〔Ⅰ〕 理论部分
1. 绪论
欢迎同学们到生物化学实验室来！对于大多数学生来说，这不是第一次做化学实验，但是我们相信，生物化学实验一定是大家最感兴趣、最激动人心的实验，当然也是花费最大、最辛苦的实验。同学们在过去几年中所学到的各种实验技术和操作技能，在这些实验中将会经常用到，当然更重要的是要学会一些新的、在生物化学的科学研究中最常用的实验方法。同学们在生物化学实验方面要取得好成绩，在很大程度上，取决于你们对这些专门化实验技术的熟练掌握和对生物化学原理的深入了解。
当同学们进行实验时，无疑将会与以前做的各种实验进行比较。在生物化学实验中，大家会发现，极少有像无机化学和有机化学实验那样进行化学反应和分离出“克”数量级的产物。同学们将进行的是“毫克”和“微克”数量级的研究，并且在多数情况下，生物分子是溶解在溶液中的，而且往往看不到所研究的物质，但是将会看到动态的生物化学过程和由生物分子引起的生物化学变化。实验中所用到的各种技术和方法，将起到“眼睛”的作用，用以对各种生物化学过程进行监测。
同学们通过生物化学实验应该做到：
⑴ 学习设计一个实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安排实验步骤和时间。
⑵ 训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生物化学实验仪器，包括各种天平、各种分光光度计、各种离心机、自动部分收集器、恒流泵、核酸蛋白检测仪、冰冻干燥机、酸度计、电导率仪、高速分散器、各种电泳装置和摇床等等。
⑶ 学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验，培养严谨细致的科学作风。
⑷ 掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是各种电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。
预祝同学们以优异的成绩跨进这一新的科学殿堂，成为攀登生物科学高峰的新的勇士！
1.1 生物化学实验技术发展简史
生物科学在20世纪有惊人的发展，其中生物化学与分子生物学的进展尤为迅速，这样一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化学与分子生物学实验技术的不断发展和完善。这里我们简单回顾一下生物化学实验技术的发展历史。
20年代： 微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等的发现。瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心技术”，1924年制成了第一台5000×g（5000 r/min～8000 r/min）相对离心力的超离心机(相对离心力“RCF”的单位可表示为“×g”)，开创了生化物质离心分离的先河，并准确测定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得了1926年的诺贝尔化学奖。
30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使我们能够看到细胞内的结构和生物大分子的内部结构。
40年代： 层析技术大发展，两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术。
“电泳技术”是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得了1948年的诺贝尔化学奖。
50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。
60年代： 各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。自1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列分析仪，到1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定，十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的发展和完善。
1962年，美国科学家Watson和英国科学家Crick因为在1953年提出的DNA分子反向平行双螺旋模型而与英国科学家Wilkins分享了当年的诺贝尔生理医学奖，后者通过对DNA分子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的DNA模型，他们的研究成果开创了生物科学的历史新纪元。在X-射线衍射技术方面，英国物理学家Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析, Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获1962年诺贝尔化学奖。
此外，在60年代，层析和电泳技术又有了重大的进展，在1968—1972年Anfinsen创建了亲和层析技术，开辟了层析技术的新领域。1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取得了重大进展。
70年代： 基因工程技术取得了突破性的进展，Arber，Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内切酶，1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子的重组。1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展，制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。
80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期，1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法成为生物化学与分子生物学最重要的研究手段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研究方面都作出了杰出的贡献。
1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快速、经济，尤其适用于生物大分子的分析，因此受到生命科学、医学和化学等学科的科学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起，HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术。
1984年德国科学家Kohler、美国科学家Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而共享了诺贝尔生理医学奖。
1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith共享1993年的诺贝尔化学奖。
除上述历史以外，还可以列出许多生物化学发展史上的重要成就，例如：
美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建立作出了历史性的贡献。
美国化学家Pauling确认氢键在蛋白质结构中以及生物大分子间相互作用的重要性等，他获得了诺贝尔化学奖。
英藉德裔生物化学家Krebs，在1937年发现了三羧酸循环，对细胞代谢及分子生物学的研究作出了重要贡献，他与美藉德裔生物化学家Lipmann共获1953年诺贝尔生理医学奖。
英国生物化学家Sanger还于1953年确定了牛胰岛素中氨基酸的精确顺序而获得1958年的诺贝尔化学奖。
1959年，美藉西班牙裔科学家Uchoa发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg分享了当年的诺贝尔生理医学奖，而后者的主要贡献在于实现了DNA分子在细菌细胞和试管内的复制。
美国生物化学家Nirenberg在破译遗传密码方面作出了重要贡献，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸排列顺序，后来证明所有tRNA的结构均相似。美藉印度裔生物化学家Khorana曾合成了精确结构的己知核酸分子，并首次人工制成酵母基因。他们3人共获1969年诺贝尔生理医学奖。
法国生物学家Lwoff、JAcob和生物化学家Monod由于在病毒DNA和mRNA等方面出色的大量研究工作而共获1965年诺贝尔生理医学奖。
1988年，美国遗传学家McClintock由于在二十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传因子而获得诺贝尔生理医学奖。
1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝尔化学奖。
1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。
1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。
1995年，美国科学家Lewis、德国科学家Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在20世纪40～70年代先后独立鉴定了控制果蝇体节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。
我国生物化学界的先驱吴宪教授在20年代初由美回国后，在协和医科大学生化系与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究。1965年我国化学和生物化学家用化学方法在世界上首次人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，1983年又通过大协作完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工合成。近年来，在酶学研究、蛋白质结构及生物膜的结构与功能等方面都有举世瞩目的研究成果。
由近百年来生物化学及其实验技术的发展史可以看出，该学科的发展与实验技术的发展密切相关，每一种新的生化物质的发现与研究都离不开实验技术，实验技术每一次新的发明都大大推动了生物化学研究的进展，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物化学实验技术就是极为重要的。
1.2 实验室规则
⑴ 实验前必须认真预习实验内容，明确本次实验的目的和要求，掌握实验原理，写好实验预习报告，否则，不能进行实验。
⑵ 实验时自觉遵守实验室纪律，保持室内安静，不大声说笑和喧哗。
⑶ 实验过程中要听从教师指导，认真按照实验步骤和操作规程进行实验。若想改进和设计新的实验方法，必须取得教师的同意。实验时认真进行实验记录，实验完毕及时整理数据，按时上交实验报告。
⑷ 实验台面、称量台、药品架、水池以及各种实验仪器内外都必须保持清洁整齐，药品称完后立即盖好瓶盖放回药品架，严禁瓶盖及药勺混杂，切勿使药品（尤其是NaOH）洒落在天平和实验台面上，毛刷用后必须立即挂好，各种器皿不得丢弃在水池内。
⑸ 配制试剂和用无离子水要注意节省，按实验实际使用量配制，多余的重要试剂和各种有机试剂要按教师要求进行回收，昂贵的Sephadex、Sepharose凝胶和DEAE纤维素等，用后必须及时回收，不得丢弃。
⑹ 配制的试剂和实验过程中的样品，尤其是保存在冰箱和冷室中的样品，必须贴上标签、写上品名、浓度、姓名和日期等，放在冰箱中的易挥发溶液和酸性溶液，必须严密封口。
⑺ 配制和使用洗液必须极为小心，强酸强碱必须倒入废液缶或冲稀后排放。电泳后的凝胶和各种废物不得倒入水池，只能倒入废物桶。
⑻ 使用贵重精密仪器应严格遵守操作规程。使用分光光度计时不得将溶液洒在仪器内外和地面上。使用高速冷冻离心机和ＨＰＬＣ等大型仪器必须经过考核。仪器发生故障应立即报告教师，未经许可不得自己随意检修。
⑼ 实验室内严禁吸烟、饮水和进食， 严禁用嘴吸移液管和虹吸管。易燃液体不得接近明火和电炉，凡产生烟雾、有害气体和不良气味的实验，均应在通风条件下进行。
⑽ 实验完毕必须及时洗净并放好各种玻璃仪器，插好自动部分收集器上的试管，保持实验台面和实验柜内的整洁。
⑾ 每组的仪器和玻璃器皿要用油漆编号，严禁抄拿他组仪器，不得将器皿遗弃在分光光度计内和其他实验台面上，打破了玻璃仪器要及时向教师报告，并自觉登记，学期结束时按规定进行处理。
⑿ 每位学生要熟悉实验室内电闸的位置，烘箱和电炉用毕必须立即断电，不得过夜使用， 要严格遵守实验室安全用电规则和其他安全规则。
⒀ 每日实验完毕，值日生要认真做好实验室的卫生值日工作。最后离开实验室的实验人员，必须检查并关好水、电、门、窗。
1.3 实验室安全及防护知识
在生化实验室中可以说是“五毒”俱全，即着火、爆炸、中毒、触电和割伤的危险均时刻存在。因此每一位在生化实验室工作的人员都必须有充分的安全意识，严格的防范措施和丰富实用的防护救治知识，一旦发生意外能正确地进行处置，以防事故进一步扩大。
1.3.1 着火
生化实验室经常使用大量的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等，而实验室又经常使用电炉等火源，因此极易发生着火事故。常用有机溶剂的易燃性列表如下：
表1—1 常见有机液体的易燃性
名 称 沸 点/℃ 闪 点※/℃ 自燃点※※/℃
乙 醚 34.5 －40 180
丙 酮 56 －17 538
二硫化碳 46 －30 100
苯 80 －11
乙醇（95％） 78 12 400
※ 闪点：液体表面的蒸汽和空气的混合物在遇明火或火花时着火的最低温度。
※※ 自燃点：液体蒸汽在空气中自燃时的温度。
由上表可以看出：乙醚、二硫化碳、丙酮、和苯的闪点都很低，因此不得存于可能会产生电火花的普通冰箱内。低闪点液体的蒸汽只需接触红热物体的表面便会着火，其中二硫化碳尤其危险。
预防火灾必须严格遵守以下操作规程：
⑴严禁在开口容器和密闭体系中用明火加热有机溶剂，只能使用加热套或水浴加热。
⑵废有机溶剂不得倒入废物桶，只能倒入回收瓶，以后再集中处理。量少时用水稀释后排入下水道。
⑶不得在烘箱内存放、干燥、烘焙有机物。
⑷在有明火的实验台面上不允许放置开口的有机溶剂或倾倒有机溶剂。
灭火方法：
实验室中一旦发生火灾切不可惊慌失措，要保持镇静，根据具体情况正确地进行灭火或立即报火警（火警电话119）。
⑴容器中的易燃物着火时，用灭火毯盖灭。因己确证石棉有致癌性，故改用玻璃纤维布作灭火毯。
⑵乙醇、丙酮等可溶于水的有机溶剂着火时可以用水灭火。汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时不能用水，只能用灭火毯和砂土盖灭。
⑶导线、电器和仪器着火时不能用水和二氧化碳灭火器灭火，应先切断电源，然后用1211灭火器（内装二氟一氯一溴甲烷）灭火。
⑷个人衣服着火时，切勿慌张奔跑，以免风助火势，应迅速脱衣，用水龙头浇水灭火，火势过大时可就地卧倒打滚压灭火焰。
1.3.2 爆炸
生物化学实验室防止爆炸事故是极为重要的，因为一旦爆炸其毁坏力极大，后果将十分严重。生物化学实验室常用的易燃物蒸汽在空气中的爆炸极限（体积％）见
表1—2。
加热时会发生爆炸的混合物有：有机化合物～氧化铜、 浓硫酸～高锰酸钾、 三氯甲烷～丙酮等。
常见的引起爆炸事故的原因有：①随意混合化学药品，并使其受热、受摩擦和撞击。
②在密闭的体系中进行蒸馏、回流等加热操作。 ③在加压或减压实验中使用了不耐压的玻璃仪器 ，或反应过于激烈而失去控制。 ④易燃易爆气体大量逸入室内。 ⑤高压气瓶减压伐摔坏或失灵。
表1—2 易燃物质蒸汽在空气中的爆炸极限
名 称 爆炸极限（体积百分数） 名 称 爆炸极限（体积百分数）
乙醚 1.9～36.5 丙酮 2.6～13
甲醇 6.7～36.5 乙醇 3.3～19
氢气 4.1～74.2 乙炔 3.0～82
1.3.3 中毒
生化实验室常见的化学致癌物有：石棉、砷化物、铬酸盐、溴乙锭等。
剧毒物有：氰化物、砷化物、乙腈 、甲醇、氯化氢、汞及其化合物等。
中毒的原因主要是由于不慎吸入、误食或由皮肤渗入。
中毒的预防： ①保护好眼睛最重要，使用有毒或有剌激性气体时，必须配戴防护眼镜，并应在通风橱内进行。 ②取用毒品时必须配戴橡皮手套。 ③严禁用咀吸移液管，严禁在实验室内饮水、进食、吸烟，禁止赤膊和穿拖鞋。 ④不要用乙醇等有机溶剂擦洗溅洒在皮肤上的药品。
中毒急救的方法主要有：①误食了酸和碱，不要催吐，可先立即大量饮水，误食碱者再喝些牛奶，误食酸者，饮水后再服Mg(OH)2乳剂，最后饮些牛奶。②吸入了毒气，立即转移室外，解开衣领，休克者应施以人工呼吸，但不要用口对口法。③ 砷和汞中毒者应立即送医院急救。
1.3.4 外伤
⑴ 化学灼伤：
①眼睛灼伤或掉进异物：眼内若溅入任何化学药品，应立即用大量水冲洗十五分钟，不可用稀酸或稀碱冲洗。若有玻璃碎片进入眼内则十分危险，必须十分小心谨慎，不可自取，不可转动眼球，可任其流泪，若碎片不出，则用纱布轻轻包住眼睛急送医院处理。若有木屑、尘粒等异物进入，可由他人翻开眼睑，用消毒棉签轻轻取出或任其流泪，待异物排出后再滴几滴鱼肝油。
②皮肤灼伤：
(a)酸灼伤：先用大量水洗，再用稀NaHCO3或稀氨水浸洗，最后再用水洗。
(b)碱灼伤：先用大量水冲洗，再用１％硼酸或２％醋酸浸洗，最后再用水洗。
(c)溴灼伤：这很危险，伤口不易愈合，一旦灼伤，立即用20％硫代硫酸钠冲洗，再用大量水冲洗，包上消毒纱布后就医。
⑵烫伤：使用火焰、蒸汽、红热的玻璃和金属时易发生烫伤，应立即用大量水冲洗和浸泡，若起水泡不可挑破，包上纱布后就医，轻度烫伤可涂抹鱼肝油和烫伤膏等。
⑶割伤：
这是生物化学实验室常见的伤害，要特别注意予防，尤其是在向橡皮塞中插入温度计、玻璃管时一定要用水或甘油润滑，用布包住玻璃管轻轻旋入，切不可用力过猛，若发生严重割伤时要立即包扎止血，就医时务必检查伤部神经是否被切断。
实验室应准备一个完备的小药箱，专供急救时使用。药箱内备有：医用酒精、红药水、紫药水、止血粉、创口贴、烫伤油膏（或万花油）、鱼肝油、1％硼酸溶液或2％醋酸溶液、1％碳酸氢钠溶液、20％硫代硫酸钠溶液、医用镊子和剪刀、纱布、药棉、棉签、绷带等。
1.3.5 触电：
生物化学实验室要使用大量的仪器、烘箱和电炉等，因此每位实验人员都必须能熟练地安全用电，避免发生一切用电事故，当50HZ的电流通过人体25mA电流时呼吸会发生困难，通过了100mA以上电流时则会致死。
⑴防止触电：①不能用湿手接触电器。②电源裸露部分都应绝缘。③坏的接头、插头、插座和不良导线应及时更换。④先接好线路再插接电源，反之先关电源再拆线路。⑤仪器使用前要先检查外壳是否带电。⑥如遇有人触电要先切断电源再救人。
⑵防止电器着火：①保险丝、电源线的截面积、插头和插座都要与使用的额定电流相匹配。②三条相线要平均用电。③生锈的电器、接触不良的导线接头要及时处理。
④电炉、烘箱等电热设备不可过夜使用。⑤仪器长时间不用要拔下插头，并及时拉闸。⑥电器、电线着火不可用泡沫灭火器灭火。
1.4 实验记录与实验报告
1.4.1 实验记录
详细、准确、如实地作好实验记录是极为重要的，记录如果有误，会使整个实验失败，这也是培养学生实验能力和严谨的科学作风的一个重要方面。
⑴ 每位同学必须准备一个实验记录本，实验前认真预习实验，看懂实验原理和操作方法，在记录本上写好实验预习报告， 包括详细的实验操作步骤(可以用流程图表示)和数据记录表格等。
⑵ 记录本上要编好页数，不得撕缺和涂改，写错时可以划去重写。不得用铅笔记录，只能用钢笔和园珠笔。记录本的左页作计算和草稿用，右页用作预习报告和实验记录。同组的两位同学合做同一实验时，两人必须都有相同、完整的记录。
⑶ 实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据，条理清楚，字迹端正，切不可了草以致日后无法辨认。实验记录必须公正客观，不可夹杂主观因素。
⑷ 实验中要记录的各种数据，都应事先在记录本上设计好各种记录格式和表格，以免实验中由于忙乱而遗漏测量和记录，造成不可挽回的损失。
⑸ 实验记录要注意有效数字，如吸光度值应为“0.050”，而不能记成“0.05”。每个结果都要尽可能重复观测二次以上，即使观测的数据相同或偏差很大，也都应如实记录，不得涂改。
⑹ 实验中要详细记录实验条件，如使用的仪器型号、编号、生产厂等；生物材料的来源、形态特征、健康状况、选用的组织及其重量等；试剂的规格、化学式、分子量、试剂的浓度等，都应记录清楚。二人一组的实验，必须每人都作记录。
1.4.2 实验报告
实验报告是实验的总结和汇报，通过实验报告的写作可以分析总结实验的经验和问题，学会处理各种实验数据的方法，加深对有关生物化学与分子生物学原理和实验技术的理解和掌握，同时也是学习撰写科学研究论文的过程。实验报告的格式应为：
⑴ 实验目的；⑵ 实验原理；⑶ 仪器和试剂；⑷ 实验步骤；⑸ 数据处理；⑹ 结果讨论。
每个实验报告都要按照上述要求来写，实验报告的写作水平也是衡量学生实验成绩的一个重要方面。实验报告必须独立完成，严禁抄袭。写实验报告要用实验报告专用纸，以便教师批阅，不要用练习本和其他片页纸。
为了使实验结果能够重复，必须详细记录实验现象的所有细节，例如，若实验中生成沉淀，那麽沉淀的真实颜色是什麽，是白色、淡黄色或是其他？沉淀的量是多还是少，是胶状还是颗粒状？什麽时候形成沉淀，立即生成还是缓慢生成，热时生成还是冷却时生成？在科学研究中，仔细地观察，特别注意那些未予想到的实验现象是十分重要的，这些观察常常引起意外的发现，报告并注意分析实验中的真实发现，对学生将是非常重要的科学研究训练。
实验报告使用的语言要简明清楚，抓住关键，各种实验数据都要尽可能整理成表格并作图表示之，以便比较，一目了然。实验作图尤其要严格要求，必须使用坐标纸，每个图都要有明显的标题，坐标轴的名称要清楚完整，要注明合适的单位，坐标轴的分度数字要与有效数字相符，并尽可能简明，若数字太大，可以化简，并在坐标轴的单位上乘以10的方次。实验点要使用专门设计的符号，如：○、●、□、■、△、▲等，符号的大小要与实验数据的误差相符。不要用“×、＋”和“·”小园点。有时也可用两端有小横线的垂直线段来表示实验点，其线段的长度与实验误差相符。通常横轴是自变量，往往知道的很准确，纵轴是应变量，是测量的数据。曲线要用曲线板或曲线尺画成光滑连续的曲线，各实验点均匀分布在曲线上和曲线两边，且曲线不可超越最后一个实验点。两条以上的曲线和符号应有说明。
实验结果的讨论要充分，尽可能多查阅一些有关的文献和教科书，充分运用己学过的知识和生物化学原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。
1.5 实验室基本操作
1.5.1 玻璃仪器的清洗
实验中所用的玻璃仪器清洁与否，直接影响实验的结果，往往由於仪器的不清洁或被污染而造成较大的实验误差，有时甚至会导致实验的失败。 做生物化学实验对玻璃仪器清洁程度的要求，比一般化学实验的要求更高。这是因为：①生物化学实验中蛋白质、酶、核酸等往往都是以“毫克”和“微克”计的，稍有杂质，影响就很大。②生物化学实验对许多常见的污染杂质十分敏感，如金属离子（钙、镁离子等）、去污剂和有机物残基等，因此玻璃仪器（包括离心管等塑料器皿）是否彻底清洗净就是非常重要的。
⑴ 初用玻璃仪器的清洗
新购买的玻璃仪器表面常附着有游离的碱性物质，可先用0.5％的去污剂洗刷，再用自来水洗净，然后浸泡在1％～2％盐酸溶液中过夜（不可少于四小时），再用自来水冲洗，最后用无离子水冲洗两次，在100℃～120℃烘箱内烘干备用。
⑵ 使用过的玻璃仪器的清洗
先用自来水洗刷至无污物，再用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或浸泡在0.5％的清洗剂中超声清洗（比色皿决不可超声），然后用自来水彻底洗净去污剂，用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪器不可烘干）。清洗后器皿内外不可挂有水珠，否则重洗，若重洗后仍挂有水珠，则需用洗液浸泡数小时后（或用去污粉擦洗），重新清洗。
⑶ 石英和玻璃比色皿的清洗
决不可用强碱清洗，因为强碱会浸蚀抛光的比色皿。只能用洗液或1％ ～2％的去污剂浸泡，然后用自来水冲洗，这时使用一支绸布包裹的小棒或棉花球棒刷洗，效果会更好，清洗干净的比色皿也应内外壁不挂水珠。
1.5.2 塑料器皿的清洗
聚乙烯、聚丙烯等制成的塑料器皿，在生物化学实验中已用的越来越多。第一次使用塑料器皿时，可先用8mol/L尿素（用浓盐酸调pH = 1）清洗，接着依次用无离子水、1 mol/L KOH和无离子水清洗，然后用10—3 mol/L EDTA 除去金属离子的污染，最后用无离子水彻底清洗，以后每次使用时，可只用0.5％的去污剂清洗，然后用自来水和无离子水洗净即可。
1.5.3 洗液的配制
因己确定铬有致癌作用，因此配制和使用洗液时要极为小心，常用两种配制方法如下：
⑴ 取100mL 工业浓硫酸置于烧杯内，小心加热，然后慢慢加入5g重铬酸钾粉末，边加边搅拌，待全部溶解并缓慢冷却后，贮存在磨口玻璃塞的细口瓶内。
⑵ 称取5g重铬酸钾粉末，置于250mL 烧杯中，加5mL 水使其溶解，然后慢慢加入100mL 浓硫酸，溶液温度将达80℃，待其冷却后贮存于磨口玻璃瓶内。
1.5.4 其他洗涤液
⑴ 工业浓盐酸：可洗去水垢或某些无机盐沉淀。
⑵ 5％草酸溶液：用数滴硫酸酸化，可洗去高锰酸钾的痕迹。
⑶ 5％～10％磷酸三钠（Na3PO4·12H2O）溶液：可洗涤油污物。
⑷ 30％硝酸溶液：洗涤二氧化碳测定仪及微量滴管。
⑸ 5％～10％乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）溶液：加热煮沸可洗脱玻璃仪器内壁的白色沉淀物。
⑹ 尿素洗涤液：为蛋白质的良好溶剂，适用于洗涤盛过蛋白质制剂及血样的容器。
⑺ 有机溶剂：如丙酮、乙醚、乙醇等可用于洗脱油脂、脂溶性染料污痕等，二甲苯可洗脱油漆的污垢。
⑻ 氢氧化钾的乙醇溶液和含有高锰酸钾的氢氧化钠溶液：这是两种强碱性的洗涤液，对玻璃仪器的侵蚀性很强，可清除容器内壁污垢，洗涤时间不宜过长，使用时应小心慎重。
1.5.5 玻璃和塑料器皿的干燥：
生化实验中用到的玻璃和塑料器皿经常需要干燥，通常都是用烘箱或烘干机在110℃～120℃进行干燥，而不要用丙酮荡洗再吹干的方法来干燥，因为那样会有残留的有机物覆盖在器皿的内表面，从而干扰生物化学反应。硝酸纤维素的塑料离心管加热时会发生爆炸，所以决不能放在烘箱中干燥，只能用冷风吹干。
1.5.6 移液
准确的分析方法对于生物化学实验是极为重要的，在各种生物化学分析技术中，首先要熟练掌握的就是准确的移液技术。为此要用到各种形式的移液管，其中有一些是学生们在化学实验中未用过而在生化实验中是常用的。下图列出了一些生化实验中常用的移液器具。
⑴ 滴管（图1－1 中(E)）
使用方便，可用于半定量移液，其移液量为1mL—5mL，常用2mL，可换不同大小的滴头（图1－1 中(A)）。滴管有长、短两种，新出一种带刻度和缓冲泡的滴管，可以比普通滴管更准确地移液，并防止液体吸入滴头。
⑵ 移液管（吸管）
吸管使用前应洗至内壁不挂水珠，1mL 以上的吸管，用吸管专用刷刷洗，0.1mL、0.2mL和0.5mL 的吸管可用洗涤剂浸泡，必要时可以用超声清洗器清洗。由于铬酸洗液致癌，应尽量避免使用。若有大量成批的吸管洗后冲洗，可使用冲洗桶，将吸管尖端向上置于桶内，用自来水多次冲洗后再用蒸馏水或无离子水冲洗。
吸管分为两种，一种是无分度的，称为胖肚吸管（图1－1 中(F)），精确度较高，其相对误差A级为0.7％ ~ 0.8％，B级为1.5％ ~ 0.16％，液体自标线流至口端（留有残液），A级等待15s，B级等待3s。
另一种吸管为分度吸管（图1－1 中(G)），管身为一粗细均匀的玻璃管，上面均匀刻有表示容积的分度线，其准确度低于胖肚吸管，相对误差A级为0.8％ ~ 0.2％，B级为1.6％—0.4％，A级、B级在吸管管身上有A、B字样，有“快”字则为快流式，有“吹”字则为吹出式，无“吹”字的吸管不可将管尖的残留液吹出。吸、放溶液前要用吸水纸擦拭管尖。
图1－1 生化实验中常用的移液器具
图1－1 (H)为血清吸管，其刻度一直刻到管端出口处，由于没有管尖，不会残留液体，但需在液体流完后仃留15～20秒，常用于吸取血清等粘度大的液体。
图1－1 (I)是微量λ吸管，用于1～500(l （1λ= 1(l）的移液，用吸水纸蘸出多吸的液体。
图1－1 (J)是毛细微量吸管，用于1～20(l的移液，常用于薄层层析和纸层析。
吸管吸取溶液最常用的是洗耳球（图1 中(B)）。此外，为便于移液，还可以使用新式的吸液球（图1－1 中(C)），球上有A、B、C三个玻璃珠阀门，吸液之前，先用拇指和食指按捏A阀，用其他手指挤压球体，由A阀排气，使球内形成负压，插入吸管吸液时，用拇指和食指按捏B阀，将溶液吸至所需刻度，放液时按捏C阀，直至溶液流尽，若需吹出管尖残液时，可在按捏C阀的同时，用中指挤压C阀前面的小球泡，即可吹出管尖残液。
