NaCl浓度。 4. 各管洗脱液酶活力的定性测定 在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5分钟，在每一孔内同时插入一小条尿糖试纸，10～20min后观察试纸颜色的变化。用“+”号的数目，表示颜色的深浅，即各管酶活力的大小。合并活性最高的2~3管，量出总体积，并将其分成10份，分别倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管。此即“柱级分IV”。 注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。 在同一张图上画出所有管的酶活力，NaCl浓度（可用电导率代替）和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。 （三）蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 一、实验目的 掌握蔗糖酶活性测定方法，了解各级分酶的纯化情况。 二、原理 为了评价酶的纯化步骤和方法，必须测定各级分酶活性和比活。 测定蔗糖酶活性的方法有许多种，如费林试剂法、Nelson’s试剂法、水杨酸试剂法等，本实验先使用费林试剂法，以后测米氏常数Km和最大反应速度Vmax时再用Nelson’s试剂法。 费林试剂法灵敏度较高，但数据波动较大，因为反应后溶液的颜色随时间会有变化，因此加样和测定光吸收值时最好能计时。其原理是在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。这些具有还原性的糖与碱性铜试剂混合加热后被氧化，二价铜被还原成棕红色氧化亚铜沉淀，氧化亚铜与磷钼酸作用，生成兰色溶液，其兰色深度与还原糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。 三、试剂 1. 碱性铜试剂（用毕回收） 称10g无水NaCO3 ,加入100ml去离子水溶解，另称1.88g酒石酸，用100ml去离子水溶解，混合二溶液，再加入1.13克结晶CuSO4，溶解后定容到250ml。 2. 磷钼酸试剂（用毕回收） 在烧杯内加入钼酸17.5g，钨酸钠2.5g，10% NaOH 100ml, 去离子水100ml，混合后煮沸约30min（小心不要蒸干），驱去钼酸中存在的氨，直到无氨味为止，冷却后加85%磷酸63ml,混合并稀释到250ml。 3. 0.25%苯甲酸200ml，配葡萄糖用，防止时间长溶液长菌，也可以用去离子水代替。 4. 葡萄糖标准溶液： （1）贮液：精确称取无水葡萄糖（应在105℃恒重过）0.1802克，以0.25%苯甲酸溶液溶解后，定容到100ml容量瓶中（浓度10mmol/L）。 （2）操作溶液：用移液管取贮液10ml，置于50ml容量瓶中，以用0.25%苯甲酸或去离子水稀释至刻度（浓度为2mmol/L）。 5. 0.2mol/L蔗糖溶液50ml，分装于小试管中冰冻保存，因蔗糖极易水解，用时取出一管化冻后摇匀。 6. 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9，200ml。 7. 牛血清清蛋白标准蛋白质溶液（浓度范围：200～500(g/ml，精确配制50ml）。 8. 考马斯亮兰G-250染料试剂，100mg考马斯亮兰G-250全溶于50ml 95%乙醇后，加入120ml 85%磷酸，用去离子水稀释到1L（公用）。 四、仪器 1. 试管20支，试管架1个 2. 秒表1块，或用手表。 3. 移液管：0.1、0.2、2.0、5.0ml 4. 塑料可见比色杯（杯上和器皿染色后可用少量95% 的乙醇荡洗） 5. 水浴锅 6. 电炉 7. 保鲜膜 8. 橡皮筋 五、各级分蛋白质含量的测定 采用考马斯亮兰染料法（Bradford法）的微量法测定蛋白质含量，参见 实验－“蛋白质含量的测定法”（因Tris会干扰Lowry法的测定）。标准蛋白的取样量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0ml，用去离子水补足到1.0ml。 各级分先要仔细寻找和试测出合适的稀释倍数，并详细记录稀释倍数的计算（使用移液管和量筒稀释）。下列稀释倍数仅供参考： 粗级分 I： 10～50倍 热级分II： 10～50倍 醇级分III： 10～50倍 柱级分IV： 不稀释 确定了稀释倍数后，每个级分取3个不同体积的样进行测定，然后取平均值，计算出各级分蛋白质浓度。 六、级分I、II、III蔗糖酶活性测定 用0.02mol/L pH4.9乙酸缓冲液（也可以用pH5～6的去离子水代替）稀释各级分酶液，试测出测酶活合适的稀释倍数： I ： 1000～10000倍 II ： 1000～10000倍 III ： 1000～10000倍 以上稀释倍数仅供参考。 