5 离心技术 离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，已得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要装备多种型式的离心机。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备，生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。 5.1 基本原理 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即： F = m·a = m·ω2 r a — 粒子旋转的加速度， m — 沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度， r—粒子的旋转半径( cm )。 通常离心力常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力 “ RCF ”。或者用数字乘“g”来表示，例如25000×g，则表示相对离心力为25000。相对离心力是指在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度“g” （980cm/sec2），此时“RCF”相对离心力可用下式计算：   ∴ RCF = 1.119×10－5×(rpm)2 r ( rpm — revolutions per minute每分钟转数，r/min ) 由上式可见，只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。但是由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算是规定旋转半径均用平均半径“ra v”代替： ra v=( r min＋rmax) / 2 r的测量如下图所示： 34o rmin 旋转轴 rav rmax 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高速离心时则以“g” 表示。计算颗粒的相对离心力时，应注意离心管与旋转轴中心的距离“r”不同，即沉降颗粒在离心管中所处位置不同，则所受离心力也不同。因此在报告超离心条件时，通常总是用地心引力的倍数“×g”代替每分钟转数“rpm”，因为它可以真实地反映颗粒在离心管内不同位置的离心力及其动态变化。科技文献中离心力的数据通常是指其平均值（RCFa v），即离心管中点的离心力。 为便于进行转速和相对离心力之间的换算，Dole 和Cotzias 利用RCF的计算公式，制作了转速“rpm”、相对离心力“RCF”和旋转半径“r”三者关系的列线图，图式法比公式计算法方便（列线图参见附录）。换算时，先在r标尺上取已知的半径和在rpm标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，与图中RCF标尺上的交叉点即为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于rpm标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值，转数值处于rpm标尺左边，则应读取RCF标尺左边的数值。 5.2 离心机的主要构造和类型 离心机可分为工业用离心机和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性离心机和分析性离心机，制备性离心机主要用于分离各种生物材料，每次分离的样品容量比较大，分析性离心机一般都带有光学系统，主要用于研究纯的生物大分子和颗粒的理化性质，依据待测物质在离心场中的行为（用离心机中的光学系统连续监测），能推断物质的纯度、形状和分子量等。分析性离心机都是超速离心机。 1. 制备性离心机可分为三类： ⑴ 普通离心机：最大转速6000 rpm左右，最大相对离心力近6000×g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系统，于室温下操作，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。这种离心机多用交流整流子电动机驱动，电机的碳刷易磨损，转速是用电压调压器调节，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此精确地平衡离心管及内容物就极为重要，否则会损坏离心机。 ⑵ 高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min），最大相对离心力为89000×g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、荡平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，以消除高速旋转转头与空气之间摩擦而产生的热量，离心室的温度可以调节和维持在0～40C，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示，通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。 ⑶ 超速离心机：转速可达50000～80000 rpm，相对离心力最大可达510000×g，最著名的生产厂商有美国的贝克曼公司和日本的日立公司等，离心容量由几十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。超速离心机的出现，使生物科学的研究领域有了新的扩展，它能使过去仅仅在电子显微镜观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。 超速离心机主要由驱动和速度控制、温度控制、真空系统和转头四部分组成。超速离心机的驱动装置是由水冷或风冷电动机通过精密齿轮箱或皮带变速，或直接用变频感应电机驱动，并由微机进行控制，由于驱动轴的直径较细，因而在旋转时此细轴可有一定的弹性弯曲，以适应转头轻度的不平衡，而不致于引起震动或转轴损伤，除速度控制系统外，还有一个过速保护系统，以防止转速超过转头最大规定转速而引起转头的撕裂或爆炸，为此，离心腔用能承受此种爆炸的装甲钢板密闭。 温度控制是由安装在转头下面的红外线射量感受器直接并连续监测离心腔的温度，以保证更准确更灵敏的温度调控，这种红外线温控比高速离心机的热电偶控制装置更敏感，更准确。 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。离心机的速度在2000 rpm以下时，空气与旋转转头之间的磨擦只产生少量的热，速度超过20000 rpm时，由磨擦产生的热量显著增大，当速度在40000 rpm以上时，由磨擦产生的热量就成为严重问题，为此，将离心腔密封，并由机械泵和扩散泵串联工作的真空泵系统抽成真空，温度的变化容易控制，磨擦力很小，这样才能达到所需的超高转速。 2. 转头： ⑴ 角式转头：角式转头是指离心管腔与转轴成一定倾角的转头。