还有一种“吸管泵”（图1－1 中(D)）使用更为方便，插入吸管后，用拇指转动上部的小轮，即可使园柱形泵内的柱塞上下移动，将溶液吸入或排出吸管，尤其是在移取10mL 以上的溶液时，用“吸管泵”最为方便。
⑶ 微量进样器
微量进样器常用作气相和液相色谱仪的进样器，在生化实验中主要是用作电泳实验的加样器，通常可分为无存液和有存液两种。
1) 0.5(L ～5(L无存液微量进样器： 进样器的不锈钢芯子直接通到针尖端处，不会出现存液，所以可用于5(L以下的极微量液体进样。
2) 10(L～100(L有存液微量进样器： 不锈钢的针尖管部分是空管，进样器的柱塞不能到达，因而管内会存有空气或液体，其使用注意事项是：① 不可吸取浓碱溶液，以免腐蚀玻璃和不锈钢零件。 ② 因为有存液，所以吸液时要来回多拉几次，将针尖管内的气泡全部排尽。 ③ 针尖管内孔极小，使用后，尤其是吸取过蛋白质溶液后，必须立即清洗针尖管，防止堵塞。若遇针尖管堵塞，不可用火烧，只能用φ0.1mm的不锈钢丝耐心串通。 ④ 进样器未润湿时不可来回干拉芯子，以免磨损而漏气。 ⑤ 若进样器内发黑，有不锈钢氧化物，可用芯子蘸少量肥皂水，来回拉几次即可除之。
⑷ 自动取液器
这种取液器在生化实验中大量地使用，它们主要用于多次重复的快速定量移液，可以只用一只手操作，十分方便。移液的准确度（即容量误差）为 ±(0.5％～1.5％)，移液的精密度（即重复性误差）更小些，为 ≤0.5％。
取液器可分为二种：一种是固定容量的，常用的有100(l 、200(L和1000(L等几种；另一种是可调容量的取液器，常用的有200(L、1000(L和5000(L等多种规格。每种取液器都有其专用的聚丙烯塑料吸头，吸头通常是一次性使用，当然也可以超声清洗后重复使用，而且此种吸头还可以进行120℃高压灭菌。
可调式自动取液器的操作方法是用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮，使数字窗口出现所需容量体积的数字，在取液器下端插上一个塑料吸头，并旋紧以保证气密，然后四指并拢握住取液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮，向下按到第一停点，将取液器的吸头插入待取的溶液中，缓慢松开按钮，吸上液体，并停留1～2秒钟（粘性大的溶液可加长停留时间），将吸头沿器壁滑出容器，用吸水纸擦去吸头表面可能附着的液体，排液时吸头接触倾斜的器壁，先将按钮按到第一停点，停留一秒钟（粘性大的液体要加长停留时间），再按压到第二停点，吹出吸头尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸头，可按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。
自动取液器的使用注意事项是： ① 吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 ② 为获得较高的精度，吸头需予先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。③ 浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。④ 可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g。
图1－2 自动取液器示意图
1.6 缓冲溶液与pH测定
缓冲溶液是一类能够抵制外界加入少量酸和碱的影响，仍能维持pH值基本不变的溶液。该溶液的这种抗pH变化的作用称为缓冲作用。缓冲溶液通常是由一或两种化合物溶于溶剂（即纯水）所得的溶液，溶液内所溶解的溶质（化合物）称之为缓冲剂，调节缓冲剂的配比即可制得不同pH的缓冲液。
缓冲溶液的正确配制和pH值的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极为重要的意义，因为在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH值下进行的，而且受到氢离子浓度的严格调控，能够做到这一点是因为生物体内有完善的天然缓冲系统。生物体内细胞的生长和活动需要一定的pH值，体内pH环境的任何改变都将引起与代谢有关的酸碱电离平衡移动，从而影响生物体内细胞的活性。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有体内过程完全相同的pH值，此外，各种生化样品的分离纯化和分析鉴定，也必须选用合适的pH值，因此，在生物化学的各种研究工作中和生物技术的各种开发工作中，深刻地了解各种缓冲试剂的性质，准确恰当地选择和配制各种缓冲溶液，精确地测定溶液的pH值，就是非常重要的基础实验工作。下表列出某些人体体液的pH值：
表1—3 人体体液pH
体 液
pH
体 液
pH
血 清
7.35～7.45
大肠液
8.3～8.4
成人胃液
0.9～1.5
泪
6.6～6.9
唾 液
6.3～7.1
尿
4.8～7.5
胰 液
7.5～8.0
脑脊液
7.35～7.45
1.6.1 基本概念
⑴ Br(nsted-Lowry酸碱理论（又称酸碱质子理论）。1923年由丹麦化学家J.N.Br(nsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，发展了酸碱理论，被后人称为酸碱质子理论或Br(nsted-Lowry酸碱理论。他们认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4— 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl—等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。
A—H ＋ B— A ＋ B—H
酸1 碱2 碱1 酸2
酸1 是 碱1的共轭酸， 碱2 是 酸2 的共轭碱。
如盐酸在水中的解离：
HCl Cl— ＋ H+
HCl是酸，Cl—是它的共轭碱。
⑵ 缓冲体系的设计：
强电解质溶于水几乎全部解离为正负离子，弱电解质溶于水时，则不完全解离，只有部分的分子解离出正负离子，其馀以分子形式存在于溶液中。例如弱酸（HA）及其盐溶于水时，只有部分HA解离为 H+ 和 A—离子，其平衡方程式如下：
K1
HA A— ＋ H+ (1-1)
K2
∴ (1-2)
(1-2)式两边取负对数： (1-3)
(1-3)式中： [HA] — 为弱酸的浓度
[H+] — 为HA解离出的氢离子浓度
[A—] — 为HA的共轭碱的离子浓度
K1 — 为酸解离的速度常数
K2 — 为A—与H+ 缔合的速度常数
Ka — 为反应方程(1-1)达平衡时HA的解离平衡常数
现将HA的pKa 定义为 －lg Ka，将HA溶液的pH定义为 －log[H+]，
∴ (1-3)式可写为 ： (1-4)
或： (1-5)
方程(1-4)称为：Henderson-Hassel-Balch方程，此方程对于生物化学学科，在理论与实践上都具有重要意义。该方程表示了溶液pH与溶质中可解离基团pKa之间的关系。很明显，当[A—]＝[HA]时：
∴ pH ＝ pKa
这就意味着当[HA]有一半解离时，溶液的pH等于 pKa，此弱酸－碱缓冲体系的pKa即代表缓冲范围的中点。一个缓冲体系的有效缓冲范围，通常是在pKa值为中点的两个pH单位范围内，即：缓冲剂的有效pH范围＝pKa±1，所以，当缓冲溶液的pH等于该缓冲剂的pKa时，缓冲能力最大。若要设计一个新的缓冲体系时，只需按所要求的pH值查出pKa值等于此pH值的各种缓冲剂并从中进行挑选即可。
1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性：
① pKa值在6～8之间； ② 在水中的溶解度高；③ 不易穿透生物膜；④ 盐效应小；⑤ 离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小；⑥ 不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦ 该缓冲剂化学稳定；⑧ 紫外和可见光波长范围内光吸收小；⑨ 易制得高纯度的盐。
按照这些要求可以设计和选择最为合适的缓冲剂来配制所需的缓冲溶液。
1.6.2 生物化学常用缓冲液
⑴ 磷酸盐缓冲液
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：
NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21
Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32
配酸性缓冲液： 用 NaH2PO4，pH＝1～4，
配中性缓冲液： 用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8，
配碱性缓冲液： 用 Na2HPO4，pH＝10～12。
用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。
其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。
⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲液
Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。
Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如：
Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5
Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0
配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。
Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。
其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即：
△pKa／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于0℃～4℃。 ③易吸收空气中的CO2，所以配制的缓冲液要盖严密封。 ④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
⑶ 有机酸缓冲液
这一类缓冲液多数是用羧酸与它们的盐配制而成，pH范围为酸性，即pH＝3.0～6.0，最常用的是甲酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等。
甲酸～甲酸盐缓冲液很有用，因其挥发性强，使用后可以用减压法除之。乙酸～乙酸钠和柠檬酸～柠檬酸钠缓冲体系也使用的较多，柠檬酸有三个pKa值：pKa1＝3.10，
pKa2＝4.75， pKa3＝6.40。琥珀酸有二个pKa值：pKa1＝4.18， pKa2＝5.60。
有机酸缓冲液的缺点是：①所有这些羧酸都是天然的代谢产物，因而对生化反应过程可能发生干扰作用；②柠檬酸盐和琥珀酸盐可以和过渡金属离子（Fe3+、Zn++、Mg++等）结合而使缓冲液受到干扰；③这类缓冲液易与Ca++离子结合，所以样品中有Ca++离子时，不能用这类缓冲液。
⑷ 硼酸盐缓冲液
常用的有效pH范围是：pH＝8.5～10.0，因而它是碱性范围内最常用的缓冲液，其优点是配制方便，只使用一种试剂，缺点是能与很多代谢产物形成络合物，尤其是能与糖类的羟基反应生成稳定的复合物而使缓冲液受到干扰。
⑸ 氨基酸缓冲液
此缓冲液使用的范围宽，可用于pH=2.0～11.0，例如最常用的有：
甘氨酸—HCl缓冲液：pH=2.0～5.0，
甘氨酸—NaOH缓冲液：pH=8.0～11.0，
甘氨酸—Tris缓冲液：pH=8.0～11.0，（此缓冲液用于广泛使用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的电极缓冲液），
组氨酸缓冲液：pH=5.5～6.5，
甘氨酰胺（glycine amide）缓冲液：pH=7.8～8.8，
甘氨酰甘氨酸（glycylglycine）缓冲液：pH=8.0～9.0。
此类缓冲体系的优点是：为细胞组份和各种提取液提供更接近的天然环境。其缺点是：①与羧酸盐和磷酸盐缓冲体系相似，也会干扰某些生物化学反应过程，如代谢过程等。②试剂的价格较高。
⑹ 两性离子缓冲液（Zwitterionic buffers），又称Good’s缓冲液
1960年，N.E.Good和他的同事们总结了现有的各种缓冲试剂的优缺点后认为，必须用人为设计和人工合成的方法来找到专门用于生命科学研究的特定的缓冲体系，这些缓冲体系应具有前面所述的九条要求和特性。他们合成的一系列Good’s缓冲液可查阅有关的资料。
Good’s缓冲液的主要优点是不参加和不干扰生物化学反应过程，对酶化学反应等无抑制作用，所以它们专门用于细胞器和极易变性的、对pH敏感的蛋白质和酶的研究工作。其缺点是：①价格昂贵，②对测定蛋白质含量的双缩脲法和Lowry法不适用，因为它们会使空白管的颜色加深。
1.6.3 pH值的测定
测定溶液pH值通常有两种方法，最简便但较粗略的方法是用pH试纸，分为广泛和精密pH试纸两种。广泛pH试纸的变色范围是pH=1～14、9～14等，只能粗略确定溶液的pH值。另一种是精密pH试纸，可以较精确地测定溶液的pH值，其变色范围是2～3个pH单位，例如有pH=1.4～3.0、0.5～5.0、5.4～7.0、7.6～8.5、8.0～10.0、9.5～13.0等许多种，可根据待测溶液的酸、碱性选用某一范围的试纸。测定的方法是将试纸条剪成小块，用镊子夹一小块试纸（不可用手拿，以免污染试纸），用玻璃棒蘸少许溶液与试纸接触，试纸变色后与色阶板对照，估读出所测pH值。切不可将试纸直接放入溶液中，以免污染样品溶液。也可将试纸块放在白色点滴板上观察和估测。试纸要存放在有盖的容器中，以免受到实验室内各种气体的污染。
精确测定溶液pH值要使用pH计，其精确度可达0.005pH单位，关键是要正确选用和校对pH电极。过去是使用两个电极，即玻璃电极和参比电极（甘汞或银—氯化银电极），现在它们已淘汰，被两种电极合一的复合电极所代替。
玻璃电极对溶液中的氢离子浓度敏感，其头部为一薄玻璃泡，内装有0.1N HCl，上部由银～氯化银电极与铂金丝联结。当玻璃电极浸入样品溶液时，薄玻璃泡内外两侧的电位差取决于溶液的pH，即玻璃电极的电极电位随样品溶液中氢离子浓度（活度）的变化而变化。
参比电极的功能是提供一个恒定的电位，作为测量玻璃电极薄玻璃泡内外两侧电位差的参照。常用的参比电极是甘汞电极（Hg/HgCl）或银—氯化银电极（Ag/AgCl）。参比电极电位是氯离子浓度的函数，因而电极内充以4M KCl或饱和KCl，以保持恒定的氯离子浓度和恒定的电极电位。使用饱和KCl是为使电极内沉积有部分KCl结晶，以使KCl的饱和浓度不受温度和湿度的影响。
现在pH测定已都改用玻璃电极与参比电极合一的复合电极，即将它们共同组装在一根玻璃管或塑料管内，下端玻璃泡处有保护罩，使用十分方便，尤其是便于测定少量液体的pH值。
(A) 玻璃电极 (B) 复合电极 (C) 参比电极（银－氯化银电极）
图1－3 pH电极示意图
测定pH值时，玻璃电极和参比电极同时浸入溶液中，构成一个“全电池”，如下图所示：
pH计
Ag/AgCl HCl( 0.1mol/L) 样品 4mol/L KCl或 Ag/AgCl或
溶液 饱和KCl Hg/HgCl
玻璃电极 参比电极
使用时应注意：
⑴经常检查电极内的4mol/L KCl溶液的液面，如液面过低则应补充4mol/L KCl溶液。
⑵玻璃泡极易破碎，使用时必须极为小心。
⑶复合电极长期不用，可浸泡在2mol/L KCl溶液中，平时可浸泡在无离子水或缓冲溶液中，使用时取出，用洗并冲洗玻璃泡部分，然后用吸水纸吸干余水，将电极浸入待测溶液中，稍加搅拌，读数时电极应静止不动，以免数字跳动不稳定。
⑷使用时复合电极的玻璃泡和半透膜小孔要浸入到溶液中。
⑸使用前要用标准缓冲液校正电极，其数据见书后附录，常用的三种标准缓冲液是pH=4.00、6.88和9.23（20℃），精度为±0.002pH单位。校正时先将电极放入6.88的标准缓冲液中，用pH计上的“标准”旋钮校正pH读数，然后取出电极洗净，再放入4.00或9.23的标准缓冲液中，用“斜率”旋钮校正pH读数，如此反复多次，直至二点校正正确，再用第三种标准缓冲液检查。标准缓冲液不用时应冷藏。
⑹电极的玻璃泡容易被污染。若测定浓蛋白质溶液的pH值时，玻璃泡表面会覆盖一层蛋白质膜，不易洗净而干扰测定，此时可用0.1mol/L HCl 的1mg/mL胃蛋白酶溶液浸泡过夜。若被油脂污染，可用丙酮浸泡。若电极保存时间过长，校正数值不准时，可将电极放入2mol/L KCl 溶液中，40℃加热一小时以上，进行电极活化。
pH测定时会有几方面的误差：
⑴钠离子的干扰：多数复合电极对 Na+ 和H+ 都非常敏感，尤其是高pH值的碱性溶液，Na+ 的干扰更加明显。例如，当Na+ 浓度为0.1mol/L时，可使pH值偏低0.4～0.5单位。为减少Na+ 对pH测定的干扰，每个复合电极都应附有一条校正Na+干扰的标准曲线，有的新式的复合电极具有Na+ 不透过性能，如无以上两个条件，则可以将电极内的KCl换成NaCl。
⑵浓度效应： 溶液的pH值与溶液中缓冲离子浓度和其他盐离子浓度有关，因为溶液pH值取决于溶液中的离子活度而不是浓度，只有在很稀的溶液中，离子的活度才与其浓度相等。生化实验中经常配制比使用浓度高十倍的“贮液”，使用时再稀释到所需浓度，由于浓度变化很大，溶液pH会有变化，因而稀释后仍需对其pH进行调整。
⑶温度效应：有的缓冲液的pH值受温度影响很大，如“Tris”缓冲液，因而配制和使用都要在同一温度下进行。
1.7 生化实验室的基本设施与装备
1.7.1 温度与环境设施
许多生化实验都要求在一定的温度和湿度下进行操作，因此，一个正规的生化实验室必须能够保持恒温、恒湿的环境。为了保持这些条件，实验室都应装备空调和加湿器等，而仪器分析室则要求保持干燥，一些怕潮湿和易水解的试剂应保存在干燥箱中。由于各种生物材料、制剂和各种生化试剂要求在不同的温度下保存，实验室必须备有4℃、－20℃、－80℃的冰箱，需要在更低温度下保存的样品，则须使用液氮罐。对于需在较高温度下进行的操作，则可使用烘箱和高温电炉等。实验室还应备有干冰，以便使用乙醇～干冰浴进行样品的快速冷冻分装。
1.7.2 实验室用纯水
生化实验室使用最多的溶剂是“水”，配制生化实验用试剂不能用自来水，只能使用经过纯化的水。生化实验对所用水的纯度是要求比较高的，通常可以认为，水的质量越高，实验的结果就越真实可靠和准确，为此必须保证实验用水的质量。常用的两种纯水是二次蒸馏水和无离子水。在超纯分析和特殊的生化实验中要求更高的水质，如15～18 MΩ(cm高纯无离子水、无热源高纯水、无菌水、亚沸蒸馏水、无二氧化碳蒸馏水等。
实验室制备无离子水，通常使用聚苯乙烯磺酸型强酸性阳离子交换树脂和聚苯乙烯季胺型强碱性阴离子交换树脂填充的阳离子和阴离子交换柱，或是阴、阳离子交换树脂的比例为2∶1的混合柱。无离子水的水质用电阻率表示，最高纯度是18 MΩ(cm（25℃）。虽然无离子水中阴、阳离子的含量可以很低，但用离子交换法却不能去除水中的有机物杂质，离子交换树脂中的低分子有机化合物亦可能溶于水，因此由无离子水的电阻率不能看出水中有机物的污染程度，有机物的污染有可能干扰生化实验中的某些反应，也会使水的紫外吸收增加，对于那些对紫外吸收要求十分严格的实验，应选用蒸馏水而不用无离子水。
实验室中制备蒸馏水，多采用石英管加热的硬质玻璃蒸馏水器，蒸馏时不能用自来水，因为会产生水垢，最好用无离子水作为水源。如欲除去有机物，可在蒸馏水器中每升水加1g高锰酸钾和1mL 85％的磷酸，以便通过氧化除去有机物。不含金属离子的水，需用亚沸蒸馏水，即用石英亚沸蒸馏器进行蒸馏，其特点是在液面上方加热，但水并不沸腾，只是液面处于亚沸状态，可将水蒸气带出的杂质减至最低，但制水量较小，每小时约1～4升。
实验工作中不应盲目追求水的纯度，水的价格随水质的提高而成倍地增长，因此要根据实际工作的需要，即所用水中应排除的干扰物质的类型，来选用水的种类，如：无离子水、普通蒸馏水、二次蒸馏水、亚沸蒸馏水及按特殊要求制备的高纯水等。
所有的各种纯水，在贮存中都会被污染：塑料容器会产生有紫外吸收的有机物；玻璃和金属容器会产生金属离子的污染；长时间放置更会使水长菌，空气中的二氧化碳会溶入水中，所以贮存高纯水一定要隔绝空气，密封盖严，必要时贮存在冰箱的冷藏室中。
1.7.3 消毒系统
生化实验要进行生物培养和生物反应的操作，这些操作都必须排除其他生物因素的干扰，因此在做这些实验之前，都必须对实验中用到的、可能造成污染的材料、器械等进行消毒灭菌处理。常用的灭菌方法有：高温、高压灭菌、紫外线照射、火焰焚烧、过滤除菌、酒精等试剂浸泡消毒等，因此实验室必须配备各种无菌处理设备。
1.7.4 计量系统
生化实验都要求在各种标准的定量条件下进行，因此实验室必须配备各种标准的定量系统。常用的定量系统有：称量系统、液体体积度量系统、pH测定系统、液体溶质定量系统等。
⑴ 称量系统：最常用的设备是各种千分之一的扭力天平、电子天平和各种万分之一的单、双盘天平和电子天平等，它们分别用于各种缓冲液的配制和标准物质的称量等。
⑵ 液体体积度量系统：常用的有各种量筒、移液管、容量并、微量进样器和各种自动取液器等。
⑶ 酸碱度pH测量系统：最常用的是pH试纸和pH计。
⑷ 液体溶质定量系统：此系统主要是根据液体溶质的某些理化特性而设计的，不同的物质在一定的条件下有特定的吸收光谱，其吸收值的大小与其在溶液中的浓度有一定的关系，可以通过测定某物质在溶液中的吸收光谱来计算出该物质的浓度，因而分光光度计就是生化实验室必备的仪器分析手段。主要有可见分光光度计、紫外／可见分光光度计和高档的快速扫描紫外／可见分光光度计等。
1.7.5 离心设备
离心方法是分离和制备生物大分子最常用的手段，因而生化实验室必须备有各种形式的离心机。常用的有普通台式离心机、高速冷冻离心机和超速离心机等。
1.7.6 电泳装置
电泳是生化实验中最常用最重要的实验技术之一，主要用于分析、鉴定，也可用于制备。电泳装置由电源和电泳槽两部分组成，详见第4章。
1.7.7 层析装置
层析又称为色谱，是分离各种生物大分子的主要手段之一，因而各种层析系统和核酸蛋白检测器就是生化实验室最常用的仪器设备。主要的层析技术有：吸附层析、凝胶排阻层析、离子交换层析和亲和层析等，详见第3章。
1.7.8 光密度仪
激光光密度仪是适用于多种电泳结果分析的仪器。它采用激光为光源，色散性强，线性范围广，分辨率高，所得结果可以在电脑中进行多维的图象处理，并打印出结果，在生化实验室中正得到越来越广泛的使用。
1.7.9 真空印迹系统
该设备是一种利用真空原理将已经分离的生物大分子(蛋白质、核酸)从电泳后的凝胶中转移到膜上的仪器，主要由印迹仪和真空印迹泵组成，印迹效率接近100％，重复性好，方法简易、快速，将转移分子的变性、中和、印迹等所有步骤均在印迹仪中完成，从而避免了凝胶受损。
1.7.10 核酸自动合成仪与测序仪
用于DNA、RNA的自动合成及序列测定。
1.7.11 蛋白质的自动合成与测序仪
用于蛋白质分子的体外合成与序列测定。
1.7.12 PCR仪
PCR(Polymerase Chain Reaction)是指聚合酶链式反应。该反应是用DNA聚合酶在体外大量扩增DNA片段的一种方法。PCR仪就是将此方法实现了自动化操作的一种仪器，是生化与分子生物学实验常用和必备的设备。
1.7.13 同位素实验设施
生物化学许多实验都要用到放射性同位素，如：生物体分子示踪、分子杂交、放射性检测等，因此实验室必须有安全的同位素实验设施。
⑴放射源材料存放室：用于放射源材料的存放、保管等，应较僻静。
⑵操作时的防护设施： 常用的器具有：有机防护并、特制防护衣、防护罩等．接触同位素样品时必须戴防护手套。
⑶放射性检测、监测器：在操作同位素的地方，应配备检测、监测器，能自动安全报警，随时报告并指示放射源情况。
⑷放射性核素分析测定仪：用来检测分析实验结果。常用的有液体闪烁计数器，数字式放射自显影分析仪，盖革计数器和Ｘ射线放射显影盒等。
⑸废物处理器：使用同位素应有能够安全地存放和处理同位素废物的场所，否则严禁使用同位素。
1.7.14 生物培养设施
生物培养是生化实验必不可少的设备。生物材料的培养有微生物培养、植物细胞及组织培养、动物细胞及动物培养等。不同的培养，其对设施的要求也有所不同。
微生物培养：需要恒温恒湿培养箱、振荡培养器即摇床（有空气和水浴式以及全温式摇床）、发酵罐、大型生物反应器等。
植物细胞及组织培养： 需要恒温恒湿光照培养箱、振荡培养器、生物反应器和植物房等。
动物细胞及动物培养：需要二氧化碳培养箱、电热恒温培养箱和动物房等。
为了对所培养的微生物和动植物细胞进行破碎，提取所需的生物大分子，还必需有各种高效率的细胞破碎装置。
1.7.15 基因导入仪
用于向受体生物细胞中导入基因。常用的导入仪有：电导入仪、基因枪、激光和超声导入仪、原生质体融合仪等。
1.7.16 高效液相色谱仪和毛细管电泳仪
用于各种生物大分子的分析与鉴定。
1.7.17 暗室
在生化实验研究中，必须有一间装备完整的暗室，能对各种照相乳胶和感光材料进行处理，如各种电泳凝胶的照相冲洗和放大，放射性自显影的X射线片及其他感光底片的处理，以及进行核酸与荧光物质（溴化乙锭）结合后在紫外线照射下对电泳结果的观察操作等。
暗室中应装备有：照相装置、放大机、曝光箱、翻拍仪、自动冲片机和紫外透射仪等。
1.7.18 冷室
生化实验一般都要求在低温下进行，由于冰浴太小，冷柜也不能进人操作，因此就需要有一间4℃～10℃的冷室，工作人员可以在其中进行各种柱层析、各种电泳、生物大分子的提取和分离、硫酸铵沉淀蛋白质以及各种物质的透析等操作，并可以贮存各种生物制品和生化试剂。
1.7.19 其他设备
实验室除以上常规设备和设施外，还必须装备下列一些常用设备：
⑴通风柜：用于有害和有毒气体的操作。
⑵微波炉：用于化冻、灭菌及其他一些需要快速加热的操作。
⑶组织打碎机和匀浆器：用于各种生物材料、动植物组织和细胞的破碎。
⑷超声清洗机：用于各种器皿、移液管和自动取液器吸头的清洗和高效液相色谱仪所用流动相的脱气等。
⑸制冰机：为实验室提供足够的碎冰块。
⑹冰冻干燥机：用于生物大分子水溶液的冰冻干燥，可由其水溶液直接制得固体干粉。
⑺机械和水环式真空泵：用于旋转蒸发器和各种真空抽气操作。
⑻旋转蒸发器：用于各种水溶液和有机溶液的旋转减压蒸馏操作。
⑼普通显微镜和倒置显微镜：用于对各种细胞和生物材料的观察。
⑽酶标仪：用于免疫化学实验的酶联免疫吸附测定。
由上述内容可见，生化实验室所需装备的各种仪器设备和设施是多种多样的，因而要求每一位生物化学工作者和学生都必须非常重视这些仪器设备和设施的使用和维护，必须具有较强的实验动手能力。能否正确熟练地使用上述这些仪器设备，在很大程度上将决定他们实验的成败。
2. 生物大分子的制备
2.1 概述
生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：
⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。其中许多化合物至今还是个谜，有待人们研究与开发。有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。
⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的生物材料，才能提取出几毫克的样品。
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
由于生物大分子的分离和制备是如此的复杂和困难，因而实验方法和流程的设计就必须尽可能多查文献，多参照前人所作的工作，吸取其经验和精华，探索中的失败和反复是不可避免的，只有具有百折不挠的钻研精神才能达到预期的目的。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物的浓缩，干燥和保存。
分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。
生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更为理想，必要时再做N－末端氨基酸残基的分析鉴定，过去曾用的溶解度法和高速离心沉降法，现已很少再用。核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH 7.0时260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。
要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。
制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等，目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。由于生物大分子不能加热熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此两相之间交替进行分离纯化。在实际工作中往往要综合运用多种方法，才能制备出高纯度的生物大分子。
