生物化学实验讲义（考研资料）：高效液相色谱技术（HPLC）

7 高效液相色谱技术（HPLC） 高效液相色谱（HPLC：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大的份额，增长速度最快。 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理 加样 流动相 固定相 流动相 A A B C B C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为： 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是 2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。③化学稳定性好。 硅胶 ( SiO2?n H2O) ： OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1 R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2 R2 硅胶 有机硅烷 键合相 X ━ Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━ 烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1 、R2 ━ X、CH3等。 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。 按键合到基质上的官能团可分为： ⑴反相柱：填料是非极性的，官能团为烷烃，例如：C18(ODS)、C8、C4等。 ⑵正相柱：填料是极性的，官能团为 －CN氰基、－NH2氨基等。 ⑶离子交换键合相： 阳离子官能团：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。 阴离子官能团：―R4N＋季铵基、-氨基等。 ( 由于硅胶基质的键合相只能在pH＝2～7.5的范围内使用，而离子交换色谱要求有更宽的pH范围，因此其基质现在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。) 流动相： 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，所以在分离肽类和蛋白质等生物大分子的过程中，经常要加入修饰性的离子对物质，最常用的离子对试剂是三氟乙酸（TFA），使用浓度为0.1％，使流动相的pH值为2～3，这样可以有效地抑制氨基酸上α羧基的离介，使其疏水性增加，延长洗脱时间，提高分辨率和分离效果。 完全离子化的溶质，例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A＋）相反的离子（B－），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80％的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。 流动相的选择原则是：①样品易溶，且溶解度尽可能大。②化学性质稳定，不损坏柱子。③不妨碍检测器检测，紫外波长处无吸收。④粘度低，流动性好。⑤易于从其中回收样品。⑥无毒或低毒，易于操作。⑦易于制成高纯度，即色谱纯。⑧废液易处理，不污染环境。 7.2 基本参数 保留值 进样 t0 tR ⑴保留时间“tR”：进样至出峰的时间。 ⑵死时间“t0”：不被柱子吸附的惰性物质的出峰时间。死时间“t0”的测定通常是使用不被柱子保留而又有紫外吸收的惰性物质，例如：正相色谱常用四氯化碳，反相色谱常用甲醇、尿嘧啶、NaNO2、NaNO3等。 ⑶容量因子“k’”：
或：