按“表1”的顺序在试管中加入各试剂，进行测定，为简化操作可取消保鲜膜封口，沸水浴加热改为用90～95℃水浴加热8～10min。 七、柱级分IV酶活力的测定 1. 酶活力的测定参照“表1”设计一个表格，反应混合物仍为1ml。 2. 第1管仍为蔗糖对照，9、10管为葡萄糖的空白与标准，与“表1”中的11、12管相同。 3. 2～7管加入柱级分IV（取样前先试测出合适的稀释倍数），分别为0.02 ml、0.05 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.4 ml和0.6ml，然后各加0.2ml乙酸缓冲液（0.2mol/L pH4.9），每管用去离子水补充到0.8ml。 4. 1~7管各加入0.2 ml 0.2mol/L的蔗糖，每管由加入蔗糖开始计时，室温下准确反应10min，立即加入1ml碱性铜试剂中止反应，然后按“表1”中的步骤进行测定。 5. 第8管为0时间对照，与第7管相同，只是在加入0.2ml蔗糖之前，先加入碱性铜试剂，防止酶解作用。此管只用于观察，不进行计算。 6. 计算柱级分IV的酶活力： Units / ml原始溶液。 7. 以每分钟生成的还原糖的(moles数为纵座标，以试管中1ml反应混合物中的酶浓度（mg蛋白/ml）为横座标，画出反应速度与酶浓度的关系曲线。 表 1 级分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的酶活力测定 各管名称→ 对照  粗级分Ⅰ  热级分Ⅱ  醇级分Ⅲ 葡萄糖   管数→  1  2 3 4  5 6 7  8 9 10 11 12  酶液(ml)  0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / /  H2O(ml)  0.6 0.55 0.40 0.10 0.05 0.20 0.10 0.55 0.40 0.10 1.0 0.8  乙酸缓冲液 (0.2mol/L pH4.9)  0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /  葡萄糖2mmol/L  / / / / / / / / / / / 0.2  蔗糖0.2mol/L  0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /    加入蔗糖，立即摇匀开始计时，室温准确反应10min后，立即加碱性铜试剂中止反应。  碱性铜试剂  1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0    用保鲜膜封口，扎眼，沸水浴加热8min，立即用自来水冷却。  磷钼酸试剂  1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0   H2O  5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0   A650nm   E’=μmol/min·ml   平均E’ μmol/min·ml   Units/ml原始组分    稀释后酶液的活力(按还原糖计算)： 式中： A650 ──第2~10管所测A650 A’650──第12管所测A650 0.2 ── 第12管葡萄糖取样量 2 ── 标准葡萄糖浓度2mmol/L = 2μmol/ml 10 ──反应10min B ──每管加入酶液ml数 原始酶液的酶活力 E = (平均E’/2)×稀释倍数（Units / ml原始组分） 八、计算各级分的比活力，纯化倍数及回收率，并将数据列于下表： 为了测定和计算下面纯化表中的各项数据，对各个级分都必须取样，每取一次样，对于下一级分来说会损失一部分量，因而要对下一个级分的体积进行校正，以使回收率的计算不致受到不利的影响。 酶的纯化表如下： 级分  记录体积 (ml)  校正体积 (ml)  蛋白质 (mg/ml)  总蛋白(mg)  Units/ml  总 Units  比活 Units/mg  纯化倍数  回收率%   Ⅰ         1.0  100   Ⅱ            Ⅲ            Ⅳ            ［注］：一个酶活力单位Units，是在给定的实验条件下，每分钟能催化1(mole蔗糖水解所需的酶量，而水解1(mole蔗糖则生成2(moles还原糖，计算时请注意。 