纯化生物大分子总是希望纯度和产率都要高。例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率都要高才好，但实际上两者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能的高，而牺牲一些回收率，在工业生产上则正相反。
2.2 生物大分子制备的前处理
2.2.1 生物材料的选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。从工业生产角度选择材料，应选择含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低的原料，但往往这几方面的要求不能同时具备，含量丰富但来源困难，或含量来源较理想，但材料的分离纯化方法繁琐，流程很长，反倒不如含量低些但易于获得纯品的材料，由此可见，必须根据具体情况，抓住主要矛盾决定取舍。从科研工作的角度选材，则只须考虑材料的选择符合实验预定的目标要求即可。除此之外，选材还应注意植物的季节性、地理位置和生长环境等。选动物材料时要注意其年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等。动物在饥饿时，脂类和糖类含量相对减少，有利于生物大分子的提取分离。选微生物材料时要注意菌种的代数和培养基成分等之间的差异，例如在微生物的对数期，酶和核酸的含量较高，可获得较高的产量。
材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。植物要先去壳、除脂。微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。
2.2.2 细胞的破碎
除了某些细胞外的多肽激素和某些蛋白质与酶以外，对于细胞内或多细胞生物组织中的各种生物大分子的分离纯化，都需要事先将细胞和组织破碎，使生物大分子充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
(1)机械法：
1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆，即可将动物细胞破碎，这种方法比较温和，适宜实验室使用。工业生产中可用电磨研磨。细菌和植物组织细胞的破碎也可用此法。
2) 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用10000r/min～20000r/min的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织的细胞打碎，为了防止发热和升温过高，通常是转10秒～20秒，停10秒～20秒，可反复多次。
(2)物理法：
1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些，处理的效果与样品浓度和使用频率有关。使用时注意降温，防止过热。
3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使几十毫升的细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。这是一种较理想的破碎细胞的方法，但仪器费用较高。
4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
(3)化学与生物化学方法：
1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来，此法称为自溶法。使用时要特别小心操作，因为水解酶不仅可以使细胞壁和膜破坏，同时也可能会把某些要提取的有效成分分解了。
2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解，释放出细胞内含物，此法适用于多种微生物。例如从某些细菌细胞提取质粒DNA时，可采用溶菌酶（来自蛋清）破细胞壁，而在破酵母细胞时，常采用蜗牛酶（来自蜗牛），将酵母细胞悬于0.1mmol/L 柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(pH=5.4)中，加1％蜗牛酶，在30℃处理30分钟，即可使大部分细胞壁破裂，如同时加入0.2％疏基乙醇效果会更好。此法可以与研磨法联合使用。
4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
2.2.3 生物大分子的提取
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。这一过程是将目的产物与细胞中其他化合物和生物大分子分离，即由固相转入液相，或从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中。
影响提取的因素主要有：目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；由固相扩散到液相的难易；溶剂的pH值和提取时间等。一种物质在某一溶剂中溶解度的大小与该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。一般地说，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；温度升高，溶解度加大，远离等电点的pH值，溶解度增加。提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。
⑴ 水溶液提取：
蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：
1) 盐浓度（即离子强度）：离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如DNA-蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加，而另一些物质，如RNA-蛋白复合物，在低离子强度下溶解度增加，在高离子强度下溶解度减小。绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。但中性盐的浓度增加至一定时，蛋白质的溶解度又逐渐下降，直至沉淀析出，称为“盐析”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。所以低盐溶液常用于大多数生化物质的提取。通常使用0.02 mol/L ～0.05 mol/L 缓冲液或0.09 mol/L ～0.15 mol/L NaCl 溶液提取蛋白质和酶。不同的蛋白质极性大小不同，为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
2) pH值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与pH值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。碱性蛋白质选在偏酸一侧，酸性蛋白质选在偏碱的一侧，以增加蛋白质的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶为碱性蛋白质，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶属酸性蛋白质，则常用稀碱来提取。
3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。但少数对温度耐受力强的蛋白质和酶，可提高温度使杂蛋白变性，有利于提取和下一步的纯化。
4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：在提取蛋白质、酶和核酸时，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而导致实验的失败。为防止这一现象的发生，常常采用加入抑制剂或调节提取液的pH、离子强度或极性等方法使这些水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA时加入EDTA络合DNAase活化所必须的Mg++。
5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。
⑵ 有机溶剂提取
一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，其中正丁醇在0℃时在水中的溶解度为10.5％，40℃时为6.6％，同时又用具有较强的亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。例如植物种子中的玉蜀黍蛋白、麸蛋白，常用70％～80％的乙醇提取，动物组织中一些线粒体及微粒上的酶常用丁醇提取。
有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。例如，胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8％乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.5～3.0，进行提取，这样就从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：①6.8％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上条件对胰岛素的溶解和稳定性都没有影响，却可除去一部分在稀醇与稀酸中不溶解的杂蛋白。
2.3 生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。
2.3.1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：
⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。
⑴ 中性盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图2－1”所示。
⑵ 中性盐的选择
常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：
① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，（NH4）2SO4在0℃时仍有70.6％的溶解度，远远高于其它盐类：
表2－1 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4）2SO4 70.6 75.4 95.3 103
Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101
图 2－1 盐析原理示意图
② 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
③ 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L的（NH4）2SO4保存可达数年之久。
④ 价格便宜，废液不污染环境。
⑶ 盐析的操作方法
最常用的是固体硫酸铵加入法。欲从较大体积的粗提取液中沉淀蛋白质时，往往使用固体硫酸铵，加入之前要先将其研成细粉不能有块，要在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，尤其到接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速度和较长的离心时间。
各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。硫酸铵浓度的表示方法是以饱和溶液的百分数表示，称为百分饱和度，而不用实际的克数或克分子数，这是由于当固体硫酸铵加到水溶液中去时，会出现相当大的非线性体积变化，计算浓度相当麻烦，为了克服这一困难，有人经过精心测量，确定出1升纯水提高到不同浓度所需加入硫酸铵的量，附录中的实验数据以饱和浓度的百分数表示，使用时十分方便。
⑷ 盐析曲线的制作
如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下：
取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶液，冷至0℃～5℃，调至该蛋白质稳定的pH值，分6～10次分别加入不同量的硫酸铵，第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚开始出现沉淀时，记下所加硫酸铵的量，这是盐析曲线的起点。继续加硫酸铵至溶液微微混浊时，静止一段时间，离心得到第一个沉淀级分，然后取上清再加至混浊，离心得到第二个级分，如此连续可得到6～10个级分，按照每次加入硫酸铵的量，在附录中查出相应的硫酸铵饱和度。将每一级分沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中，测定其蛋白质含量和酶活力。以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫酸铵饱和度作图，即可得到盐析曲线。
⑸盐析的影响因素
① 蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当于25 mg/mL～30mg/mL。
② pH值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。
③ 温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。
2.3.1.2 有机溶剂沉淀法
⑴基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其沉淀作用的原理主要是降低水溶液的介电常数，溶剂的极性与其介电常数密切相关，极性越大，介电常数越大，如20℃时水的介电常数为80，而乙醇和丙酮的介电常数分别是24和21.4，因而向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了蛋白质分子间的相互作用，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。溶液介电常数的减少就意味着溶质分子异性电荷库仑引力的增加，使带电溶质分子更易互相吸引而凝集，从而发生沉淀。另一方面，由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
有机溶剂沉淀法的优点是：①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。
⑵有机溶剂的选择和浓度的计算
用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的沉淀剂是乙醇。
进行沉淀操作时，欲使溶液达到一定的有机溶剂浓度，需要加入的有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：
V = V0 (S2 －S1) ／(100－S2)
式中：
V = 需加入100％浓度有机溶剂的体积
V0 = 原溶液体积
S1 = 原溶液中有机溶剂的浓度
S2 = 所要求达到的有机溶剂的浓度
100是指加入的有机溶剂浓度为100％，如所加入的有机溶剂的浓度为95％，上式的(100－S2) 项应改为 (95－S2) 。
上式的计算由于未考虑混溶后体积的变化和溶剂的挥发情况，实际上存在一定的误差。有时为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
⑶有机溶剂沉淀的影响因素
① 温度： 多数蛋白质在有机溶剂与水的混合液中，溶解度随温度降低而下降。值得注意的是大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。
②样品浓度：样品浓度对有机溶剂沉淀生物大分子的影响与盐析的情况相似：低浓度样品要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀，且样品的损失较大，即回收率低，具有生物活性的样品易产生稀释变性。但对于低浓度的样品，杂蛋白与样品共沉淀的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常，使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。
③ pH值：有机溶剂沉淀适宜的pH值，要选择在样品稳定的pH值范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH值，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。
④ 离子强度：离子强度是影响有机溶剂沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白质为例，盐浓度太大或太小都有不利影响，通常溶液中盐浓度以不超过5％为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了有机溶剂沉淀蛋白质的效果，通常是在低盐或低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
有机溶剂沉淀法经常用于蛋白质、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分离，使用时先要选择合适的有机溶剂，然后注意调整样品的浓度、温度、pH值和离子强度，使之达到最佳的分离效果。沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。
2.3.1.3 选择性变性沉淀法
这一方法是利用蛋白质、酶与核酸等生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯，称为选择性变性沉淀法。常用的有热变性、选择性酸碱变性和有机溶剂变性等。
⑴ 热变性
利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使某些非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最为简便，不需消耗任何试剂，但分离效率较低，通常用于生物大分子的初期分离纯化。
⑵ 表面活性剂和有机溶剂变性
不同蛋白质和酶等对于表面活性剂和有机溶剂的敏感性不同，在分离纯化过程中使用它们可以使那些敏感性强的杂蛋白变性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法时通常都在冰浴或冷室中进行，以保护目的物的生物活性。
⑶ 选择性酸碱变性
利用蛋白质和酶等对于溶液中酸碱不同pH值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀，通常是在分离纯化流程中附带进行的一个分离纯化步骤。
2.3.1.4 等电点沉淀法
等电点沉淀法是利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。但是，由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，效果不理想，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。
2.3.1.5 有机聚合物沉淀法
有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是聚乙二醇HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )，它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为6000～20000的 PEG。
PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和分子量有关，同时还受离子强度、溶液pH和温度等因素的影响。在一定的pH值下，盐浓度越高，所需PEG时浓度越低，溶液的pH越接近目的物的等电点，沉淀所需PEG的浓度越低。在一定范围内，高分子量和浓度高的PEG沉淀的效率高。以上这些现象的理论解释还都仅仅是假设，未得到充分的证实，其解释主要有：①认为沉淀作用是聚合物与生物大分子发生共沉淀作用。②由于聚合物有较强的亲水性，使生物大分子脱水而发生沉淀。③聚合物与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，在重力作用下形成沉淀析出。④通过空间位置排斥，使液体中生物大分子被迫挤聚在一起而发生沉淀。
本方法的优点是：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相当多的生物大分子。③沉淀后有机聚合物容易去除。
2.3.2 透析
自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。
新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。使用时，一端用橡皮筋或线绳扎紧，也可以使用特制的透析袋夹夹紧，由另一端灌满水，用手指稍加压，检查不漏，方可装入待透析液，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时，体积增加50％是正常的。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。
检查透析效果的方法是：用1％ BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 检查NaCl、KCl等。
为了提高透析效率，还可以使用各种透析装置。使用者也可以自行设计与制作各种简易的透析装置。美国生物医学公司（Biomed Instruments Inc.）生产的各种型号的Zeineh 透析器，由于使用对流透析的原理，使透析速度和效率大大提高。
2.3.3 超滤
超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。
超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。
受压的生物大分子
和小分子溶液
浓缩的生物大分子
小分子溶液
图 2－2 超滤工作原理示意图。
超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4×104 Pa，膜的平均孔径为500埃～14微米（1微米＝104埃），用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104 Pa～7×105 Pa，膜的平均孔径为10—100埃，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105 Pa～140×105 Pa，膜的平均孔径最小，一般为10埃以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。
超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。
在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。
超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到10～50％的浓度。
超滤技术的关键是膜。膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05(m 和0.025(m。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜，其中一种各向异性扩散膜是由一层非常薄的、具有一定孔径的多孔“皮肤层”（厚约0.1(m ～1.0(m ），和一层相对厚得多的（约1(m ）更易通渗的、作为支撑用的“海绵层”组成。皮肤层决定了膜的选择性，而海绵层增加了机械强度。由于皮肤层非常薄，因此高效、通透性好、流量大，且不易被溶质阻塞而导致流速下降。常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％ 叠氮化钠NaN3中保存。
超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/(cm2·h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。
超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。
国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。国内主要的研究机构和生产厂家是：中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究所、无锡化工研究所、上海医药工业研究所、天津膜分离工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种，以及从某些研究工作的深度方面看，我国与世畀先进国家的差距不很大，但在膜的质量性能及商品化方面尚有较大差距。
在生物制品中应用超滤法有很高的经济效益，例如供静脉注射的25％人胎盘血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸铵盐析法、透析脱盐、真空浓缩等工艺制备的，该工艺流程硫酸铵耗量大，能源消耗多，操诈时间长，透析过程易产生污染。改用超滤工艺后，平均回收率可达97.18％；吸附损失为1.69％；透过损失为1.23％；截留率为98.77％。大幅度提高了白蛋白的产量和质量，每年可节省硫酸铵6.2吨，自来水16000吨。
超滤技术的应用有很好的前景，应引起足够的重视。
2.3.4 冰冻干燥
冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。
冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见图 6 ：
压 A B
力 液
固 蒸发
O
汽
升华
C
温度
图 2－3 三相点相图
图中OA是固液曲线，OB是汽液曲线，OC是固汽曲线，O是三相点。当温度在三相点O以下，将压力降至OC线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。例如，冰在－40℃时其上方的蒸汽压为0.1毫米汞柱mmHg，在－60℃时其上方的蒸汽压为0.01毫米汞柱mmHg。固态的冰升华为水蒸汽时要吸收大量的热，1克0℃的冰变成0℃的蒸汽需吸热580千卡，所以升华时又可以使固态的冰进一步降温，空气潮湿时可以看见装有固态冰的容器外壁上结有霜。
冰冻干燥得到的生物大分子固体样品有突出的优点：①由于是由冰冻状态直接升华为汽态，所以样品不起泡，不暴沸。②得到的干粉样品不粘壁，易取出。③冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。
冰冻干燥特别适用于那些对热敏感、易吸湿、易氧化及溶剂蒸发时易产生泡沫而引起变性的生物大分子，如蛋白质、酶、核酸、抗菌素和激素等。对于极个别的在冻干时易变性失活的生物大分子则要十分谨慎，务必先做小量试验证明冻干无害后方可进行大量处理。
冰冻干燥机的国产品牌近年来发展很快。如北京的军事医学科学院生产的小型、中型和大型工业用冰干机，已可以取代昂贵的进口产品。在实验室中还可以自已组装小型简易的冰冻干燥器。①准备一个较大的玻璃真空干燥器，将样品置于小培养皿中速冻后放入干燥器内，器内已事先用两个小培养皿分别盛有KOH(或NaOH) 和 P2O5，干燥器通过一个两端塞上棉花其中装满P2O5的干燥管与真空泵相连，抽真空后，经过5～10小时就可以得到冰冻干燥的样品。②将样品溶液置于一个园底烧并内，将烧并浸入干冰～乙醇低温浴（－60℃）中，样品即被速冻成冰块，将烧并标准磨口通过磨口管与一个冷阱相连，冷阱内放有干冰～乙醇混合液，冷阱的另一个出口管与真空泵相连，抽真空时汽化的水汽就冻结在冷阱的内壁上，抽真空数小时后即可在烧并中得到冻干的样品。此简易装置也可用于冻干含有少量乙醇、甲醇、丙酮等常用有机溶剂的样品，可重复以下的操作除去这些有机溶剂：样品速冻→→抽真空至恒定→→使样品升温至室温挥发有机溶剂→→再速冻样品，如此反复多次，以除尽有机溶剂，否则样品不易冻干，且泵前应装有保护真空泵的缓冲并，以吸收水份和有机溶剂。