“k’”是比“tR”还常用的保留值，它与柱子的大小及流速无关，只与溶质在固定相和流动相的分配性质、柱温以及相空间比（即固定相和流动相之体企积比）有关。“k’”又定义为在分配平衡时某溶质在两相中绝对量之比，消除了保留值的波动因素，而平衡常数“K”是平衡时物质在两相中的浓度比。 k’值的范围： 0.4＜k’＜20～30 k’＝2～5为佳，过大则耗时太长。 ⑷保留体积：VR＝tR?FC ( FC --- 流动相的流速 mL/min ) VR是在tR时间内流动相流过柱子的体积。 调整保留时间：tR’＝ tR－t0 调整保留体积：VR’＝ VR－VR0＝tR’ ?FC ⑸选择性指标“α’”和相对保留值“α” α’可以更直观和方便地反映色谱峰分离的好坏：
进样 tR(1) tR(2) 相对保留值(分离因子)：
( α＞1.1为好 ) 柱效率： 定义： 理论塔板数

( 每米柱 ) 1/2 h 2

标准偏差，曲线拐点处峰宽的一半 W1/2 即峰高0.607处峰宽的一半 1/2 h 为便于测量，改用半峰宽： Wb W1/2( 或2×△t1/2 ) 最常用的计算式：
另一计算式：
Wb不如W1/2容易测量，因而此式用的较少。 理论塔板高度：
L 柱长 经验式： H＝2dP ( dP＝10μ H＝20μ N＝5万 ) ( dP＝5μ H＝10μ N＝10万 ) dP 柱填料的颗粒直径 柱效的测定和计算： 以反相柱为例，流动相用87％(V/V)的甲醇:水，样品用苯、联苯、萘等，加快记录仪的走纸速度，测出半峰宽W1/2，并由走纸速度换算为与tR相同的单位“分”或“秒”，代入公式，计算出柱效N。 提高柱效的方法：①固定相填料要均一，颗粒细，装填均匀。②流动相粘度低。③低流速。④升高柱温。 不对称因子“Tf”： 用于形容色谱峰拖尾和前伸的程度，多数为拖尾峰。 h 进样 进样 A B 1/10h 拖尾 前伸
A、B如上图所示 通常 Tf＝1.2～1.3 ，若 Tf＞2 则峰不合格。 峰拖尾的原因是硅胶基质上的Si－OH羟基未被全部键合而与溶质发生反应。 改进拖尾要用封尾技术：即用小分子的含甲基的物质再次对硅胶进行键合，封闭硅羟基；还可在流动相中加入带 –NH2氨基(对羟基敏感)的物质，将残余的羟基掩闭。 分辨率： tR(1) tR(2)
进样 W1/2(1) W1/2(2) tW1 tW2 4. 分离度 K1和 K3 HPLC的目的和要求是：峰要尽可能窄（W1/2小），峰的间距尽可能大（tR相差大）。 ⑴基线分离度 K1 ：
基线分离时用K1。 H ⑵峰高分离度： h
K3＝1 基线分离，K3 更反映了实际分离心度。 线速度：溶剂在柱中移动的速度。
mm/sec L─柱长 t0 ─死时间 H(μm) 粗粒 如右图所示，用实验可找到最佳的线速度： 即图中的A点：u＝1 mm/sec 此处不用流量而用线速度，是因为流量与 柱径有关，而线速度与柱径无关。 请记住不同柱内径的最佳流量： A u(1mm/sec) 柱内径 流量 线速度 5 mm 1.0 mL/min 1 mm/sec 2 mm 0.2 mL/min 1 mm/sec 1 mm 50 μL/min 1 mm/sec 由1 mm/sec 最佳线速度可计算出适合各种柱径的最佳流量。 由上表可以看出，用5mm柱，一天要用一并昂贵的乙腈，若用1mm柱，则一个月才用一并。 保留值方程： 正相色谱： lnk’＝a＋blnCb＋cCb Cb─强冲洗剂浓度 反相色谱： lnk’＝a＋cCb 对于不同溶质 a、b、c 系数不同 离子交换色谱： lnk’＝a＋blnCb 反相色谱是线性方程 正相色谱： 反相色谱： lnk’ lnk’ Cb Cb lnk’ lnk’ 萘 四氢呋喃/水 D 甲醇/水 苯 Cb D Cb (甲醇/水) D点：同样的容量因子，四氢呋喃 D点：萘非极性强，k’大，斜率陡 用量少 lnk’ 甲 lnk’ 乙 C A B Cb A A D A Cb A点甲、乙二溶质分不开，B点比 A点分不开，要寻找不是交叉点的 C点冲洗剂浓度高，但k’小，省时 D点的Cb浓度为分离条件 间，所以选B点好。 