它是由一块完整的金属制成的，其上有4～12个装离心管用的机制孔穴，即离心管腔，孔穴的中心轴与旋转轴之间的角度在20～40度之间，角度越大沉降越结实，分离效果越好。这种转头的优点是具有较大的容量，且重心低，运转平衡，寿命较长，颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一侧就会出现颗粒沉积，此现象称为“壁效应”，壁效应容易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱，影响分离效果。 ⑵ 荡平式转头：这种转头是由吊着的4或6个自由活动的吊桶（离心套管）构成。当转头静止时，吊桶垂直悬挂，当转头转速达到每分钟200到800转时，吊桶荡至水平位置，这种转头最适合做密度梯度区带离心，其优点是梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，而不像角式转头中样品沉淀物的界面与离心管成一定角度，因而有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。其缺点是颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。 ⑶ 区带转头：区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成，转子桶中装有十字型隔板装置，把桶内分隔成四个或多个扇形小室，隔板内有导管，梯度液或样品液从转头中央的进液管泵入，通过这些导管分布到转子四周，转头内的隔板可保持样品带和梯度介质的稳定。沉降的样品颗粒在区带转头中的沉降情况不同于角式和外摆式转头，在径向的散射离心力作用下，颗粒的沉降距离不变，因此区带转头的“壁效应”极小，可以避免区带和沉降颗粒的紊乱，分离效果好，而且还有转速高，容量大，回收梯度容易和不影响分辨率的优点，使超离心用于制备和工业生产成为可能。区带转头的缺点是样品和介质直接接触转头，耐腐蚀要求高，操作复杂。 ⑷ 垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心，离心结束后液面和样品区带要作九十度转向，因而降速要慢。 ⑸ 连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。 3. 离心管： 离心管主要用塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用： ①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。②防止样 品挥发。③支持离心管，防止离心管变形。 4. 分析性离心机： 分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监视物质在一个离心场中的沉降过程。从而确定其物理性质。 分析性超速离心机的转头是椭圆形的，以避免应力集中于孔处。此转头通过一个有柔性的轴联接到一个高速的驱动装置上，转头在一个冷冻的和真空的腔中旋转，转头上有2～6个装离心杯的小室，离心杯是扇形石英的，可以上下透光，离心机中装有一个光学系统，在整个离心期间都能通过紫外吸收或折射率的变化监测离心杯中沉降着的物质，在预定的期间可以拍摄沉降物质的照片，在分析离心杯中物质沉降情况时，在重颗粒和轻颗粒之间形成的界面就像一个折射的透镜，结果在检测系统的照像底板上产生了一个“峰”，由于沉降不断进行，界面向前推进，因此峰也移动，从峰移动的速度可以计算出样品颗粒的沉降速度。 分析性超速离心机和主要特点就是能在短时间内，用少量样品就可以得到一些重要信息，能够确定生物大分子是否存在，其大致的含量，计算生物大分子的沉降系数，结合界面扩散，估计分子的大小，检测分子的不均一性及混合物中各组份的比例，测定生物大分子的分子量，还可以检测生物大分子的构象变化等。 5.3 制备性超速离心的分离方法： 1. 差速沉降离心法： 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活。 2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）： 区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。 密度梯度区带离心法又可分为两种： （1）差速区带离心法：当不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。 离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 （2）等密度区带离心法：离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。 离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带，这就是等密度离心法。体系到达平衡状态后，再延长离心时间和提高转速已无意义，处于等密度点上的样品颗粒的区带形状和位置均不再受离心时间所影响，提高转速可以缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 等密度离心法的分离效率取决于样品颗粒的浮力密度差，密度差越大，分离效果越好，与颗粒大小和形状无关，但大小和形状决定着达到平衡的速度、时间和区带宽度。 等密度区带离心法所用的梯度介质通常为氯化绝CSCl，其密度可达1.7 g/cm3。此法可分离核酸、亚细胞器等，也可以分离复合蛋白质，但简单蛋白质不适用。 收集区带的方法有许多种，例如： 用注射器和滴管由离心管上部吸出。 有针刺穿离心管底部滴出。 用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带抽出。 （4）用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自动部分收集器收集。 5.4 离心操作的注意事项： 高速与超速离心机是生化实验教学和生化科研的重要精密设备，因其转速高，产生的离心力大，使用不当或缺乏定期的检修和保养，都可能发生严重事故，因此使用离心机时都必须严格遵守操作规程。 1. 使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和其内容物，平衡时重量之差不得超过各个离心机说明书上所规定的范围，每个离心机不同的转头有各自的允许差值，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 2. 装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀，而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。每次使用后，必须仔细检查转头，及时清洗、擦干，转头是离心机中须重点保护的部件，搬动时要小心，不能碰撞，避免造成伤痕，转头长时间不用时，要涂上一层上光腊保护，严禁使用显著变形、损伤或老化的离心管。 3. 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 4. 