冰冻干燥操作虽然十分简单，但以下的注意事项却必须认真记取：
⑴样品溶液：①样品要溶于水，不含有机溶剂，否则会造成冰点降低，冰冻的样品容易融化，因而减压时会起大量泡沫，使样品变性、污染和损失。同时若含有有机溶剂，被抽入真空泵后溶于真空泵油，使其可达真空度降低而必须换油。②样品要予先脱盐，不可使盐浓度过高，否则冰冻后易融化，影响样品活性，而且不易冻干。③样品缓冲液在冰冻时pH可能会有较大变化，例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液在冰冻时，磷酸氢二钠比磷酸二氢钠先冻结，因而使溶液pH下降而接近3.5，使某些对低pH敏感的酶变性失活，此时需加入pH稳定剂，如糖类和钙离子等。④样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15 mg/mL 为宜。同批冻干的样品液浓度不宜相差太大，以免冻干的时间相差过大。
⑵装样品溶液的容器：①最好用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，以免冻干时间太长，耗电太多。也可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2 cm，否则烧杯易冻裂。②冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。
⑶溶液冰冻：如有条件，尽可能用干冰～乙醇低温浴速冻，如能将盛有样品溶液的容器边冻边旋转形成很薄的冰冻层，则可以大大加快冻干的速度。
⑷冻干：①样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。②样品冻干达到较高真空度时，容器外部有时会结霜，若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。③冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。④仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。⑤样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。⑥真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油，通常半年或一季度至少要换一次油。
2.3.5 样品的保存
生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。
影响生物大分子样品保存的主要因素有：
⑴空气：空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。空气中微生物的污染可使样品腐败变质，样品吸湿后会引起潮解变性，同时也为微生物污染提供了有利的条件。某些样品与空气中的氧接触会自发引起游离基链式反应，还原性强的样品易氧化变质和失活，如维生素C、巯基酶等。
⑵温度：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加1～3倍。因此通常绝大多数样品都是低温保存，以抑制氧化、水解等化学反应和微生物的生成。
⑶水份：包括样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。
⑷光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，对生物大分子制品影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。
⑸样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH范围，通常可从文献和手册中查得或做实验求得，因此正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度就十分重要。
⑹时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。
现以保存蛋白质和酶为例：
⑴低温下保存：由于多数蛋白质和酶对热敏感，通常35℃～40℃以上就会失活，冷藏于冰箱一般只能保存一周左右，而且蛋白质和酶越纯越不稳定，溶液状态比固态更不稳定。因此通常要保存于－5℃～－20℃，如能在－70℃下保存则最为理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀HCl中可以耐受90℃；蔗糖酶在50℃～60℃可以保持15 min～30 min不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶25℃稳定，低温下失活，过氧化氢酶要在0℃～4℃保存，冰冻则失活，羧肽酶反复冻融会失活等。
⑵制成干粉或结晶保存：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存，例如葡萄糖氧化酶干粉0℃下可保存2年，－15℃下可保存8年。通常，酶与蛋白质含水量大于10％，室温低温下均易失活，含水量小于5％时，37℃活性会下降，如要抑制微生物活性，含水量要小于10％，抑制化学活性，含水量要小于3％。此外要特别注意酶在冻干时往往会部分失活。
⑶在保护剂下保存：很早就有人观察到，在无菌条件下，室温保存了45年的血液，血红蛋白仅有少量改变，许多酶仍保留部分活性，这是因为血液中有蛋白质稳定的因素，为了长期保存蛋白质和酶，常常要加入某些稳定剂：例如：①惰性的生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境。②中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度（1 mol/L～4mol/L或饱和的盐溶液）的极性环境中才能保持活性。最常用的是：MgSO4、NaCl、(NH4)SO4等。使用时要脱盐。③巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。
总之，对样品的保存必须给以只够的重视，一些常用酶的保存条件可参见《生物化学制备技术》（苏拔贤主编）一书中的“一些酶保存的条件和稳定性”表，其他各种生物大分子和生物制剂的保存条件，可查阅有关的文献和酶学手册。
2.3.6 分离纯化方法的选择
生物大分子能否高效率地制备成功，关键在于分离纯化方案的正确选择和各个分离纯化方法实验条件的探索。选择与探索的依据就是生物大分子与杂质之间的生物学和物理化学性质上的差异。由本章前述的生物大分子制备的各种特点可以看出，分离纯化方案必然是千变万化的。
制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：① 以分子大小和形态的差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。② 以溶解度的差异为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。③ 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。④ 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析等。
表2—2 各种主要分离纯化方法的比较：
方 法
原 理
优 点
缺 点
应 用 范 围
沉淀法
蛋白质的沉淀作用
操作简便、成本低
廉、对蛋白质和酶
有保护作用，重复
性好
分辨力差，纯化倍
数低，蛋白质沉淀
中混杂大量盐分
蛋白质和酶的
分级沉淀
有机溶剂
沉淀
脱水作用和降低介
电常数
操作简便，分辨力
较强
对蛋白质或酶有变
性作用，成本较高
各种生物大分子
的分级沉淀
选择性沉淀
等电点、热变性、
酸碱变性等沉淀
作用
选择性较强，方法
简便，种类较多
应用范围较窄
各种生物大分子
的沉淀
结晶法
溶解度达到饱和，
溶质形成规则晶体
纯化效果较好，可
除去微量杂质，方
法简单
样品的纯度、浓度
都要很高，时间长
蛋白质或酶等
吸附层析
化学、物理吸附
操作简便
易受离子干扰
各种生物大分子的分离、脱色、和去热源
离子交换
层析
离子基团的交换
分辨力高，处理量
较大
需酸碱处理树脂平衡洗脱时间长
能带电荷的生物大分子
凝胶过滤
层析
分子筛的排阻效应
分辨力高，不会引
起变性
各种凝胶介质昂贵，处理量有限制
分子量有明显差别的可溶性生物大分子
分配层析
溶质在固定相和流动相中分配系数的差异
分辨力高，重复性
较好，能分离微量
物质
影响因子多，上样量太小
用于各种生物大
分子的分析鉴定
亲和层析
生物大分子与配体之间有特殊亲和力
分辨力很高
一种配体只能用于一种生物大分子，局限性大
各种生物大分子
聚焦层析
等电点和离子交换
作用
分辨力高
进口试制昂贵
蛋白质和酶
固相酶法
待分离物与固相载体之间有特异亲和力
分辨力高，用于连续生产
有局限性
抗体、抗原、酶
和底 物
等电聚焦
连续电泳
等电点的差异
分辨力很高 ，可连续制备
仪器试剂昂贵
蛋白质和酶
高速与超速离心
沉降系数或密度的差异
操作方便，容量大
离心机设备昂贵
各种生物大分子
超滤
分子量大小的差异
操作方便，可连续生产
分辨力低，只能部分纯化
各种生物大分子
制备HPLC
凝胶过滤、离子交换、反向色谱等
分辨力很高，直接制备出纯品
制备柱和HPLC仪器昂贵
各种生物大分子
在分离纯化流程中，早期和晚期的分离纯化方法的选择有明显的不同：
⑴ 早期分离纯化
特点：①粗提取液中物质成份十分复杂。②欲制备的生物大分子浓度很稀。
③物理化学性质相近的物质很多。④希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。
2) 对所选方法的要求：①要快速、粗放。②能较大地缩小体积。③分辨力不必太高。④负荷能力要大。
3) 可选用的方法：吸附；萃取；沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；离子交换（批量吸附、胖柱交换）；亲和层析等。
⑵晚期分离纯化
1) 可选用的方法：吸附层析、盐析、凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、等电聚焦制备电泳、制备HPLC等。
2)要注意的一些问题：
①盐析后要及时脱盐。
②用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。
③必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如分级有机溶剂沉淀，分级盐析，连续两次凝胶过滤或离子交换层析等。
④分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。
⑤分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。
⑥得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，－20℃ 或
－70℃保存。
3. 层析技术
3.1 层析技术概述
3.1.1 引言
层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。如图3－1 所示：
图 7 叶绿素通过CaCO3管柱所形成的色谱图
淋洗液：石油醚
当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。
随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。
3.1.2 层析的基本理论
层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。
对于一个层析柱来说，可作如下基本假设：
1. 层析柱的内径和柱内的填料是均匀的，而且层析柱由若干层组成。每层高度为H，称为一个理论塔板。塔板一部分为固定相占据，一部分为流动相占据，且各塔板的流动相体积相等，称为板体积，以Vm表示。
2. 每个塔板内溶质分子在固定相与流动相之间瞬间达到平衡，且忽略分子纵向扩散。
3. 溶质在各塔板上的分配系数是一常数，与溶质在塔板的量无关。
4. 流动相通过层析柱可以看成是脉冲式的间歇过程（即不连续过程）。从一个塔板到另一个塔板流动相体积为Vm。当流过层析柱的流动相的体积为V时，则流动相在每个塔板上跳越的次数为n:
n =
5. 溶质开始加在层析柱的第零塔板上。根据以上假定，将连续的层析过程分解成了间歇的动作，这与多次萃取过程相似，一个理论塔板相当于一个两相平衡的小单元。
3.1.3 层析的基本概念
1. 固定相：
固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。
2. 流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。
3. 分配系数及迁移率（或比移值）：
分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。
K=Cs/Cm
其中Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。
迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。（Rf ( 1）可以看出：
K ( ( Rf (；反之，K( ( Rf (
实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比值。它可以小于等于1，也可以大于1。用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然，差异越大，分离效果越理想。
分配系数主要与下列因素有关：①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。对于温度的影响有下列关系式：
lnK = －((G0/RT)
式中： K为分配系数（或平衡常数）
(G0为标准自由能变化
R为气体常数
T为绝对温度
这是层析分离的热力学基础。一般情况下，层析时组分的(G0为负值，则温度与分配系数成反比关系。通常温度上升20(C, K值下降一半，它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。有时对于K值相近的不同物质，可通过改变温度的方法，增大K值之间的差异，达到分离的目的。
4. 分辨率（或分离度）
分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。图3－2 是计算分辨率的示意图。
图 3－2 计算分辨率示意图
VR1 ：组分1从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积
VR2 ：组分2从进样点到对应洗脱峰值之间洗脱液的总体积
W1 ：组分1的洗脱峰宽度
W2 ：组分2的洗脱峰宽度
Y ：组分1和2洗脱峰值处洗脱液的总体积之差值
分辨率： Rs = =
由上式可见，Rs值越大，两种组分分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有教好的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求较高的分辨率。
为了提高分辨率Rs 的值，可采用以下方法：
⑴ 使理论塔板数N增大，则Rs上升。
① 增加柱长，N可增大，可提高分离度，但它造成分离的时间加长，洗脱液体积增大，并使洗脱峰加宽，因此不是一种特别好的办法。
② 减小理论塔板的高度。如减小固定相颗粒的尺寸，并加大流动相的压力。高效液相色谱(HPLC)就是这一理论的实际应用。一般液相层析的固定相颗粒为100(m；而HPLC柱子的固定相颗粒为10(m以下，且压力可达150kg/cm。它使Rs大大提高，也使分离的效率大大提高了。
③ 采用适当的流速，也可使理论塔板的高度降低，增大理论塔板数。太高或太低的流速都是不可取的。对于一个层析柱，它有一个最佳的流速。特别是对于气相色谱，流速影响相当大。
⑵ 改变容量因子D（固定相与流动相中溶质量的分布比）。一般是加大D，但D的数值通常不超过10，再大对提高Rs不明显，反而使洗脱的时间延长，谱带加宽。一般D限制在1 ( D ( 10，最佳范围在1.5-5之间。我们可以通过改变柱温（一般降低温度），改变流动相的性质及组成（如改变pH值，离子强度，盐浓度，有机溶剂比例等），或改变固定相体积与流动相体积之比（如用细颗粒固定相，填充的紧密与均匀些），提高D值，使分离度增大。
⑶ 增大(（分离因子，也称选择性因子，是两组分容量因子D之比），使Rs变大。实际上，使 ( 增大，就是使两种组分的分配系数差值增大。同样，我们可以通过改变固定相的性质、组成，改变流动相的性质、组成，或者改变层析的温度，使 ( 发生改变。应当指出的是，温度对分辨率的影响，是对分离因子与理论塔板高度的综合效应。因为温度升高，理论塔板高度有时会降低，有时会升高，这要根据实际情况去选择。通常，( 的变化对Rs影响最明显。
总之，影响分离度或者说分离效率的因素是多方面的。我们应当根据实际情况综合考虑，特别是对于生物大分子，我们还必须考虑它的稳定性，活性等问题。如pH值、温度等都会产生较大的影响，这是生化分离绝不能忽视的。否则，我们将不能得到预期的效果。
5. 正相色谱与反相色谱
正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱中流出来。
反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。
一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。
6. 操作容量（或交换容量）
在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，我们称为操作容量（或交换容量）。它的单位是毫摩尔（或毫克）/克（基质）或毫摩尔（或毫克）/毫升（基质），数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。应当注意，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。因此，实际操作时，加入的样品量要尽量少些，特别是生物大分子，样品的加入量更要进行控制，否则用层析办法不能得到有效的分离。
3.1.4 层析法的分类
层析根据不同的标准可以分为多种类型:
1. 根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填装在管中形成柱形，在柱中进行层析。纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高效液相色谱等都通常采用柱层析形式。
2. 根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。气相层析是指流动相为气体的层析，而液相层析指流动相为液体的层析。气相层析测定样品时需要气化，大大限制了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸等小分子的分析鉴定。而液相层析是生物领域最常用的层析形式，适于生物样品的分析、分离。
3. 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
吸附层析是以吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附力不同而达到分离目的的一种层析技术。
分配层析是根据在一个有两相同时存在的溶剂系统中，不同物质的分配系数不同而达到分离目的的一种层析技术。
凝胶过滤层析是以具有网状结构的凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分子大小进行分离的一种层析技术。
离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而进行分离的一种层析技术。
亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术，具有很高分辨率。
3.1.5 柱层析的基本装置及基本操作
目前，最常用的层析类型是各种柱层析，下面就简述柱层析的基本装置及操作方法，薄层层析的装置和操作将在后面详细讨论。
1. 柱层析的基本装置
柱层析的基本装置示意图如图3－3 所示：
图3－3 柱层析的基本装置示意图
A：洗脱液混合瓶； B：洗脱液储液瓶
2. 柱层析的基本操作
柱层析的基本操作包括以下一些步骤：
⑴ 装柱
柱子装的质量好与差，是柱层析法能否成功分离纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。
首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1:10~50；凝胶柱可以选1:100~200，同时将柱子洗涤干净。
将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度的酸（0.5N~1N）、碱 （0.5N~1N）、盐（0.5M~1M）溶液洗涤处理，以除去其表面可能吸附的杂质。然后用去离子水（或蒸馏水）洗涤干净并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。
关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。
打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液。（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。）注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。
最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2~3cm高的缓冲液，同时关闭出水口。（采用机械化装柱法在此省略。）
⑵ 平衡
柱子装好后，要用所需的缓冲液（有一定的pH和离子强度）平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3~5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。如果需要，可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的。有时柱子平衡好后，还要进行转型处理。这方面的内容在离子交换层析中加以介绍。
⑶ 加样
加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。
应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。详细操作见层析实验。
⑷ 洗脱
当我们选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。
简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。
分步洗脱：这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种，如图3－4 所示（以盐浓度梯度为例）：
图3－4 柱层析中形成洗脱梯度的三种形式示意图
A；混合液瓶（低浓度盐溶液）；B：储液瓶（高浓度盐溶液）。
我们可以通过下式计算得到流经层析柱的洗脱液中盐浓度的计算公式：
C = CB - ( CB - CA ) ( 1 - V2 / V1 )B1 / A1
式中： C ：流经层析柱的洗脱液的盐浓度
CB ：梯度混合器中B 瓶的盐浓度（不搅拌）
CA ：梯度混合器中A 瓶的盐浓度（搅拌）
B1 ：B 瓶的横切面积
A1 ：A 瓶的横切面积
V2 ：流经层析柱的洗脱液体积
V1 ：梯度洗脱液总体积
洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，我们必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。
⑸ 收集、鉴定及保存
在生化实验中，基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5ml / 管。这视具体情况而定。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，我们要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。
⑹ 基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生
许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。
3.2 凝胶层析
3.2.1 简介
凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
3.2.2 凝胶层析的基本原理
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图11 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
图 3－5 凝胶层析分离原理示意图
(1) 凝胶颗粒 (2) 小分子组分
(3) 中等分子组分 (4) 大分子组分
3.2.3 凝胶层析的基本概念
1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积
如图 3－6 所示，外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：
Vt＝Vo＋Vi＋Vg
由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：
Vt＝Vo＋Vi
图 3－6 凝胶层析柱各种体积示意图（阴影部分）
设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。有时可能会出现Ve ( Vt，这是由于这种分子与凝胶有吸附作用造成的。凝胶层析中的几种洗脱峰如图 3－7 所示：
图 3－7 凝胶层析洗脱曲线示意图
(1) 完全排阻的大分子 (2) 中等分子
(3) 完全渗透的小分子 (4) 吸附分子
柱床体积Vt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。
2. 分配系数
分配系数是指某个组分在固定相和流动相中的浓度比。对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配系数通常表示为：
前面介绍了Vt和Vo都是可以测定的，所以测定了某个组分的Ve就可以得到这个组分的分配系数。对于一定的层析条件，Vt和Vo都是恒定的，大分子先被洗脱出来，Ve值小，Kav值也小。而小分子后被洗脱出来，Ve值大，Kav值也大。对于完全排阻的大分子，Ve＝Vo，故Kav＝0。而对于完全渗透的大分子，Ve＝Vt，故Kav＝1。一般Kav值在0－1之间，如Kav值大于1，则表示这种物质与凝胶有吸附作用。
对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系：
Kav＝－b lg MW＋c
其中b、c为常数，MW表示物质的分子量。另外由于Ve和Kav也成线性关系，所以同样有：
Ve＝－b’ lg MW＋c’
其中b’、c’为常数。这样我们通过将一些已知分子量的标准物质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。这就是凝胶层析测定分子量的基本原理，这种方法在后面的应用中还将详细介绍。
3. 排阻极限
排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。
4. 分级分离范围
分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,000－70,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。
5. 吸水率和床体积
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。
6. 凝胶颗粒大小
层析用的凝胶一般都成球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（(m）来表示。柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关。颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢。一般比较常用的是100－200目。