所以，改变Cb浓度，保留值k’和选择性α都改变了，寻找最佳的Cb浓度就是HPLC 高效液相色谱技术的精髓所在。 例如，通常用10％～90％的甲醇/水，梯度洗脱30min，即可找出适宜的Cb浓度。 用高浓度Cb洗脱，可保证先将所有的峰都洗脱出来，不丢失组份，然后再调节Cb浓度，找到更好的分离效果，加大各组份色谱峰的分离度。 甲醇降低10％，k’可降低2～3倍。 7. 反相色谱的一般规律： 样品 是 离子交换、离子对色谱 是否离子型 或从文献中挑选 是 反相色谱( C18或短链 ) 是否可离解 70％甲醇/水，pH 6.0 否 改变pH或改变甲醇/水 百分比 不知道 是 反相色谱( C18或短链 ) 极性是否很强 30％～40％ 甲醇/水 是 反相色谱( C18 ) 是否中等极性 50％～70％ 甲醇/水 是 反相色谱( C18 ) 非极性 70％～90％ 甲醇/水 反相色谱( C18 ) 梯度30％～100％ 甲醇/水 或由100％ 甲醇开始分步洗脱 7.3 HPLC系统构成 脱气 泵 进样伐 柱 检测器 收集器 流动相贮液并 自动进样器 控制系统 数据处理系统 7.3.1 HPLC系统使用记录 仪器使用记录： 各组件的牌号、型号、编号、购进日期、安装日期、保单。 标准参考条件的标准色谱图（流动相、流速、压力、温度、检测器参数、样品量等）： 反相色谱： 流动相：甲醇/水（70:30 V/V） 柱：C18 流速：1.0 mL/min 检测器：UV 254nm 样品：尿嘧啶（测t0）、苯酚、苯乙酮、硝基苯、苯甲醚、甲苯。 ⑶ 使用记录：日期、工作内容、开机时间、样品数、仪器状态、操作者。 ⑷ 维修记录：日期、原因、修理人、结果。（可备专用维修记录本）。 ⑸ 换柱：牌号、种类、尺寸、标准色谱图。 ⑹ 换部件：日期、原因、型号、编号、标准色谱图、操作人。 个人实验记录 ⑴ 日期、天气、室温。 ⑵ 实验目的。 ⑶ 色谱系统：厂名、型号等。 ⑷ 操作条件：流动相（配比、pH、过滤脱气情况）。 ⑸ 样品：予处理方法、进样体积。 ⑹ 分析结果：数据、资料、色谱图。 ⑺ 现象记录。 ⑻ 参考文献。 色谱柱记录 ⑴ 原始记录：启用日期、填料种类、牌号、编号、标准色谱图（流动相、流速、压力、N、t0、tR、RS、Tf）。 ⑵ 使用记录：仪器、样品、操作人。 ⑶ 贮存记录：润湿溶剂、加盖否。 ⑷ 维修记录：日期、原因、措施（补柱头、反冲、换板）。 ⑸ 柱寿命：N、色谱图、操作人。 7.3.2 贮液器和流动相脱气 1.贮液器：常用干净的无水甲醇试剂并作贮液器，并要加盖以防灰尘落入，但并盖与导管之间应有缝隙，若过紧会形成真空。贮液并内要放置烧结不锈钢过滤器，即沉子，孔径为10μm，其作用是：①防止灰尘进入泵缸。② 作为进液导管的重物，使导管能沉在并底。 2.脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需要脱气。 ⑴ He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵。 ⑵ 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 ⑶ 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％。 ⑷ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用。 注意： ⑴ 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。 ⑵ 贮液并要不定期更换，要有2～3个备用并，定期用酸、水、溶剂清洗。 ⑶ 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。 ⑷ 使用混合流动相时：易产生气体，可在系统外予混合后脱气。 ⑸ 流动相不畅的原因：管路阻塞、长了霉菌、管道空化、贮液并盖子太紧。