下面是对假定的各级分记录体积进行校正计算的方法和结果： 级分 记录体积 ml  核正体积计算  取样体积 ml 校正后体积 ml   Ⅰ  15  15  1.5  15.00   Ⅱ  13.5  13.5×(15/13.5)  1.5  15.00   Ⅲ  5  5×(15/13.5)×(13.5/12)  1.5  6.25   Ⅳ  6  6×(15/13.5)×(13.5/12)×(5/3.5 )  ──  10.71   （四） 反应时间对产物形成的影响 酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。下面将通过一系列实验，研究pH、温度和不同的抑制剂对蔗糖酶活性的影响，测定蔗糖酶的最适pH、最适温度、蔗糖酶催化反应的活化能，测定米氏常数Km、最大反应速度Vmax和各种抑制剂常数KI ，由此掌握酶动力学性质分析的一般实验方法。 本实验是以蔗糖为底物，测定蔗糖酶与底物反应的时间进程曲线，即在酶反应的最适条件下，每间隔一定的时间测定产物的生成量，然后以酶反应时间为横座标，产物生成量为纵座标，画出酶反应的时间进程曲线，由该曲线可以看出，曲线的起始部分在某一段时间范围内呈直线，其斜率代表酶反应的初速度。随着反应时间的延长，曲线斜率不断减小，说明反应速度逐渐降低，这可能是因为底物浓度降低和产物浓度增高而使逆反应加强等原因所致，因此测定准确的酶活力，必须在进程曲线的初速度时间范围内进行，测定这一曲线和初速度的时间范围，是酶动力学性质分析中的组成部分和实验基础。 实验方法见“表2”： 1. 准备12支试管，按“表2”进行测定。用反应时间为0的第一管作空白对照，此试管要先加碱性铜试剂后加酶。第10支试管是校正蔗糖的酸水解。用第11管作为对照，测定第12管葡萄糖标准的光吸收值，用以计算第2～9各测定管所生成还原糖的“(moles”数。 2. “表2”中底物蔗糖的量为每管0.25 (moles，全部反应后可产生0.5(moles的还原糖，所有的蔗糖和酶浓度应使底物在20min内基本反应完。 3. 画出生成的还原糖的(moles数（即产物浓度(moles/ml）与反应时间的关系曲线，即反应的时间进程曲线，求出反应的初速度。 表 2 反应时间对产物浓度的影响 管数→  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12  2.5mmol/L蔗糖 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 / /  乙酸缓冲液 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /   H2O 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.7 1.0 0.8  葡萄糖2mmol/L  / / / / / / / / / / / 0.2  碱性铜试剂 1.0 / / / / / / / / / / /    由加酶开始计时  蔗糖酶(~1:5) 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 / / /  反应时间min 0 1 3 4 8 12 20 30 40   反应到时后立即向“2～12”管加入1ml碱性铜试剂中止反应  碱性铜试剂  / 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0    盖薄膜，扎孔，沸水浴上煮8min后速冷  磷钼酸试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0   H2O 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0   测定A650   生成还原糖的 (moles数    （五）pH对蔗糖酶活动性的影响 酶的生物学特性之一是它对酸碱度的敏感性，这表现在酶的活性和稳定性易受环境pH的影响。 pH对酶的活性的影响极为显著，通常各种酶只在一定的pH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH值下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。各种酶在特定条件下都有它各自的最适pH。在进行酶学研究时一般都要制作一条pH与酶活性的关系曲线，即保持其它条件恒定，在不同pH条件下测定酶促反应速度，以pH值为横座标，反应速度为纵座标作图。由此曲线，不仅可以了解反应速度随pH值变化的情况，而且可以求得酶的最适PH。 酶溶液pH值之所以会影响酶的活性，很可能是因为它改变了酶活性部位有关基团的解离状态，而酶只有处于一种特殊的解离形式时才具有活性，例如： H＋ H＋ EH2＋ ＋ EH E－ pKa1 (有活性) pKa2 酶的活性部位有关基团的解离形式如果发生变化，都将使酶转入“无活性”状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适合于酶与底物的作用。