3.2.4 凝胶的种类和性质
凝胶的种类很多，常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（dextran）、聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide）、琼脂糖凝胶（agarose）以及聚丙烯酰胺和琼脂糖之间的交联物。另外还有多孔玻璃珠、多孔硅胶、聚苯乙烯凝胶等等。下面将分别介绍。
1. 葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是指由天然高分子－葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。葡聚糖凝胶主要由Pharmacia Biotech生产。常见的有两大类，商品名分别为Sephadex和Sephacryl。
葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。Sephadex 的主要型号是G-10 ( G-200，后面的数字是凝胶的吸水率（单位是ml / g干胶）乘以10。如Sephadex G-50，表示吸水率是5ml/g干胶。Sephadex的亲水性很好，在水中极易膨胀，不同型号的Sephadex的吸水率不同，它们的孔穴大小和分离范围也不同。数字越大的，排阻极限越大，分离范围也越大。Sephadex中排阻极限最大的G-200为6(105。Sephadex在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液以及有机溶液中都是比较稳定的，可以多次重复使用。Sephadex稳定工作的pH一般为为2－10。强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂，所以要避免Sephadex与强酸和氧化剂接触。Sephadex在高温下稳定，可以煮沸消毒，在100 (C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。Sephadex由于含有羟基基团，故呈弱酸性，这使得它有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。所以在用Sephadex进行凝胶层析实验时常使用一定浓度的盐溶液作为洗脱液，这样就可以避免Sephadex与蛋白发生吸附，但应注意如果盐浓度过高，会引起凝胶柱床体积发生较大的变化。Sephadex有各种颗粒大小（一般有粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。要根据分离要求来选择颗粒大小。Sephadex的机械稳定性相对较差，它不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。
另外，Sephadex G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，形成LH型烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为Sephadex LH-20和LH-60，适用于以有机溶剂为流动相，分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸激素等。
Sephacryl是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺（N, N’-methylenebisacrylamide）交联而成。是一种比较新型的葡聚糖凝胶。Sephacryl的优点就是它的分离范围很大，排阻极限甚至可以达到108，远远大于Sephadex的范围。所以它不仅可以用于分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。 Sephacryl与Sephadex相比另一个优点就是它的化学和机械稳定性更高：Sephacryl在各种溶剂中很少发生溶解或降解，可以用各种去污剂、胍、脲等作为洗脱液，耐高温，Sephacryl稳定工作的pH一般为
3~11。另外Sephacryl的机械性能较好，可以以较高的流速洗脱，比较耐压，分辨率也较高，所以Sephacryl相比Sephadex可以实现相对比较快速而且较高分辨率的分离。
2. 聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺（acrylamide）与甲叉双丙烯酰胺交联而成。改变丙烯酰胺的浓度，就可以得到不同交联度的产物。聚丙烯酰胺凝胶主要由Bio-Rad Laboratories生产，商品名为Bio-Gel P，主要型号有Bio-Gel P-2 ( Bio-Gel P-300等10种，后面的数字基本代表它们的排阻极限的10-3，所以数字越大，可分离的分子量也就越大。各种型号的主要参数如附表所示。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围、吸水率等性能基本近似于Sephadex。排阻极限最大的Bio-Gel P-300为4(105。聚丙烯酰胺凝胶在水溶液、一般的有机溶液、盐溶液中都比较稳定。聚丙烯酰胺凝胶在酸中的稳定性较好，在pH为1~10之间比较稳定。但在较强的碱性条件下或较高的温度下，聚丙烯酰胺凝胶易发生分解。聚丙烯酰胺凝胶非常亲水，基本不带电荷，所以吸附效应较小。另外，聚丙烯酰胺凝胶不会象葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶那样可能生长微生物。聚丙烯酰胺凝胶对芳香族、酸性、碱性化合物可能略有吸附作用，使用离子强度略高的洗脱液就可以避免。
3. 琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离出来的天然线性多糖，它是琼脂去掉其中带电荷的琼脂胶得到的。琼脂糖是由D－半乳糖（D-galactose）和3,6－脱水半乳糖（anhydrogalactose）交替构成的多糖链。它在100 (C时呈液态，当温度降至45 (C以下时，多糖链以氢键方式相互连接形成双链单环的琼脂糖，经凝聚即成为束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶的商品名因生产厂家不同而异，常见的主要有Pharmacia Biotech生产的Sepharose（2B ( 4B）和Bio-Rad Laboratories生产的Bio-gel A等。关于各种琼脂糖凝胶的基本参数如附表所示。琼脂糖凝胶在pH为4－9之间是稳定的，它在室温下很稳定，稳定性要超过一般的葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶对样品的吸附作用很小。另外琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好，一般好于前两种凝胶，在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快。琼脂糖凝胶的排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低。琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以0－30 (C为宜。
Sepharose与2,3二溴丙醇反应，形成Sepharose CL型凝胶（CL-2B ( CL-4B），它们的分离特性基本没有改变，但热稳定性和化学稳定性都有所提高，可以在更广泛的pH范围内应用，稳定工作的pH范围为3－13。Sepharose CL型凝胶还特别适合于含有有机溶剂的分离。
4. 聚丙烯酰胺和琼脂糖交联凝胶
这类凝胶是由交联的聚丙烯酰胺和嵌入凝胶内部的琼脂糖组成。它们主要由LKB提供，商品名为Ultragel。这种凝胶由于含有聚丙烯酰胺，所以有较高分辨率；而它又含有琼脂糖，这使得它又有较高的机械稳定性，可以使用较高的洗脱速度。调整聚丙烯酰胺和琼脂糖的浓度可以使Ultragel有不同的分离范围，
5. 多孔硅胶、多孔玻璃珠
多孔硅胶和多孔玻璃珠都属于无机凝胶。顾名思义，它们就是将硅胶或玻璃制成具有一定直径的网孔状结构的球形颗粒。这类凝胶属于硬质无机凝胶，它们的最大的特点是机械强度很高、化学稳定性好，使用方便而且寿命长，无机胶一般柱效较低，但用微粒的多孔硅胶制成的HPLC柱也可以有很高的柱效，可以达到4(104塔板 / 米。多孔玻璃珠易破碎，不能填装紧密，所以柱效相对较低。多孔硅胶和多孔玻璃珠的分离范围都比较宽，多孔硅胶一般为102－5(106，多孔玻璃珠一般为3(103－9(106。它们的最大缺点是吸附效应较强（尤其是多孔硅胶），可能会吸附比较多的蛋白，但可以通过表面处理和选择洗脱液来降低吸附。另外它们也不能用于强碱性溶液，一般使用时pH应小于8.5。
另外值得一提的是各类凝胶技术近年来发展得很快，目前已研制出很多性能优越的新型凝胶。例如Pharmacia Biotech的Superdex和Superrose，Superdex的分辨率非常高，化学物理稳定性也很好，可以用于FPLC、HPLC分析；而Superose的分离范围很广，分辨率较高，可以一次性的分离分子量差异较大的混合物。同时它的机械稳定性也很好。关于各种凝胶产品的详细情况可以参阅本书附录以及各个公司的产品目录。
3.2.5 凝胶的选择、处理和保存
1. 凝胶的选择
通过前面的介绍可以看到凝胶的种类、型号很多。不同类型的凝胶在性质以及分离范围上都有较大的差别，所以在进行凝胶层析实验时要根据样品的性质以及分离的要求选择合适的凝胶，这是影响凝胶层析效果好坏的一个关键因素。
一般来讲，选择凝胶首先要根据样品的情况确定一个合适的分离范围，根据分离范围来选择合适型号的凝胶。一般的凝胶层析实验可以分为两类：分组分离（group separations）和分级分离（fractionations），分组分离是指将样品混合物按分子量大小分成两组，一组分子量较大，另一组分子量较小。例如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等。分级分离则是指将一组分子量比较接近的组分分开。在分组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，这样分离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型。分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型，凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量，另一方面要合适，不能过大。如果分离范围选择过小，则某些组分不能得到分离；如分离范围选择过大，则分辨率较低，分离效果也不好。
选择凝胶另外一个方面就是凝胶颗粒的大小。颗粒小，分辨率高，但相对流速慢，实验时间长，有时会造成扩散现象严重；颗粒大，流速快，分辨率较低但条件得当也可以得到满意的结果。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。由于凝胶一般都比较稳定，所以它在一般的实验条件下都可以正常的工作。如果实验条件比较特殊，如在较强的酸碱中进行或含有有机溶剂等等，则要仔细查看凝胶的工作参数，选择合适的类型的凝胶。
2. 凝胶的处理
凝胶使用前要首先要进行处理。选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量。由于市售的葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶通常是无水的干胶，所以要计算干胶用量：干胶用量（g）＝柱床体积（ml）/ 凝胶的床体积（ml / g）。 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加10％－20％。
葡聚糖凝胶和丙烯酰胺凝胶干胶的处理首先是在水中膨化，不同类型的凝胶所需的膨化时间不同。一般吸水率较小的凝胶（即型号较小、排阻极限较小的凝胶）膨化时间较短，在20 (C条件下需3－4小时；但吸水率较大的凝胶（即型号较大、排阻极限较大的凝胶）膨化时间则较长，20 (C条件下需十几个到几十个小时，如Sephadex G-100以上的干胶膨化时间都要在72小时以上。如果加热煮沸，则膨化时间会大大缩短，一般在1－5小时即可完成，而且煮沸也可以去除凝胶颗粒中的气泡。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏。琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理。另外多孔玻璃珠和多孔硅胶也不需膨化处理。
膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡。纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。也可以一定的酸或碱浸泡一段时间，再用水洗至中性。排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡。
3. 凝胶的保存
凝胶的保存一般是反复洗涤去除蛋白等杂质，然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02％的叠氮化钠，4 (C下保存。如果要较长时间的保存，则要将凝胶洗涤后脱水、干燥，可以将凝胶过滤抽干后浸泡在50％的乙醇中脱水，抽干后再逐步提高乙醇浓度反复浸泡脱水，至95％乙醇脱水后将凝胶抽干。置于60 (C烘箱中烘干，即可装瓶保存。注意膨化的凝胶不能直接高温烘干，否则可能会破坏凝胶的结构。
3.2.6 凝胶层析的基本操作
凝胶层析的基本操作步骤与前面介绍的柱层析的操作过程基本相似，这里就不再重复了。下面主要介绍凝胶层析操作中应注意的一些具体问题。
1. 层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。
2. 凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。
3. 洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
4. 加样量
关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过（Ve1－Ve2）。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。
5. 洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm / hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。
总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。但正如前面讲过的，各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。另外需要提的一点是，实验时应尽可能的参考相关实验和文献以及进行预实验，以选择最合适的实验条件。
3.2.7 凝胶层析的应用
前面介绍了凝胶层析的基本理论以及基本实验操作，下面简单介绍一下凝胶层析在生物学方面的应用。
1. 生物大分子的纯化
凝胶层析是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶层析成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶层析无疑是一种合适的方法。例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。
2. 分子量测定
前面已经介绍了，在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。
Kav＝－b lg MW＋c
Ve＝－b’ lg MW＋c’
由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。凝胶层析测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶层析不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶层析测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶层析的线性范围之内。
3. 脱盐及去除小分子杂质
利用凝胶层析进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 DG或Ultragel AcA 202等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。
4. 去热源物质
热源物质是指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使人体发热的物质。它们是一类分子量很大的物质，所以可以利用凝胶层析的排阻效应将这些大分子热源物质与其它相对分子量较小的物质分开。例如对于去除水、氨基酸、一些注射液中的热源物质，凝胶层析是一种简单而有效的方法。
5. 溶液的浓缩
利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。
3.3 离子交换层析
3.3.1 简介
离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
3.3.2 基本原理
离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为：
阳离子交换反应：( R(X( ) Y( + A( ( ( R(X( ) A( + Y(
阴离子交换反应：( R(X( ) Y( + A( ( ( R(X( ) A( + Y(
其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X( 和X( 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y( 和Y( 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A( 和A( 分别代表溶液中的离子基团。
从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。
各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的，是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关，包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异，并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲，离子价数越高，结合力越大；价数相同时，原子序数越高，结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：Li( < Na( < K( < Rb( < Cs( ；Na( < Ca2( < Al3( < Ti4( 。蛋白质等生物大分子通常呈两性，它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例，在一定的pH条件下，等电点pI < pH的蛋白带负电，不能与阳离子交换剂结合；等电点pI > pH的蛋白带正电，能与阳离子交换剂结合，一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响，一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计，往往要通过实验进行摸索。
3.3.3 离子交换剂的种类和性质
1. 离子交换剂的基质
离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成，聚苯乙烯离子交换剂（又称为聚苯乙烯树脂）是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小，具有较强的疏水性，容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素（Cellulose）、球状纤维素（Sephacel）、葡聚糖（Sephadex）、琼脂糖（Sepharose）为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力，适合于分离蛋白质等大分子物质，葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G－25和G－50为基质，琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL－6B为基质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
2. 离子交换剂的电荷基团
根据与基质共价结合的电荷基团的性质，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
阳离子交换剂的电荷基团带负电，可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型完全解离的pH范围则较小，如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团（(SO3H），如磺酸甲基（简写为SM）、磺酸乙基（SE）等为强酸型离子交换剂，结合磷酸基团（(PO3H2）和亚磷酸基团（(PO2H）为中等酸型离子交换剂，结合酚羟基（(OH ）或羧基（(COOH），如羧甲基（CM）为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子小，弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子大。
阴离子交换剂的电荷基团带正电，可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同，可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团（(N(CH3)3），如季胺乙基（QAE）为强碱型离子交换剂，结合叔胺（(N(CH3)2）、仲胺（(NHCH3）、伯胺（-NH2）等为中等或弱碱型离子交换剂，如结合二乙基氨基乙基（DEAE）为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH(离子的结合力比Cl(离子小，弱酸型离子交换剂对OH(离子的结合力比Cl(离子大。
3. 交换容量
交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它不仅与所用的离子交换剂有关，还与实验条件有很大的关系，一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。
影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入，这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品，可以选择较小孔隙的交换剂，因为小分子可以自由的进入孔隙，而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品，可以选择小颗粒交换剂，因为对于很大的分子，一般不能进入孔隙内部，交换只限于颗粒表面，而小颗粒的离子交换剂表面积大。
另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大，如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时，电荷基团充分解离，交换容量大，而在较低的pH时，电荷基团不易解离，交换容量小。同时pH也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质，在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说，离子强度增大，交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱，就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。
离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数（meq / mg或meq / ml）来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl处理，使其平衡离子为H(。再用水洗至中性，对于强酸型离子交换剂，用NaCl充分置换出H(，再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl，就可以计算出离子交换剂的交换容量；对于弱酸型离子交换剂，用一定量的碱将H(充分置换出来，再用酸滴定，计算出离子交换剂消耗的碱量，就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。
对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示，一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。
3.3.4 离子交换剂的选择、处理和保存
1. 离子交换剂的选择
离子交换剂的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换剂。
首先是对离子交换剂电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换剂；如带负电，则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的pH范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。
其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH变化有较大改变，影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。
另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（(m）来表示，目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换剂适于需要高分辨率的分析或分离。
这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）和CM-纤维素（羧甲基纤维素）最常用，它们在生物大分子物质（蛋白质，酶，核酸等）的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构，有较大的表面积，大分子可自由通过，使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多；二是它具有亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的，因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。
2. 离子交换剂的处理和保存
离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化，将干粉在水中充分溶胀，以使离子交换剂颗粒的孔隙增大，具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡，每一种试剂处理后要用水洗至中性，再用另一种试剂处理，最后再用水洗至中性，这是为了进一步去除杂质，并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型（即平衡离子是Na离子），阴离子交换剂为Cl型，因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理，阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl，碱是NaOH或再加一定的NaCl，这样处理后阳离子交换剂为Na型，阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L，浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高，以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡，否则会影响分离效果。
