实验十 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 一、实验目的 1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。 2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。 二、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端 赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。 胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。 重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键 > 酰胺键 > 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过2～3次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 8000～10000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。 如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。 三、器材与试剂 （一）器材 1. 新鲜或冰冻猪胰脏 2. 食品加工机和高速分散器 3. 研钵 4. 大玻璃漏斗 5. 小塑料桶 6. 布氏漏斗 7. 抽滤瓶 8. 纱布 9. 恒温水浴 10. 紫外分光光度计 11. 秒表 12. pH试纸 （二）试剂 1. pH4～4.5乙酸酸化水 2. 2.5M H2SO4 3. 5M NaOH 4. 硫酸铵 5. 氯化钙 6. 2M NaOH 7. 0.8M，pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8M硼酸溶液，加80ml 0.2M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计检查校正。 8. 0.4M pH9.0硼酸缓冲液（用“7”稀释1倍即可） 9. 0.2M pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2M硼酸溶液，加30ml 0.5M四硼酸钠溶液，混合后，用pH计校正。 10. 2M HCl 11. 0.01M HCl 12. BAEE－0.15M pH8.0Tris－HCl 缓冲液（每毫升Tris缓冲液含0.11毫克BAEE和2.22毫克的氯化钙） 四、实验步骤 1. 猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏1.0公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入2倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.0～4.5）于10～15℃搅拌提取24小时，四层纱布过滤得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，放置3～4小时后用折迭滤纸过滤得黄色透明滤液（约1.5升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升滤液加492克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液，取样0.5ml后进行活化：慢慢加入研细的固体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使Ca2+与SO42-结合后，溶液中仍含有0.1M CaCl2，边加边搅拌，用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白酶轻轻搅拌，于室温下 活化8～10小时，（2～3小时取样一次，并用0.001M HCl稀释），测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约3500～4000BAEE单位）后，用2.5M H2SO4调pH至2.5～3.0，抽滤除去CaSO4沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋白质含量，按242克/升 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到0.4饱和度，放置数小时后，抽滤，弃去滤饼，滤液按250克/升 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到0.75， 放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用2M NaOH调pH至8.0，注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。 放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4～1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。 放置2～5天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对pH是否为8.0并及时调整。用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行重结晶：用约1倍的0.025M HCl，使上述结晶分散，加入约1.0～1.5倍体积的pH9.0 的0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0（准确）（体积过大，很难结晶），冰箱放置1～2天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母液回收)，冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。 2. 胰蛋白酶活性的测定 ⑴ 紫外法测定酶溶液的蛋白质含量 在280nm测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白质溶液的浓度（mg/ml）。 少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和Tris等无明显干扰作用。紫外法操作简便、快速，适合于制备过程中进行监测。 测定时将待测酶液用0.001M HCl稀至适当浓度，以0.001M HCl作对照。 猪胰蛋白酶在280nm的比消光系数为：E1% 1cm=13.5 ，所以当其浓度为1mg/ml时，消光系数应为1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)＝ A280×稀释倍数/1.35 ⑵ 胰蛋白酶活力的测定（BAEE法）：参见亲和层析实验。 五、注意事项 1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致实验失败。 2. 在室温14～20℃条件下8～12小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶而会使比活降低， 比活性达到“3000～4000BAEE单位/mg蛋白” 时即可停止激活。 3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。 4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制PH。 5. 第一次结晶时，3～5天后仍然无结晶，应检查pH，必要时调整pH或接种，促使结晶形成。重结晶时间要短些。