此外，缓冲系统的离子性质和离子强度也会对酶的催化反应产生影响。 蔗糖酶有两组离子化活性基团，它们均影响酶水解蔗糖的能力。其解离常数分别是 pKa = 7和pKa =3 。 实验方法： 按下表配制12种缓冲溶液（公用）： 将两种缓冲试剂混合后总体积均为10ml，其溶液pH值以酸度计测量值为准。 溶液pH  缓冲试剂 体积ml  缓冲试剂 体积ml   2.5 0.2mol/L磷酸氢二钠  2.00 0.2mol/L柠檬酸  8.00   3.0 0.2mol/L磷酸氢二钠  3.65 0.2mol/L柠檬酸  6.35   3.5 0.2mol/L磷酸氢二钠  4.85 0.2mol/L柠檬酸  5.15   3.5 0.2mol/L乙酸钠  0.60 0.2mol/L乙酸  9.40   4.0 0.2mol/L乙酸钠  1.80 0.2mol/L乙酸  8.20   4.5 0.2mol/L乙酸钠  4.30 0.2mol/L乙酸  5.70   5.0 0.2mol/L乙酸钠  7.00 0.2mol/L乙酸  3.00   5.5 0.2mol/L乙酸钠  8.80 0.2mol/L乙酸  1.20   6.0 0.2mol/L乙酸钠  9.50 0.2mol/L乙酸  0.50   6.0 0.2mol/L磷酸氢二钠  1.23 0.2mol/L磷酸二氢钠  8.77   6.5 0.2mol/L磷酸氢二钠  3.15 0.2mol/L磷酸二氢钠  6.85   7.0 0.2mol/L磷酸氢二钠  6.10 0.2mol/L磷酸二氢钠  3.90   2. 准备二组各12支试管，第一组12支试管每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，然后加入一定量的蔗糖酶（此时的蔗糖酶只能用H2O稀释，酶的稀释倍数和加入量要选择适当，以便在当时的实验条件下能得到0.6~1.0的光吸收值（A650））。另一组12支试管也是每支都加入0.2ml上表中相应的缓冲液，但不再加酶而加入等量的去离子水，分别作为测定时的空白对照管。所有的试管都用水补足到0.8ml。 3. 所有的试管按一定时间间隔加入0.2ml蔗糖（0.2mol/L)开始反应，反应10min后分别加入1.0ml碱性铜试剂，用保鲜膜包住试管口并剌一小孔，在沸水浴中煮8分钟，取出速冷，分别加入1.0ml磷钼酸试剂，反应完毕后加入5.0ml水，摇匀测定A650。 4. 本实验再准备二支试管，一支用水作空白对照；另一支作葡萄糖标准管。 5. 画出不同pH下蔗糖酶活性（(moles/min）与pH的关系曲线，注意画出pH值相同，而离子不同的两点，观察不同离子对酶活性的影响。 （六）温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。温度对酶的作用具有双重影响，一方面温度升高会加速酶反应速度；另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，因此，在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，在一系列不同的温度下测定酶活力，即可得到温度～酶活性曲线，并得到酶反应的最适温度。最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。例如反应时间延长，最适温度将降低。大多数酶在60℃以上变性失活，个别的酶可以耐100℃左右的高温。本实验除了测定蔗糖酶催化蔗糖水解反应的热稳定温度范围与最适温度外，还可以同时测定反应的活化能。活化能越低，反应速度就越快。酶作为催化剂可以大大降低反应的活化能，从而大大增加反应的速度。本实验除了测定蔗糖酶催化反应的活化能外，还要测定酸催化这一反应的活化能，后者比前者要大的多，说明酸催化的能力远不及蔗糖酶。 活化能可用阿累尼乌斯方程式计算： 式中： Ea为话化能（Cal/mole），k为反应速度常数（(moles/min），R为气体常数（1.987Cal/deg﹒mole），T为绝对温度（℃+273），A为常数。 本实验中的速度常数“k”，可以直接用所测定的吸光度值或反应速度v代替，进行作图和计算，请对此进行推导和论证（提示：蔗糖酶催化蔗糖底物水解的反应是一级反应）。 实验方法： 本实验要测定0℃～100℃，之间16个不同温度下蔗糖酶催化和酸催化的反应速度。这16个温度是冰水浴的0℃，室温（约20℃），沸水浴的100℃和13个水浴温度：10℃、30℃、40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、 95℃。 