离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理，使其恢复原来性状的过程。前面介绍的酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用HCl处理可将其转为Cl型，用NaOH处理可转为OH型，用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的，都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。
前面已经介绍了，离子交换层析就是通过离子交换剂上的平衡离子与样品中的组分离子进行可逆的交换而实现分离的目的，因此在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子，使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强，会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中，平衡离子被置换到流动相中，它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子，因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时，一般不能使用H或OH型离子交换剂，因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值，影响分离效果，甚至引起蛋白质的变性。
离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质，并加入适当的防腐剂，一般加入0.02 %的叠氮钠，4(C下保存。
3.3.5 离子交换层析的基本操作
离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似，这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。
1. 层析柱
离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。
2. 平衡缓冲液
离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换，所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH的选择对于分离效果有很大的影响。
平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下（如污水处理）可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合，而样品与离子交换剂结合不稳定，也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液，直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适，可能会对后面的洗脱带来困难，无法得到好的分离效果。
3. 上样
离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。
4. 洗脱缓冲液
在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变pH的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了，可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好，故通常采用线性梯度进行洗脱。
洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些，以提高分辨率。
5. 洗脱速度
洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果，洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好，但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用，所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠，则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率；如果分辨率较好，但洗脱峰过宽，则可适当提高洗脱速度。
6. 样品的浓缩、脱盐
离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高，而且体积较大，样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。
3.3.6 离子交换层析的应用
离子交换层析的应用范围很广，主要有以下几个方面。
1. 水处理
离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过H( 型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过OH( 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。
2. 分离纯化小分子物质
离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2~3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。
3. 分离纯化生物大分子物质
离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性，一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性，只要选择合适的条件，通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。
3.4 亲和层析
3.4.1 简介
亲和层析（Affinity Chromatography）是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合，可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技术上的限制，主要是没有合适的固定配体的方法，所以在实验中没有广泛的应用。直到60年代末，溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现，解决了配体固定化的问题，使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术，分离过程简单、快速，具有很高的分辨率，在生物分离中有广泛的应用。同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。
3.4.2 亲和层析的基本原理
生物分子间存在很多特异性的相互作用，如我们熟悉的抗原－抗体、酶－底物或抑制剂、激素－受体等等，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体，例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体，分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不溶性基质上，如常用的Sepharose－4B等。将制备的亲和吸附剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时候，待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。
前面介绍的一些层析方法，如吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异，如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小，所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用，这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间，而且使待分离物的回收率降低，也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质－亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性，使得亲和层析的分辨率很高，是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
3.4.3 亲和吸附剂
选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。这里主要介绍一些基本的原理，关于活化、偶联等过程的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考书。
1. 基质
⑴ 基质的性质
基质构成固定相的骨架，亲和层析的基质应该具有以下一些性质：
1) 具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的pH、离子强度等条件下，基质的性质都没有明显的改变。
2) 能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团，通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合，并且结合后不改变基质和配体的基本性质。
3) 基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透，并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应，使被分离物与配体结合的机率下降，降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说，多选择较大孔径的基质，以使待分离物有充分的空间与配体结合。
4) 基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附，不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性，以使生物分子易于靠近并与配体作用。
一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质，其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低，可利用的活性基团较多，但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用，另外它的稳定性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好，但它们的孔径相对比较小，而且孔径的稳定性不好，可能会在与配体偶联时有较大的降低，不利待分离物与配体充分结合，只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好，化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少，对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。琼脂糖凝胶则基本可以较好的满足上述四个条件，它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点，因此得到了广泛的应用，如Pharmacia公司的Sepharose－4B、6B是目前应用较多的基质。
⑵ 基质的活化
基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联，通常首先要进行基质的活化。
1) 多糖基质的活化
前面已经介绍了，多糖基质尤其是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基，通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多，下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。
① 溴化氰活化
溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨基（NH2）反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：
含有伯氨基的配体，如氨基酸、蛋白质都可以结合在基质上，对于蛋白质而言，最可能发生反应的基团是N－末端的(－氨基和赖氨酸残基上的(－氨基。
溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合，结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。通过实验条件的不断改进，这些缺点可以得到一定程度的控制。
②环氧乙烷基活化
这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。如在含有NaBH4的碱性条件下，1，4－丁二醇－双缩水甘油醚的一个环氧乙烷基可以与羟基反应，而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。另外也可以用环氧氯丙烷活化，将环氧乙烷基结合在基质上。
由于活化后的基质都含有环氧乙基，可以结合含有伯氨基（NH2）、羟基（OH）和硫醇基（SH）等基团的配体，反应如下：
这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－C和S－C键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9~13，温度为
20~40 (C。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。
上面两种方法是比较常用的方法，另外还有很多种活化方法如：N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化、三嗪（triazine）活化、高碘酸盐（periodate）活化、羰酰二咪唑（carbonyldiimidazole）活化、2,4,6－三氟5－氯吡啶（FCP）活化、乙二酸酰肼（adipic acid dihydrazide）活化、二乙烯砜（divinylsulfone）活化等，总之，目前对基质的活化方法很多，各有其特点，应根据实际需要选择适当的活化方法。
2) 聚丙烯酰胺的活化
聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基，可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式：氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。
3) 多孔玻璃珠的活化
对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺－玻璃，在多孔玻璃上引进氨基，再通过这些氨基进一步反应引入活性基团，与适当的配体偶联。
⑶间隔臂分子
在亲和层析中，由于配体结合在基质上，它在与待分离的生物大分子结合时，很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时，由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质，而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍，使得其与配体结合的部位无法接近配体，影响了待分离的生物大分子与配体的结合，造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”，即加入一段有机分子，使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长，这样就可以减少空间位阻效应，大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入手臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易造成弯曲，反而降低吸附效率。
引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物NH2 (CH2)n R共价结合到活化的基质上，R通常是氨基或羧基，n一般为2－12。例如Pharmacia公司生产的AH－Sepharose 4B和CH－Sepharose 4B就是分别将1,6－乙二胺，6－氨基乙酸与CNBr活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者的末端分别为氨基或羧基，通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联，反应如下：
另外也可以通过进一步的活化处理，生成N－羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时，配体就可以离开基质一定的空间，从而可以减少空间位阻效应，易于与待分离物质结合。
2. 配体
⑴ 配体的性质
亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的，所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质：
1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。
2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。
3) 配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有明显影响。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。
完全满足上述条件的配体实际上很难找到，在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体（general ligand）。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。在后面的亲和层析应用中将详细介绍实验中各种常用的配体。
⑵ 配体与基质的偶联
除了前面已经介绍了基质的一些活化基团外，通过对活化基质的进一步处理，还可以得到更多种类的活性基团。这些活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应，使配体偶联在基质上。另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。以上这些方法使得几乎任何一种配体都可以找到适当的方法与基质偶联。关于配体和基质偶联的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考文献。
配体和基质偶联完毕后，必须要反复洗涤，以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团，也就是使基质失活，以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团，常用的方法是用2－乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。
配体与基质偶联后，通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况，同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多，下面简单介绍几种：
1) 差量分析：根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时，这种方法还是相当准确的。
2) 直接光谱测量：对于能够吸收250nm以上波长的配体，可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。
3) 凝胶溶解：通过适当的方法将凝胶溶解，如75(C下与酸或碱作用，而后直接用光谱法测量。
4) 酸或酶的水解：用酸或酶作用，使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。
5) 2,4,6－三硝基苯磺酸钠（TNBS）分析：利用TNBS与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色，可以计算出配体结合量
6) 元素分析：如果配体中含有某种特别的元素，通过元素分析就可以确定配体结合量。
7) 放射性分析法：偶联中加入一定量带有同位素的配体，通过放射性分析确定配体结合量，这是一种非常灵敏的方法。
影响配体结合量的因素很多，包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等等。例如通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的基质多，配体结合量可能较大。在用溴化氰活化时，增加溴化氰的量及反应的pH，可以增加基质上活化基团的量，从而增大配体结合量。偶联过程中增加配体的量及增大反应的pH，也可以增大配体结合量。实验中通常希望配体结合量较高，但应注意增加配体结合量应根据实际情况，还要考虑到其它因素的影响。因为提高配体的结合量不等价于提高亲和吸附剂的吸附容量，配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素，还有很多因素，如基质、配体以及待分离物质本身的性质，配体在基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量，但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构，降低配体和待分离物质的亲和力，这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的，各种因素的影响都不是绝对的，要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素，并通过实验摸索来选择合适的条件。
目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售，可以省去基质活化，配体偶联等复杂的步骤。使用方便，效果好，但一般价格昂贵。关于这些产品的具体情况，可参阅本书后面的参考文献或相关的产品介绍。
3. 亲和吸附剂的再生和保存
亲和吸附剂的再生就是指使用过的亲和吸附剂，通过适当的方法使去除吸附在其基质和配体（主要是配体）上结合的杂质，使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力。一般情况下，使用过的亲和层析柱，用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤，再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情况下，尤其是当待分离样品组分比较复杂的时候，亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附，使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段，使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质，则应注意处理时不能改变配体的活性。
亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%的叠氮化钠，4(C下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。
3.4.4 亲和层析的基本操作
亲和吸附剂选择制备后，亲和层析的其它操作与一般的柱层析基本类似。下面主要介绍亲和层析过程中的一些注意事项。
1. 上样
亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短，通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件，包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等，以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。
一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢，所以样品液的浓度不易过高，上样时流速应比较慢，以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时，可以在上样后停止流动，让样品在层析柱中反应一段时间，或者将上样后流出液进行二次上样，以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度，以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。
生物分子间的亲和力是受温度影响的，通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度，使待分离的物质与配体有较大的亲和力，能够充分的结合；而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度，使待分离的物质与配体的亲和力下降，以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。
上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些，但如果待分离物质与配体结合较弱，平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附，可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤，但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响，以免将待分离物质同时洗下。
2. 洗脱
亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。
⑴ 特异性洗脱
特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。
特异性洗脱也可以分为两种：一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，在适当的条件下，如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大，配体就会基本被这种物质占据，原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时，选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液，这种物质与配体竞争对待分离物质的结合，在在适当的条件下，如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时，可以选择NAD+进行洗脱，NAD+是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强，可以进一步消除非特异性吸附的影响，从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况，使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件，很可能使蛋白质等生物大分子变性，有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来，使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢，所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件，可以通过适当的改变其它条件，如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等，来缩小洗脱时间和洗脱体积。