解决的办法有：抬高贮液并或向并内加压；去掉沉子；用稀硝酸洗去管道内微生物（洗前必须洗净醇类）。 7.3.3 色谱柱 填料： 国产：天津试剂工厂：YWG─C18H37 进口：Zorbax─ODS 常用柱尺寸：长25cm，内径4.6mm 注意事项： 1. 加流路过滤器与保护柱（予柱）：通常用3cm短柱，内径2mm。 2. 避免高压冲击：进样伐快转；泵起动时要由小流量开始。 3. 分离条件的选择： pH：硅胶基质：pH 2.5～7.0，聚合物填料：pH 1～13 。极端pH的流动相能溶解硅胶。 温度：高温下用小颗粒填料柱会引起塌陷，柱效N下降一半：3μm柱，＞40℃；5μm柱，＞70℃。 4. 柱的保存：通常灌注纯有机溶剂保存。若用水（如凝胶柱），则加10％叠氮化钠。 净化样品：①不含微粒；②防止蛋白质沉淀在柱头；③防止组分在固定相上保留 过强。 措施：先过滤样品；先做予试验（样品加入流动相中变浑否？）；用予柱除去强保留组分。若用6M NaOH 溶解的样品进样50～10μL，硅胶柱就报废。 6. 定期洗柱：甲醇、乙腈洗掉柱中强保留组分，正向或反向洗，不要流过检测器，若无效：则换不锈钢过滤片，并用同种填料加乙醇调成糊状，补平柱头，或挖去2～3mm脏填料，重新填平（填料也可以不同种）。 7. 延长柱寿命：修补柱头；换不锈钢过滤片；冲洗柱；倒向用（柱效要下降 40～60％）。 7.3.4 泵─往复式恒流柱塞泵 三大问题： 1. 单向伐故障：红宝石球与伐座密封不严。 原因：⑴ 污染：气泡、微粒。 解决方法：用25mL 水、甲醇、异丙醇、二氯甲烷 依次冲洗。在稀硝酸中超声15min ，用HPLC水洗2～3次、甲醇洗2次。 ⑵ 磨损：对调红宝石球，使面密封变为线密封。 2. 密封圈故障：渗漏、垫圈碎片污染系统。表现：压力不稳、泵头漏液。通常三个月或不定期换密封圈。拆泵头：兰宝石杆要缩至最短。 3. 气泡：用脱气后甲醇冲洗。 予防措施： 1. 用高质量溶剂和水作流动相。 2. 流动相脱气。 3.每天结束时：先用水洗，再用甲醇洗。若用过缓冲液：必须先水洗30～60min （1ml/ min），再甲醇洗30min，千万不可先用甲醇冲洗，否则无机盐沉淀堵了管路。 4. 及时换密封圈，加油。 5. 用10mL水、10mL甲醇洗泵头排水孔。 6. 防止柱塞杆磨损。换新圈仍漏，则是柱塞杆被盐划伤。 7.3.5 进样器 分手动、自动两种，通常实验室用的是手动。 六通进样伐：惰性聚合物转子与陶瓷定子之间构成密封面。 内装式：针头插到伐体内的转子部位，平头，有直径0.5mm和0.7mm两种。完全装液法与部分装液法均可使用。 外装式：进样孔与伐有距离，部分样品留在进样管道，不被注入样品环管，因而最好使用完全装液法 注意： 1. 内装式平针头决不可过长，不可超出转子面，否则将损坏进样伐。进样后可不拔出针头，进样量不限。外装式进样量要过量，进柱样品量精确度比内装式高。 2. 转手柄要快：＜1秒，不允许仃在中间！ 3. 用后要立即清洗： 使用了强腐蚀性溶剂：用水和有机溶剂清洗。 使用了含盐缓冲液：用后立即用水洗净进样孔和导管，否则会损坏密封面。 4. 针头不可过细，否则针头密封圈失效而渗漏。 7.3.6 检测器 检测器的作用是将浓度的变化变成电信号。 紫外检测器： 195～350nm 的可变波长检测器通常使用氘灯。1024个二极管的二极管阵列检测器可作吸光度、时间和波长的三维检测，画出三维立体山峰形状的图形。 石英流动池为“Z”形，约8μl，光池为1mm×10mm。 注意问题： ⑴ 氘灯寿命只有 400～1000小时，要注意节灯。 ⑵ 气泡：谱图上出现许多毛刺峰，是光池内有气泡，可用脱气后的甲醇或异丙醇冲洗。 ⑶ 污染与堵塞：反向冲洗顺序为：50ml无水乙醇→50ml水→250ml 3M硫酸→100ml水。为防止酸喷出，可用反向负压回抽法（用注射器）。 ⑷ 正确选择检测波长：通常用该样品紫外扫描吸收光谱的波峰波长。 荧光检测器：将溶质样品衍生为荧光物质，检测灵敏度比紫外高10～1000倍。 示差折光检测器：灵敏度较低，用于糖类样品的检测。