每个温度准备2支试管，一支加酶，测酶催化，1支不加，以乙酸缓冲液作为酸，测酸催化。 1. 确定酶的稀释倍数，试管中加入0.2ml 0.2mol/L pH4.9的乙酸缓冲液，0.2ml稀释的酶，加水至0.8ml 加入0.2ml 0.2mol/L的蔗糖开始计时，在室温下反应10min，仍用费林试剂法进行测定，须得到0.2～0.3A的吸光度，准备一个水的空白对照管（0.8ml去离子水加0.2ml 0.2mol/L的蔗糖），用于测定所有的样品管。 2. 测定上列各个温度下的反应速度，每次用2支试管，均加入0.2ml乙酸缓冲液，一支加0.2ml酶，另一支不加酶，均用水调至0.8ml，放入水浴温度下使反应物平衡30秒，加入0.2mol/L蔗糖0.2ml，准确反应10分钟，立即加入1.0ml碱性铜试剂中止反应，按规定进行操作，测定各管A650值，记录每个水浴的准确温度。 3. 酶催化的各管A650 值均进行酸催化的校正。用分别画出酶催化和酸催化的反应速度对温度的关系曲线和lnk～1/T的关系曲线，用二条lnk～1/T关系曲线的线性部分计算两种活化能。 （文献值：蔗糖酶催化蔗糖水解的活化能为：Ea=8000Cal/mole 酸催化蔗糖水解的活化能为：Ea=25000Cal/mole） 4. 计算温度系数Q10，即温度每升高10℃，反应速度提高的倍数： 请推导计算公式： （七）底物浓度对催化反应速度的影响及来米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定 根据Michaelis-Menten?方程： 可以得到Lineweaver-Burk双倒数值线方程： 在 1/V 纵轴上的截距是1/Vmax ，在1/［S］横轴上的截距是－1/Km。 测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本内容之一，Km是酶的一个基本的特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km值越大，说明酶与底物的亲和力越弱，反之，Km值越小，酶与底物的亲和力越强。 双倒数作图法应用最广泛，其优点是：① 可以精确地测定Km 和Vmax；② 根据是否偏离线性很容易看出反应是否违反Michaelis-Menten动力学；③ 可以较容易地分析各种抑制剂的影响。此作法的缺点是实验点不均匀，V小时误差很大。为此，建议采用一种新的Eisenthal直线作图法，即将Michaelis-Menten方程改变为： 作图时，在纵轴和横轴上截取每对实验值：V1～［S］1；V2～［S］2；V3～［S］3； ——连接诸二截点，得多条直线相交于一点，由此点即可得Km和Vmax。 此作图法的优点是：① 不用作双倒数计算；② 很容易识别出那些不正确的测定结果。 还可以用Hanes方程进行作图，斜率是1/Vmax，截距分别是－Km和Km/Vmax : 实验方法： 1. 本实验和下一个实验均采用 Nelson's法分析反应产物还原糖，Nelson's法的试剂配制见本实验最后第 页的“试剂配制方法”。因为使用了剧毒药品，操作必须十分仔细小心！为了掌握Nelson's法测定的范围，可先作一条标准曲线。按下面的“表３”进行实验操作： Eisenthal直线作图法： 表 ３ Nelson’s法测定葡萄糖的标准曲线  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10  葡萄糖(4mmol/L) 果糖(4mmol/L) 蔗糖(4mmol/L) H2O Nelson’s试剂 砷试剂 H2O  / 0.02 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 / / / / / / / / / / 0.20 / / / / / / / / / / 0.20 1.0 0.98 0.95 0.90 0.85 0.80 0.75 0.70 0.80 0.80 1.0 盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷 1.0 充分混合，除气泡，放置5min 7.0 旋涡混合器上充分混合  每管中糖的(moles数    A510    用第1管作空白对照，测定其余各管 510nm 的吸光度A510。用A510值对还原糖的(mole数作图。 2. 按下面的“表4”测定不同底物浓度对催化速度的影响。（表4见下页） 为使Km测准，必须先加蔗糖，精确移液，准确计时，每隔30秒钟 或1分钟加酶一次，加酶后要摇动一下试管，每支试管都要保证准确反应10分钟，然后加1.0ml Nelson's试剂，立即用保鲜膜盖住管口，绕上橡皮筋，用针剌一小孔，几根试管用一根橡皮筋套住放入沸水浴，煮20分钟后取出放入冷水中速冷。加砷试剂时移液管身不要接触试管壁。