⑵ 非特异性洗脱
非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。
当待分离物质与配体亲和力较小时，一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗，就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来，这种洗脱方式简单、条件温和，不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大，得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时，可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力，具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式，这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质，可以选择酸性或碱性洗脱液，或较高的离子强度一次快速洗脱，这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性，而且洗脱后应注意中和酸碱，透析去除离子，以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时，可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性，而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。
3.4.5 亲和层析的应用
亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
1. 抗原和抗体
利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低，用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离，而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原，经动物免疫后制备抗体，将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂，就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强，其解离常数为10 (8－10 (12M，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力，以便于洗脱。
另外金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）能够与免疫球蛋白G（Ig G）结合，可以用于分离各种Ig G。
2. 生物素和亲和素
生物素（biotion）和亲和素（avidin）之间具有很强而特异的亲和力，可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强，其解离常数为10 (15M，洗脱通常需要强类的变性条件，可以选择biotion的类似物，如：
2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力，这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。另外，可以利用生物素和亲和素间的高亲和力，将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用，通过生物素与亲和素的亲和力，胰岛素就被固定在琼脂糖上，可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂（如生物素与NHS生成的酯）作用结合上生物素，并且不改变其生物活性，这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。
3. 维生素、激素和结合转运蛋白
通常结合蛋白含量很低，如1000升人血浆中只含有20毫克Vit B12结合蛋白，用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力（解离常数为10 (7－10 (16M）而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强，所以洗脱时可能需要较强烈的条件，另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。
4. 激素和受体蛋白
激素的受体蛋白属于膜蛋白，利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质，难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力（10 (6－10 (12M）而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。
5. 凝集素和糖蛋白
凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。如伴刀豆球蛋白A能结合含(-D-吡喃甘露糖苷或(-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白，麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用(-D-甲基甘露糖苷或(-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样，用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。
6. 辅酶
核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。
7. 多核苷酸和核酸
利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。
8. 氨基酸
固定化氨基酸是多用途的介质，通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力，或者通过氨基酸的疏水性等性质，可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L－精氨酸可以用于分离羧肽酶，L－赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。
9. 染料配体
结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构，所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力，可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用，使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。
10. 分离病毒、细胞
利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强，所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB，颗粒大、非特异性吸附小，适合用于细胞亲和层析。
11. 金属螯合色谱
金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸（IDA）等螯合剂，它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用，生成带有多个配位基的金属螯合物，可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如Cu2+－IDA配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。
12. 共价色谱
共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附，而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基－Sepharose、巯丙基－Sepharose等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上，通过适当的洗脱液如半胱氨酸，巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和，可以多次重复使用。
13. 疏水色谱
疏水色谱是指利用固定的疏水配体和蛋白质疏水表面区域之间的相互作用而进行分离的。例如用各种烷胺作为配体与基质结合，用于分离糖元磷酸化酶b等。
4 电泳技术
4.1 电泳技术发展简史
1809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。
1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。
1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。
从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。
1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。
由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。
4.2 电泳的基本原理
电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。电泳槽可以分为水平式和垂直式两类。垂直板式电泳是较为常见的一种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm ( 14 cm，厚度为1mm～2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以电泳过程应在适当的缓冲液中进行的，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。
为了更好的了解带电分子在电泳过程中是如何被分离的，下面简单介绍一下电泳的基本原理。在两个平行电极上加一定的电压（V），就会在电极中间产生电场强度（E），
上式中L是电极间距离。
在稀溶液中，电场对带电分子的作用力（F），等于所带净电荷与电场强度的乘积：
上式中q是带电分子的净电荷，E是电场强度。
这个作用力使得带电分子向其电荷相反的电极方向移动。在移动过程中，分子会受到介质粘滞力的阻碍。粘滞力（F’）的大小与分子大小、形状、电泳介质孔径大小以及缓冲液粘度等有关，并与带电分子的移动速度成正比，对于球状分子，F’的大小服从Stokes定律，即：
F’=6πrηυ
式中r是球状分子的半径，η是缓冲液粘度，υ是电泳速度(υ= d / t，单位时间粒子运动的距离，cm / s )。当带电分子匀速移动时： F = F’，
∴ q·E = 6πrηυ
电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度：
所以：
这就是迁移率公式，由上式可以看出，迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。
用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，实际使用的是相对迁移率mR。即：
上式中：d－带电粒子泳动的距离，t－电泳的时间，V－电压，L－两电极交界面之间的距离，即凝胶的有效长度。 因此，相对迁移率mR就是两种带电粒子在凝胶中泳动迁移的距离之比。
带电分子由于各自的电荷和形状大小不同，因而在电泳过程中具有不同的迁移速度，形成了依次排列的不同区带而被分开。即使两个分子具有相似的电荷，如果它们的分子大小不同，由于它们所受的阻力不同，因此迁移速度也不同，在电泳过程中就可以被分离。有些类型的电泳几乎完全依赖于分子所带的电荷不同进行分离，如等电聚焦电泳；而有些类型的电泳则主要依靠分子大小的不同即电泳过程中产生的阻力不同而得到分离，如SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离后的样品通过各种方法的染色，或者如果样品有放射性标记，则可以通过放射性自显影等方法进行检测。
4.3 影晌电泳分离的主要因素
由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素：
1. 待分离生物大分子的性质
待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。
2. 缓冲液的性质
缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。
3. 电场强度
电场强度（V/cm）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（W）为：
W=I2.R.t
上式中：I为电流强度，R为电阻，t为电泳时间。
电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响：
①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分离带通常呈弓型。降低电流强度，可以减小生热，但会延长电泳时间，引起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选择适当的电场强度，同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果。
4. 电渗
液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。
5. 支持介质的筛孔
支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。
4.4 电泳的分类
图 4－1 电泳分类示意图
a. 区带电泳 b. 移动界面电泳 c. 等速电泳 d. 等电聚焦
电泳按其分离的原理不同可分为：
⑴ 区带电泳：电泳过程中，待分离的各组分分子在支持介质中被分离成许多条明显的区带，这是当前应用最为广泛的电泳技术。
⑵ 自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。
⑶ 等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。
⑷ 等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。
按支持介质的不同可分为：
⑴ 纸电泳（Paper electrophorisis）
⑵ 醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）
⑶ 琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis）
⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel electrophoresis）（PAGE）
⑸ SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。
按支持介质形状不同可它为：
⑴ 薄层电泳 ； ⑵ 板电泳 ； ⑶ 柱电泳。
按用途不同可分为：
⑴ 分析电泳； ⑵ 制备电泳； ⑶ 定量免疫电泳； ⑷ 连续制备电泳。
按所用电压不同可分为：
⑴ 低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。
⑵ 高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。
4.5 纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳
纸电泳是用滤纸作支持介质的一种早期电泳技术。尽管分辨率比凝胶介质要差，但由于其操作简单，所以仍有很多应用，特别是在血清样品的临床检测和病毒分析等方面有重要用途。
纸电泳使用水平电泳槽。分离氨基酸和核苷酸时常用pH 2～3.5的酸性缓冲液，分离蛋白质时常用碱性缓冲液。选用的滤纸必须厚度均匀，常用国产新华滤纸和进口的Whatman 1号滤纸。点样位置是在滤纸的一端距纸边5cm～10cm处。样品可点成园形或长条形，长条形的分离效果较好。点样量为5(g～100(g和5(l～10(l。点样方法有干点法和湿点法。湿点法是在点样前即将滤纸用缓冲液浸湿，样品液要求较浓，不亦多次点样。干点法是在点样后再用缓冲液和喷雾器将滤纸喷湿，点样时可用吹风机吹干后多次点样，因而可以用较稀的样品。电泳时要选择好正、负极，电压通常使用2～10 V/cm的低压电泳，电泳时间较长。对于氨基酸和肽类等小分子物质，则要使用50～200 V/cm的高压电泳，电泳时间可以大大缩短，但必须解决电泳时的冷却问题，并要注意安全。
电泳完毕记下滤纸的有效使用长度，然后烘干，用显色剂显色，显色剂和显色方法，可查阅有关书藉。定量测定的方法有洗脱法和光密度法。洗脱法是将确定的样品区带剪下，用适当的洗脱剂洗脱后进行比色或分光光度测定。光密度法是将染色后的干滤纸用光密度计直接定量测定各样品电泳区带的含量。
醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相似，只是换用了醋酸纤维薄膜作为支持介质。将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为0.1～0.15mm。
醋酸纤维薄膜电泳与纸电泳相比有以下优点：① 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后蛋白质区带更清晰。② 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性比滤纸小，吸水少，电渗作用小，电泳时大部分电流由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，完成全部电泳操作只需90 min左右。③ 灵敏度高，样品用量少。血清蛋白电泳仅需 2(l 血清，点样量甚至少到0. 1(l，仅含5(g的蛋白样品也可以得到清晰的电泳区带。临床医学用于检测微量异常蛋白的改变。④ 应用面广。可用于那些纸电泳不易分离的样品，如胎儿甲种球蛋白、溶菌酶、胰岛素、组蛋白等。⑤ 醋酸纤维薄膜电泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度计和分光光度计扫描定量及长期保存。
由于醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、价廉，目前已广泛用于分析检测血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸及其他生物大分子，为心血管疾病、肝硬化及某些癌症鉴别诊断提供了可靠的依据，因而已成为医学和临床检验的常规技术。
4.6 琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D－半乳糖和3,6脱水L－半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖凝胶的制作是将干的琼脂糖悬浮于缓冲液中，通常使用的浓度是1％－3％，加热煮沸至溶液变为澄清，注入模板后室温下冷却凝聚即成琼脂糖凝胶。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。
琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析。如浓度为1％的琼脂糖凝胶的孔径对于蛋白质来说是比较大的，对蛋白质的阻碍作用较小，这时蛋白质分子大小对电泳迁移率的影响相对较小，所以适用于一些忽略蛋白质大小而只根据蛋白质天然电荷来进行分离的电泳技术，如免疫电泳、平板等电聚焦电泳等。琼脂糖也适合于DNA、RNA分子的分离、分析，由于DNA、RNA分子通常较大，所以在分离过程中会存在一定的摩擦阻碍作用，这时分子的大小会对电泳迁移率产生明显影响。例如对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关，而与碱基排列及组成无关。另外，一些低熔点的琼脂糖（62 ~ 65 (C）可以在65 (C时熔化，因此其中的样品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。
由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。
4.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基：
以R(代表自由基，M代表丙烯酰胺单体，则聚合过程可以表示为：
etc.
这样由于乙烯基“CH2=CH－”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链，同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联，从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用，所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合，催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚合反应。
聚丙烯酰胺的凝胶网络如下图所示：
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是：
上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是：
C = 6.5－0.3T
此式可用于计算T为5％～20％时的凝胶组成。C值并不很严格，在大多数情况下，可变化的范围约为 (1％，当C保持恒定时，凝胶的有效孔径随着T的增加而减小，当T保持恒定，C为4％时，有效孔径最小，C大于或小于4％时，有效孔径均变大，C大于5％时凝胶变脆，不宜使用，实验中最常用的C是2.6％和3％。
配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1个月，在贮存期间丙烯酰胺会水解为丙烯酸而增加电泳时的电内渗现象并减慢电泳的迁移率。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是一种对中枢神经系统有毒的试剂，操作时要避免直接接触皮肤，但它们聚合后则无毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点，因而四十年来得到广泛的应用，目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有：①可以随意控制胶浓度“T”和交联度“C”，从而得到不同的有效孔径，用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中，达到更高的灵敏度：10－9 ～10－12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由－C－C－键结合的酰胺多聚物，侧链只有不活泼的酰胺基－CO－NH2 ，没有带电的其他离子基团，化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料，因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好，便于照相和复印。机械强度好，有弹性，不易碎，便于操作和保存。⑥无紫外吸收，不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的，玻璃管通常直径为7 mm，长10 cm，将凝胶装入到多个管中进行电泳，又称为柱状电泳。目前仍有应用，尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异，所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品，电泳过程中样品所处的条件比较一致，样品间可以进行更好的比较，重复性也更好，所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛，常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
水平平板电泳近年来也有很快的发展，与垂直平板电泳相比也有其独特的优点：①由于凝胶可以直接铺在冷却板上，容易使凝胶冷却，因而可以加高电压以提高分辨率。②电泳速度快，通常只要1小时左右，而园盘电泳和垂直平板电泳一般需要3～4小时。③因为可以使用薄胶，加样少，染色快，从而提高了灵敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可长期保存不会龟裂。④便于适用各种电泳方式，用途广泛，尤其是可以使用90年代才发展起来的只有水平电泳系统才能使用的新的半干技术，即用浸有少量缓冲液的半干的胶条代替通常所用的大量电极缓冲液，大大节约了试剂，简化了操作，提高了电泳速度。
4.8 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。
SDS－PAGE 是在要走电泳的样品中加入含有SDS和(-巯基乙醇的样品处理液，SDS即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一种阴离子表面活性剂即去污剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，强还原剂(-巯基乙醇可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。电泳样品加入样品处理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构。SDS与蛋白质结合后使蛋白质－SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。这样就消除了各种蛋白质本身电荷上的差异。样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。
制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1 cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常为3～5％），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低（通常pH = 6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis高pH碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH = 8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS和HCl配制。
样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl－、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS复合物，在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl－的电泳迁移率最大。在电场的作用下，Cl－最初的迁移速度最快，这样在Cl－后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl－后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍），所以在浓缩胶中Cl－是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。