最后加7.0ml H2O以后，要充分摇匀，必要时可用一小块保鲜膜盖住管口，反复倒转试管，混匀。用塑料比色杯测定时，空白对照管溶液必须充分摇匀，彻底除去气泡，测A510值时要检查参比杯内壁上是否有气泡，若有，须倒回原试管，再摇动除去残余气泡。 实验中不允许用嘴吸砷试剂。实验完毕后要注意洗手。 3. 第9、10二管是先加中止反应的Nelson's试剂，后加酶，以保证加酶后不再产生任何还原糖，用以校正蔗糖试剂本身的水解和酸水解。用第 9、10二管的数据画一直线，求出其他各管的校正数据，对所测各管的A510值进行校正，然后计算每管的[S]，1/[S]，V和1/V。 4. 画出反应速度V与底物浓度[S] 的关系图，（米氏曲线）和1/V~1/[S]双倒数关系图，（不要直接用A510值作图），计算Km和Vmax，并与文献值进行比较。 表 4 底物浓度对酶催化反应速度的影响（Km 和Vmax测定表） 管数→ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12  0.5mol/L蔗糖 / 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.10 0.20 0.10 0.20 / /   H2O 0.6 0.58 0.57 0.56 0.54 0.52 0.50 0.40 0.50 0.40 1.0 0.8  乙酸 缓冲液  0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /  Nelson’s试剂  / / / / / / / / 1.0 1.0 / /  *蔗糖酶 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / /  葡萄糖4mmol/L  / / / / / / / / / / / 0.2   由加酶开始准确计时，反应10min。  Nelson’s试剂  1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 / / 1.0 1.0   盖薄膜，扎孔，沸水浴中煮20min后速冷  砷试剂 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0   充分混合，除气泡，放置5min   H2O 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0 7.0   旋涡混合器上充分混合   A510   校正值   校正后 A510    ［S］    1/［S］    V    1/V   *：表4中酶的稀释倍数需仔细试测，使第2管的A510值达到0.2~0.3，以便能同时适用于下面的脲抑制实验。 催化反应速度的计算： V : 每ml反应液，每min消耗掉的蔗糖底物的μmol数 A’510 : 第12管的吸光度值，以11管为参比 0.2×4 : 4μmol/ml 葡萄糖取0.2ml 10 : 反应10min 2 : 每μmol蔗糖水解成2μmol还原糖 （八）尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验 抑制剂与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，引起酶活力下降。根据抑制剂与酶给合的特点可分为可逆与不可逆抑制剂。可逆抑制剂与酶是通过共价健结合，不能用透析等物理方法解除。这二种抑制剂类型可以通过实验进行判断。实验方法为：在固定抑制浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与抑制剂结合，并测定反应速度。以反应速度对酶浓度作图，根据曲线的特征即可判断之。如下图所示： 在可逆抑制类型中可分为竞争性抑制，非竞争性抑制和反竞争性抑制三种： 1. 竞争性抑制： 在竞争性抑制中，酶既可以与底物结合，又可以与抑制剂结合，但却不能与二者同时结合，即有ES和EI，而不存在ESI。其动力学特征是表观值Km'增加，而最大反应速度Vmax 不变，公式为： 表观米氏常数Km’为： 已知抑制剂浓度 [I] ，由斜率计算出抑制剂常数KI，即可算出表观米氏常数Km’。 2. 非竞争性抑制： 在非竞争性抑制中，酶可以与底物和抑制剂同时结合，形成EIS，但EIS不能进一步转变为产物。其动力学特征是Vmax 降低而Km不变，公式为： 表观最大反应速度Vmax’为： 已知 [I] ，由斜率计算出KI，即可计算出表观Vmax’。 实验方法： 1. 判断可逆与不可逆抑制的实验可选做。 2. 不含抑制剂（脲）的实验，可用实验（七）的数据，但必须是用同一稀释倍数的酶，也可以重做，注意酶浓度要大些。 3. 