当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH值（通常pH = 8.8）较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质－SDS复合物。这时蛋白质－SDS复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中（如通常使用的考马斯亮蓝）染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1～1.5小时，电泳在25～30mA下通常需要3小时，染色2～3小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。
Ornstein和Davis设计的高pH碱性不连续系统，有其独特的特点。根据Henderson-Hasselbalch公式：
式中的“α”是缓冲液中各种分子的离解度。由上式可以看出：① 浓缩胶的pH（6.8）小于慢离子甘氨酸的pKa（9.8）3个pH左右，所以 α≈ 0.001，即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1％离解，因此在电场中迁移很慢，是慢离子。② 快离子Cl－由于几乎全部离解，电泳迁移率最大，不受pH变化的影响。③ 分离胶的pH（8.8）小于慢离子的pKa 一个pH左右，α≈ 0.1，所以在分离胶中甘氨酸离解加大，电泳迁移率加大，就赶到蛋白质带的前面。
此外还可以总结出该系统的特点有：④ 电极缓冲液中共轭碱Tris的pKa小于分离胶的pH约１个pH，使其缓冲能力大。⑤电极缓冲液的pH为8.3，相近于Tris的pKa（8.1），以便获得最大的缓冲能力。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离（或迁移率），并对各自分子量的对数（log Mr）作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离（或迁移率），通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
4.9 梯度凝胶电泳
梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如通常顶部凝胶浓度为5％，底部凝胶浓度为25％。凝胶梯度是通过梯度混合器形成的，高浓度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液浓度呈梯度下降，因此在凝胶的顶部孔径较大，而在凝胶的底部孔径较小。梯度凝胶电泳也通常加入SDS，并有浓缩胶。电泳过程与SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳基本类似。与单一浓度的凝胶相比，梯度凝胶有几个优点：①首先，梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以同时分离较大范围分子量的蛋白质。单一凝胶电泳对于分子量超过其分离范围的蛋白质，过大或过小，都不能分离。而梯度凝胶孔径范围比单一凝胶大，分子量较大的蛋白质可以在凝胶顶部大孔径部分得到分离，而分子量较小的蛋白质可以在凝胶底部小孔径部分得到分离，所以分子量较大和较小的蛋白质可以同时得到分离。例如用4％～30％的梯度胶可以分离分子量5万～200万的蛋白质。② 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小，在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。电泳过程中，蛋白质在梯度凝胶中迁移，经过的孔径越来越小，直到凝胶的孔径不能通透，这样电泳过程中蛋白质就被浓缩，集中在一个很窄的区带中。而分子量略小的蛋白质可以迁移得更靠前一些，被集中在略前面的区带中。由于梯度凝胶孔径逐步变小，在蛋白质不能通透的孔径附近对蛋白有浓缩作用，所以电泳后形成很窄的区带，可以分辨出分子量相差较小的蛋白质。对于太稀的样品，在电泳过程中可以将样品分几次加样，大小不同的蛋白质分子最终都会滞留在其相应的凝胶孔径中而得到分离。③ 可以直接测定天然状态蛋白质的分子量而不需要解离为亚基，因此这一方法可以与SDS-PAGE测定分子量的方法互为补充。
梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量，而对纤维蛋白将产生较大的误差。由于分子量的测定必须是在未知和标准蛋白质分子到达完全被阻止迁移的孔径时才能成立，因此电泳时要使用较高的电压，例如平板凝胶为0.5mm厚，使用600V电压， 50mA电流，电泳时间约需2小时。
4.10 等电聚焦
等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。
两性电解质是人工合成的一种复杂的多氨基－多羧基的混合物。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH＝3～10，也有各种较窄的范围如pH＝7～8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。
等电聚焦多采用水平平板电泳，也使用管式电泳。由于两性电解质的价格昂贵，使用1～2 mm厚的凝胶进行等电聚焦价格较高。使用两条很薄的胶带做为玻璃板间隔，可以形成厚度仅0.15 mm的薄层凝胶，大大降低成本，所以等电聚焦通常使用这种薄层凝胶。由于等电聚焦过程需要蛋白质根据其电荷性质在电场中自由迁移，通常使用较低浓度的聚丙烯酰胺凝胶（如4％）以防止分子筛作用，也经常使用琼脂糖，尤其是对于分子量很大的蛋白质。制作等电聚焦薄层凝胶时，首先将两性电解质、核黄素与丙烯酰胺贮液混合，加入到带有间隔胶条的玻璃板上，而后在上面加上另一块玻璃板，形成平板薄层凝胶。经过光照聚合后，将一块玻璃板橇开移去，将一小薄片湿滤纸分别置于凝胶两侧，连接凝胶和电极液（阳极为酸性如磷酸溶液，阴极为碱性如氢氧化钠溶液）。接通电源，两性电解质中不同的等电点的物质通过电泳在凝胶中形成pH梯度，从阳极侧到阴极侧pH值由低到高呈线性梯度分布。而后关闭电源，上样时取一小块滤纸吸附样品后放置在凝胶上，通电30 min后样品通过电泳离开滤纸加入凝胶中，这时可以去掉滤纸。最初样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值，等电点在pH值以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH＝pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH＝pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处，对最后的电泳结果没有影响。所以有时样品可以在制胶前直接加入到凝胶溶液中。使用较高的电压（如2000V，0.5mm平板凝胶）可以得到较快速的分离（0.5～1小时），但应注意对凝胶的冷却以及使用恒定功率的电源。凝胶结束后对蛋白质进行染色时应注意，由于两性电解质也会被染色，使整个凝胶都被染色。所以等电聚焦的凝胶不能直接染色，要首先经过10％的三氯乙酸的浸泡以除去两性电解质后才能进行染色。
等电聚焦还可以用于测定某个未知蛋白质的等电点，将一系列已知等电点的标准蛋白（通常pI在3.5～10之间）及待测蛋白同时进行等电聚焦。测定各个标准蛋白电泳区带到凝胶某一侧边缘的距离对各自的pI值作图，即得到标准曲线。而后测定待测蛋白的距离，通过标准曲线即可求出其等电点。
等电聚焦具有很高的灵敏度，特别适合于研究蛋白质微观不均一性，例如一种蛋白质在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，而在等电聚焦中表现三条带。这可能是由于蛋白质存在单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化形式。由于几个磷酸基团不会对蛋白质的分子量产生明显的影响，因此在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现单一带，但由于它们所带的电荷有差异，所以在等电聚焦中可以被分离检测到。同功酶之间可能只有一两个氨基酸的差别，利用等电聚焦也可以得到较好的分离效果。由于等电聚焦过程中蛋白质通常是处于天然状态的，所以可以通过前面介绍的活性染色的方法对酶进行检测。等电聚焦主要用于分离分析，但也可以用于纯化制备。虽然成本较高，但操作简单、纯化效率很高。除了通常的方法，制备性等电聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或颗粒状凝胶如Sephadex G-75中进行。
4.11 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D―PAGE）
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。通常第一维电泳是等电聚焦，在细管中（φ1～3 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。而后将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。在第二维电泳过程中，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000～2000个蛋白质，有些报道可以分辨出5000～10000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。由于二维电泳具有很高的分辨率，它可以直接从细胞提取液中检测某个蛋白。例如将某个蛋白质的mRNA转入到青蛙的卵母细胞中，通过对转入和未转入细胞的提取液的二维电泳图谱的比较，转入mRNA的细胞提取液的二维电泳图谱中应存在一个特殊的蛋白质斑点，这样就可以直接检测mRNA的翻译结果。二维电泳是一项很需要技术并且很辛苦的工作。目前已有一些计算机控制的系统可以直接记录并比较复杂的二维电泳图谱。
4.12 蛋白质的检测、鉴定及回收
检测蛋白质最常用的染色剂是考马斯亮蓝R－250（CBB，Coomassie brilliant blue），通常是用甲醇：水：冰醋酸（体积比为45：45：10）配制0.1％或0.25％（W/V）的考马斯亮蓝溶液作为染色液。这种酸－甲醇溶液使蛋白质变性，固定在凝胶中，防止蛋白质在染色过程中在凝胶内扩散，通常染色需2小时。脱色液是同样的酸－甲醇混合物，但不含染色剂，脱色通常需过夜摇晃进行。考马斯亮蓝染色具有很高的灵敏度，在聚丙烯酰胺凝胶中可以检测到0.1 (g的蛋白质形成的染色带。考马斯亮蓝与某些纸介质结合非常紧密，所以不能用于染色滤纸、醋酸纤维素薄膜以及蛋白质印迹（在硝化纤维素纸上）。在这种情况下通常是用10％的三氯乙酸浸泡使蛋白质变性，而后使用不对介质有强烈染色的染料如溴酚蓝、氨基黑等对蛋白质进行染色。
银染是比考马斯亮蓝染色更灵敏的一种方法，它是通过银离子（Ag+）在蛋白质上被还原成金属银形成黑色来指示蛋白区带的。银染可以直接进行也可以在考马斯亮蓝染色后进行，这样凝胶主要的蛋白带可以通过考马斯亮蓝染色分辨，而细小的考马斯亮蓝染色检测不到的蛋白带由银染检测。银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍，可以检测低于1 ng的蛋白质。
糖蛋白通常使用过碘酸－Schiff试剂（PAS）染色，但PAS染色不十分灵敏，染色后通常形成较浅的红－粉红带，难以在凝胶中观察。目前更灵敏的方法是将凝胶印迹后（下面介绍）用凝集素检测糖蛋白。凝集素是从植物中提取的一类糖蛋白，它们能识别并选择性的结合特殊的糖，不同的凝集素可以结合不同的糖。将凝胶印迹用凝集素处理，再用连接辣根过氧化物酶的抗凝集素抗体处理，然后再加入过氧化物酶的底物，通过生成有颜色的产物就可以检测到凝集素结合情况。这样凝胶印迹用不同的凝集素检测不仅可以确定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。
通过扫描光密度仪对染色的凝胶进行扫描可以进行定量分析，确定样品中不同蛋白质的相对含量。扫描仪测定凝胶上不同迁移距离的吸光度值，各个染色的蛋白带形成对应的峰，峰面积的大小可以代表蛋白质的含量的多少。另外一种简单的方法是将染色的蛋白带切下来，在一定体积的50％吡啶溶液中摇晃过夜溶解染料，而后通过分光光度计测定吸光度值就可以估算蛋白质的含量。但应注意，蛋白质只有在一定的浓度范围内其含量才与吸光度值成线性关系，另外不同的蛋白质即使在含量相同的情况下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法对蛋白质含量的测定只能是一种半定量的结果。
尽管凝胶电泳通常是作为一种分析工具使用，它也可以用于蛋白质的纯化制备。但电泳后需将蛋白质从凝胶中回收，通常是将所需的蛋白质区带部分的凝胶切下，通过电泳的方法将蛋白质从凝胶中洗脱下来（称为电洗脱）。目前有各种商品电洗脱池装置。最简单的方法是将切下的凝胶装入透析袋内加入缓冲液浸泡，再将透析袋浸入缓冲液中进行电泳，蛋白质就会向某个电极方向迁移而离开凝胶进入透析袋内的缓冲液。由于蛋白质不能通过透析袋，所以电泳后蛋白质就留在透析袋的缓冲液中。电洗脱后可通一个反向电流，持续几秒钟，使吸附在透析袋上的蛋白质进入缓冲液，这样就可以将凝胶中的蛋白质回收。
4.13 蛋白质印迹（Western blotting）
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。
蛋白质印迹法首先是要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到硝酸纤维素膜上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。毛细管印迹法是将凝胶放在缓冲液浸湿的滤纸上，在凝胶上放一片硝酸纤维素膜，再在上面放一层滤纸等吸水物质并用重物压好，缓冲液就会通过毛细作用流过凝胶。缓冲液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素膜上，硝酸纤维素膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。这个过程持续过夜，就可以将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。但这种方法转移的效率较低，通常只能转移凝胶中一小部分蛋白质（10％～20％）。电泳印迹可以更快速有效的进行转移。这种方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。
转移后的硝酸纤维素膜就称为一个印迹（blot），用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如10％的BSA）处理以封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗血清（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗是抗鼠Ig G的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。目前有结合各种标记物的抗特定Ig G的抗体可以直接购买作为标记的二抗。最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。在酶连抗体中使用的酶通常是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。碱性磷酸酶可以将无色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸盐（BCIP）转化为蓝色的产物；而辣根过氧化物酶可以以H2O2为底物，将3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色产物或将4-氯萘酚氧化成蓝色产物。另一种检测辣根过氧化物酶的方法是用增强化学发光法，辣根过氧化物酶在H2O2存在下，氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。除了酶连二抗作为指示剂，也可以使用其它指示剂，主要包括以下一些：
I125标记的二抗：可以通过放射性自显影检测。
荧光素异硫氰酸盐标记的二抗：可以通过在紫外灯下产生荧光来检测。
I125标记金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）：Protein A可以与Ig G的Fc区特异性的结合，因此Protein A可以代替二抗：I125标记的Protein A通过放射性自显影检测。
金标记的二抗：二抗通过微小的金颗粒包裹，与一抗结合时可以表现红色。
生物素结合的二抗：印迹用生物素结合的二抗处理后，再用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标记的凝集素处理。生物素可以与凝集素紧密结合，这种方法实际上相当于通过生物素与凝集素的紧密结合将二抗与酶连接，通过酶的显色反应就可以进行检测。这种方法的优点是由于生物素是一个小分子蛋白，一个抗体上可以结合多个生物素，也就可以结合多个酶连接的凝集素，可以大大增强显色反应的信号。
除了使用抗体或蛋白作为检测特定蛋白的探针以外，有时也使用其它探针如放射性标记的DNA，可以检测印迹中的DNA结合蛋白。
4.14 毛细管电泳
毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛细管电泳(HPCE), 是近年来发展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75内径毛细管柱内用高电压进行分离, 创立了现代毛细管电泳。1984年Terabe等建立了胶束毛细管电动力学色谱。1987年Hjerten 建立了毛细管等电聚焦, Cohen和Karger提出了毛细管凝胶电泳。1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。短短几年内, 由于CE符合了以生物工程为代表的生命科学各领域中对多肽、蛋白质(包括酶，抗体)、核苷酸乃至脱氧核糖核酸(DNA)的分离分析要求, 得到了迅速的发展。CE是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。总之, CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度, 常用紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol,激光诱导荧光检测器则达10-19～10-21mol；高分辨率, 其每米理论塔板数为几十万；高者可达几百万乃至千万, 而HPLC一般为几千到几万；高速度, 最快可在60s内完成, 在250s内分离10种蛋白质, 1.7min分离19种阳离子, 3min内分离30种阴离子； 样品少, 只需nl (10-9 L)级的进样量；成本低, 只需少量(几毫升)流动相和价格低廉的毛细管。由于以上优点以及分离生物大分子的能力, 使CE成为近年来发展最迅速的分离分析方法之一。当然CE还是一种正在发展中的技术, 有些理论研究和实际应用正在进行与开发。
“CE”统指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。（见图16 毛细管电泳仪器示意图）。其仪器结构包括一个高压电源, 一根毛细管, 一个检测器及两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液贮瓶。在电解质溶液中, 带电粒子在电场作用下, 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。CE所用的石英毛细管柱, 在pH>3情况下, 其内表面带负电, 和溶液接触时形成了一双电层。在高电压作用下, 双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动的现象叫电渗, 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)两种速度的矢量和, 正离子的运动方向和电渗流一致, 故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反, 但因电渗流速度一般都大于电泳流速度, 故它将在中性粒子之后流出, 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
图 4－2 毛细管电泳仪器示意图
高压电源 2. 光电倍增管 3. 液冷温控毛细管 4. 光源 5. 数据采集
6. 缓冲液或样品 7. 缓冲液
电渗是CE中推动流体前进的驱动力, 它使整个流体像一个塞子一样以均匀速度向前运动, 使整个流型呈近似扁平型的“塞式流”。（见图17 ）它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。但在HPLC中,采用的压力驱动方式使柱中流体呈抛物线型, 其中心处速度是平均速度的两倍, 导致溶质区带本身扩张, 引起柱效下降, 使其分离效率不如CE。
图 4－3 电渗流流型和压力驱动流型的比较
毛细管中电渗流呈“塞式流”流型
HPLC柱中压力驱动呈抛物线流型
理论分析表明, 增加速度是减少谱带展宽、提高效率的重要途径, 增加电场强度可以提高速度。但高场强导致电流增加, 引起毛细管中电解质产生焦耳热(自热)。自热将使流体在径向产生抛物线型温度分布, 即管轴中心温度要比近壁处温度高。因溶液粘度随温度升高呈指数下降, 温度梯度使介质粘度在径向产生梯度, 从而影响溶质迁移速度, 使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快, 造成谱带展宽, 柱效下降。一般来说温度每提高1℃, 将使淌度增加2% (所谓淌度, 即指溶质在单位时间间隔内和单位电场上移动的距离)。此外, 温度改变使溶液pH值、粘度等发生变化, 进一步导致电渗流、溶质分子的电荷分布(包括蛋白质的结构)、离子强度等的改变, 造成淌度改变、重复性变差、柱效下降等现象。降低缓冲液浓度可降低电流强度, 使温差变化减小。高离子强度缓冲液可阻止蛋白质吸附于管壁, 并可产生柱上浓度聚焦效应, 防止峰扩张, 改善峰形。减小管径在一定程度上缓解了由高电场引起的热量积聚, 但细管径使进样量减少, 造成进样、检测等技术上的困难。因此, 加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。液体的导热系数要比空气高100倍。现在有的采用液体冷却方式的毛细管电泳仪可使用离子强度高达0.5mol/L的缓冲液进行分离, 或使用200直径的毛细管进行微量制备, 仍能达到良好的分离效果和重现性。
ＣＥ现有六种分离模式，分述如下：
１. 毛细管区带电泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又称毛细管自由电泳, 是CE中最基本、应用最普遍的一种模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。
2. 胶束电动毛细管色谱 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC), 是把一些离子型表面活性剂 (如十二烷基硫酸钠, SDS) 加到缓冲液中, 当其浓度超过临界浓度后就形成有一疏水内核、外部带负电的胶束。虽然胶束带负电, 但一般情况下电渗流的速度仍大于胶束的迁移速度, 故胶束将以较低速度向阴极移动。溶质在水相和胶束相(准固定相)之间产生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差异, 疏水性强的胶束结合牢, 流出时间长, 最终按中性粒子疏水性不同得以分离。MECC使CE能用于中性物质的分离, 拓宽了CE的应用范围, 是对CE极大的贡献。
3. 毛细管凝胶电泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 是将板上的凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子筛的作用, 溶质按分子大小逐一分离。凝胶粘度大, 能减少溶质的扩散, 所得峰形尖锐, 能达到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛细管内交联制成凝胶柱, 可分离、测定蛋白质和DNA的分子量或碱基数, 但其制备麻烦, 使用寿命短。如采用粘度低的线性聚合物如甲基纤维素代替聚丙烯酰胺, 可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分(Non-Gel Sieving)介质。它能避免空泡形成, 比凝胶柱制备简单,寿命长, 但分离能力比凝胶柱略差。CGE和无胶筛分正在发展成第二代DNA序列测定仪, 将在人类基因组织计划中起重要作用。
4. 毛细管等电聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 将普通等电聚焦电泳转移到毛细管内进行。通过管壁涂层使电渗流减到最小, 以防蛋白质吸附及破坏稳定的聚焦区带, 再将样品与两性电解质混合进样, 两端贮瓶分别为酸和碱。加高压(6～8kV)3～5min后, 毛细管内部建立pH梯度,蛋白质在毛细管中向各自等电点聚焦, 形成明显的区带。最后改变检测器末端贮瓶内的pH值, 使聚焦的蛋白质依次通过检测器而得以确认。
5. 毛细管等速电泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是一种较早的模式, 采用先导电解质和后继电解质, 使溶质按其电泳淌度不同得以分离, 常用于分离离子型物质, 目前应用不多。
6. 毛细管电色谱 (capillary electrochromatography, CEC) 是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中, 以样品与固定相之间的相互作用为分离机制, 以电渗流为流动相驱动力的色谱过程, 虽柱效有所下降, 但增加了选择性。此法有发展前景。
毛细管电泳 (CE) 除了比其它色谱分离分析方法具有效率更高、速度更快、样品和试剂耗量更少、应用面同样广泛等优点外, 其仪器结构也比高效液相色谱 (HPLC) 简单。CE只需高压直流电源、进样装置、毛细管和检测器。前三个部件均易实现, 困难之处在于检测器。特别是光学类检测器, 由于毛细管电泳溶质区带的超小体积的特性导致光程太短, 而且圆柱形毛细管作为光学表面也不够理想, 因此对检测器灵敏度要求相当高。当然在CE中也有利于检测的因素, 如：在HPLC中, 因稀释之故,溶质到达检测器的浓度一般是其进样端原始浓度的1%, 但在CE中, 经优化实验条件后, 可使溶质区带到达检测器时的浓度和在进样端开始分离前的浓度相同。而且CE中还可采用堆积等技术使样品达到柱上浓缩效果, 使初始进样体积浓缩为原体积的1/10～1%, 这对检测十分有利。因此从检测灵敏度的角度来说, HPLC具有良好的浓度灵敏度, 而CE提供了很好的质量灵敏度。总之, 检测仍是CE中的关键问题,有关研究报道很多, 发展也很快。迄今为止, 除了原子吸收光谱、电感耦合等离子体发射光谱(ICP)及红外光谱未用于CE外, 其它检测手段如：紫外、荧光、电化学、质谱、激光等类型检测器均已用于CE。
与HPLC类似, CE中应用最广泛的是紫外/可见检测器。按检测方式可分为固定波长或可变波长检测器和二极管阵列或波长扫描检测器两类。前一类检测器采用滤光片或光栅来选取所需检测波长, 优点在于结构简单, 灵敏度比后一类检测器高；后一类检测器能提供时间--波长--吸光度的三维图谱, 优点在于在线紫外光谱可用来定性、鉴别未知物。有些商用仪器的二极管阵列检测器还可做到在线峰纯度检查, 即在分离过程中便可得知每个峰含有几种物质；缺点在于灵敏度比前一类略差。采用快速扫描的光栅获取三维图谱方式时, 其扫描速度受到机械动作速度的限制。用二极管阵列方式, 扫描速度受到计算机数据存贮容量大小的限制。由于CE的峰宽较窄, 理论上要求能对最窄的峰采集20个左右的数据, 因此要很好地选取扫描频率, 才能得到理想的结果。
| 课件名称： | 生物化学实验讲义（考研资料） |
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