含脲抑制剂的实验可参照“表4”设计实验方案。共做三种抑制剂浓度 [I] 的实验，即分别为加4mol/L的脲0.10ml 、0.20ml 和0.30ml，（注意：此时要分别少加H2O 0.1ml 、0.2ml和 0.3ml），仍为12支试管，每支试管都要加脲，第9、10两管仍为校正酸水解。第11、12标准管也要加脲，以消除脲对显色的影响。 4. 画出反应速度与底物浓度的关系图，和I/V~I/[S]关系图，计算Km、Vmax 、KI和相应的表观值，讨论脲对蔗糖酶活性的影响。 （九）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验 棉子糖是一种非还原性三糖，与蔗糖有相似的结构： 蔗糖酶水解棉子糖，可得到双糖（密二糖）和单糖（果糖），果糖是还原糖。棉子糖水解的速度可以用所生成的还原糖来进行测定，由于本实验是要测定棉子糖和果糖对蔗糖酶水解蔗糖的抑制作用，为了排除果糖的干扰，就要选用一种专一地特异性测定葡萄糖的方法，本实验采用葡萄糖氧化酶法来测定反应中生成的葡萄糖。这一方法的反应如下： 葡萄糖氧化酶 Glucose + H2O H2O2 + Gluconic acid Glucose Oxidase 过氧化物酶 H2O2 + o－Dianiside + H+ H2O + Yellow pigment (Reduced dye) Peroxidase (Oxidized dye) 邻联茴香胺 黄色色素 反应生成的黄色色素与葡萄糖含量成正比，用分光光度法测定420nm的吸光度值A420。 葡萄糖氧化酶试剂的配制方法为： 溶液A：40mg辣根过氧化物酶（存于冰冻格）溶于1000ml 0.1mol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液，加1500单位葡萄糖氧化酶（每组学生150ml）（当日新鲜配制）（教师配） 溶液B：溶解0.66g o－DianisidediHCl邻联茴香胺染料于100ml H2O中(先用少量冰乙酸溶解后再加H2O)，置于棕色瓶冷藏。不可接触皮肤，是致癌物（教师配）。 使用时取“溶液A”100ml加“溶液B”1ml。（称G－O试剂） 表5 葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖的标准曲线  1 2 3 4 5 6 7  葡萄糖(2mmol/L) H2O G－O试剂 4N HCl  / 0.05 0.10 0.20 0.30 0.50 0.60 1.0 0.95 0.90 0.80 0.70 0.50 0.40 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 混合，室温下每管准确反应15min 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混合，至少放置5min   A420    葡萄糖(moles数    表 6 抑制剂（棉子糖与果糖）对酶活性的影响  1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (空白) (校 正)  0.5mol/L蔗糖 H2O 乙酸缓冲液 *蔗糖酶 G－O试剂 4N HCl  / 0.02 0.04 0.06 0.10 0.13 0.15 0.20 0.10 0.20 0.7 0.68 0.66 0.64 0.60 0.57 0.55 0.50 0.70 0.60 0.2 0.1 / / 室温下准确反应10min，立即放入沸水浴加热2min以中止反应，再立即放入冰浴速冷。 4.0 混合均匀，室温下准确反应15min。 0.1 混合均匀，室温放置5min。   A420    *：试测酶浓度时，0.1ml酶溶液应使第8管得到1.0左右的吸光度。 实验方法： 1. 测定葡萄糖的标准曲线 准备7支试管按上面“表5 ”中的步骤进行测定，用A420和葡萄糖的(moles数作图。 2. 棉子糖和果糖抑制作用的测定 （1）准备26支试管，试管1～10用上面“表6”所列的方法进行测定，第1管作空白对照，第9、10两管用作校正蔗糖的水解。 （2）试管11～18放入1～8管同样量的缓冲液和蔗糖，但还要加0.5ml 0.5mmol/L的棉子糖，然后用H2O补加到0.9ml，加0.1ml同样的酶溶液开始计时，详见“表6”，第11管为这一组的空白对照。 （3）试管19～26进行同样的操作，只是用0.5mol/L果糖代替棉子糖。 （4）用9、10管的数据修正各管的A420，计算各底物浓度[S]和反应速度V（(moles/nim ），画出三条V～[S]关系曲线，计算1/V和1/[S]，画出Lineweaver-Burk双倒数关系图。 （5）根据Lineweaver-Burk关系图评价抑制方式，并计算Km、Vmax由斜率计算棉子糖和果糖的KI，然后分别计算表观Km’。 （注：若室温较低，本实验可用恒温水浴恒温于25℃或30℃）。 附录： 试剂配制方法： 1. 1M乙酸：取5.8ml冰乙酸（17M）加H2O稀释至100ml。 2. 0.5M NaOH：称2g NaOH 溶于100 ml H2O。 3. 0.5M HCl: 取4.2 ml浓HCl（12M）加入H2O中，稀释到100 ml（注意必须是酸缓慢倒入水中，决不可反之）。 4. 0.02M pH7.3 Tris -HCl缓冲液： 先配0.1M Tris Buffer贮液：称1.21g Tris（三羟甲基氨基甲烷MW 121.1）加70 ml H2O溶解，再滴加4M HCl约21 ml，调pH=7.3，再加H2O至100ml。取此贮液50ml，加H2O 至250 ml。 5. 4M HCl：取166.7ml浓HCl (12M)，加H2O至500ml。 6. 0.02mol/L pH7.3 Tris -HCl缓冲液（含0.2mol/L浓度NaCl）： 称0.584g NaCl(MW 58.4）用0.02mol/L pH7.3的Tris -HCl缓冲溶液溶解，并定容到50ml。 7. 0.2mol/L Sucrose：称3.423g Sucrose(MW 342.3)加H2O溶解，定容到50 ml，分装在10个小试管中冰冻保存。 8. 0.2mol/L pH4.9乙酸缓冲液。 称2.461g无水乙酸钠（MW 82.03）溶于150 ml H2O，加约40~50 ml 0.2M乙酸，调pH=4.9，存于4℃冰箱，瓶口用薄膜封口。 9. 0.5mol/L Sucrose：称8.558g Sucrose，加H2O溶解，定容到50 ml，分装于小试管中，冰冻保存。 10. 5mmol/L Sucrose：取0.5mol/L Sucrose, 冲稀100倍。 11. 4mmol/L Glucose：取40ml 10mmol/L Glucose，加H2O 稀释至100ml，或称0.072g Glucose(MW 180.2)，加H2O溶解定容至100 ml。 12. 4mmol/L Fructose ：称0.072g Fructose(MW 180.2)加H2O溶解，定容至 100 ml。 13. 4mmol/L Sucrose：称0.137g Sucrose，加H2O溶解定容到100 ml，现用现配。 14. 0.2mol/L 柠檬酸C6H8O7·H2O（MW 210.14）：称4.203g溶于100 ml H2O。 15. 0.2mol/L乙酸：取1.18 ml冰乙酸（17M）或3.3 3ml 36% 乙酸（6M）加H2O至100 ml。 16. 0.2mol/L乙酸钠：称1.641g无水乙酸钠溶于 100 ml H2O。 17. 0.2mol/L磷酸二氢钠NaH2PO4·2H2O(MW 156.01)：称3.120g溶于100 ml H2O。 18. 0.2mol/L磷酸氢二钠Na2HPO4·12 H2O(MW 358.14)：称7.163g溶于100 ml H2O。 19. Nelson's试剂： （1）Nelson's A：称25.0g无水Na2CO3，25.0g酒石酸钾钠，20.0g NaHCO3 ，200.0g无水Na2SO4，缓慢溶于H2O，稀释至1000 ml。 （2）Nelson's B：称15.0g CuSO4·5H2O溶于H2O，加2滴浓H2SO4，用H2O稀释至100 ml，使用时，取50ml Nelson's A，加入2ml Nelson's B，此溶液易出结晶，可保存在高于20℃处，若出现结晶，可用温热水浴溶化之。 20. 砷试剂（偶氮砷钼酸盐试剂）（教师配）： 称50.0g钼酸铵，溶于900 ml H2O，搅拌下缓慢加入42 ml浓H2SO4，再称6.0g砷酸钠或砷酸氢二钠，溶于50 ml H2O，混合这两份溶液，加H2O至1000 ml，37℃保温24~48小时，室温暗处存于棕色塑料瓶。 21. 4mol/L尿素（脲）：称12 .01g (NH2)2CO (MW 60.06)，溶于30 ml H2O，加H2O稀释至50 ml。 22. 0.5mol/L棉子糖Raffinose： 称2.97g棉子糖（密三糖）（MW 594.53），溶于6 ml H2O，稍加热助溶，加H2O稀释至10 ml，当日新配，不可存于冰箱，否则易结晶析出。 23. 0.5mol/L果糖Fructose：称0.9g Fructose C6H12O6(MW 180.16)溶于H2O，稀释至10 ml，当日新配。 24. 0.1mol/L磷酸钠缓冲液：称15.6g NaH2PO4·2H2O溶于800 ml H2O，用10% NaOH调pH=7.0，加H2O至1000 ml，配G—O试剂用。