离心过程中不得随意离开，应随时观察离心机上的仪表是否正常工作，如有异常的声音应立即停机检查，及时排除故障。 5. 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。每一转头都要有一份使用档案，记录累积的使用时间，若超过了该转头的最高使用限时，则须按规定降速使用。 6 分光光度技术 6.1 基本原理 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。因此本章重点讨论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。 1. 光谱： 光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。 λ＝C/ν λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。 光又可以看作是由具有能量的粒子所组成。这些粒子所具有的原能量“E”由下式算出： E＝h·ν H——普朗克常数（ 6.624×10-27尔格·秒） ν——频率 紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即 200nm～400nm。可见光区为400nm～800nm。 组成物质的分子均处于一定能态并不停地运动着，分子的运动可分为平动、转动、振动和分子内电子的运动，每种运动状态都处于一定的能级，因此分子的能量可以写成： E＝E0+E平+E转+E振+E电 E0是分子内在的不随分子运动而改变的能量，平动能E平只是温度的函数，因此与光谱有关的能量变化是分子的转动能量、振动能量和分子的电子能量。 分子的每一种能量都有一系列的能级，能级不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子处于基态，当它吸收一定能量跃迁到激发态，则产生吸收光谱。分子转动、振动和电子能级的跃迁，相应地产生转动、振动及电子光谱。 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系： E＝E2- E1＝h E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。 与吸收光谱有关的三种电子是： ⑴ 二个原子的电子沿其对称方向相互形成的共价键（即单键），称σ 键， 构成 键的电子称 σ电子，如C－C、C－H键。 ⑵ 平行于二个原子轨道形成的价键（即双键），称π 键，形成π键的电子称为 π电子，如C=C键。 ⑶ 未共享成键的电子，称n电子。 各种电子跃迁所需能量大小的顺序是： n→π*＜π→π*≤ n→σ*＜π→σ*＜σ→π*＜σ→σ* 紫外吸收光谱主要是由于双键电子，尤其是共轭双键中的π电子和未共享的电子对的激发所产生的。所以各种物质分子对紫外光的吸光性质取决于该分子的双键数目和未共享电子对的共轭情况等。 如下表所示： 电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系表 电子跃迁类型  例 子 紫外吸收波长范围  σ→σ*  C－H  100～150 nm   π→π*( 非共轭 )  C＝O  ＜200 nm   π→π*( 共轭 )  ＝C－C＝  200～300 nm   n→π*  C＝O  ～300 nm   π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小，吸收波长在紫外区的200～300 nm，不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸均含有大量共轭双键，因而200～300 nm的紫外吸收测定，在生化实验技术中有极广泛的用途。 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。 吸光度 A D C B λmax λmin 波长(nm) 由上图可以看出吸收光谱的特征： ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。 ⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。 λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。 由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱，要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个或几个宽的吸收谱带所组成。 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。 增色效应（hyperchromic effect）: 核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。 减色效应（hypochromic effect）: 在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。 2. 光吸收定律： 朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律： A＝－lgT＝εb c A——吸光度，又称光密度“O.D”。 T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收池上的光强，I——为透过吸收池的光强。 ε——摩尔吸光系数或克分子吸光系数（L·mol－1·cm－1）。 b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地，b=1cm。 C——样品浓度（mol/L）。 由上式可以看出：吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。 摩尔吸光系数：  ， 是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常 ε＝10～105：一般认为ε＞ 104为强吸收；ε＝103～104 为较强吸收；ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。 因为通常使用分光光度计可检测出的最小吸光度A＝0.001, 所以，当b＝1cm, ε＝105时，可检测的溶液最小浓度是C＝10-8 mol/L。 常用的吸光系数还有一种百分吸光系数，即在某一波长下，溶液浓度为1%（W / V），液层厚度b＝1cm时的吸光度，以E1%λmax表示。  C——百分浓度（W / V）。 L——液层厚度，吸收杯光径长度。 A——吸光度。 最大吸收波长λmax时的ε 和E1%λmax值可用下式换算： ε＝E1%λmax×分子量 / 10 吸光度“A”有一个重要性质是其具有加和性： A＝ε1C1b1＋ε2C2b2＋ε3C3b3＋……＝ 即混合物的总吸光度等于溶液中的各组份各自在该波长下吸光度的算术和。这是多元混合物分光光度法定量分析的基础。 若溶液中各溶质的吸光系数ε相同，则各溶质吸光度的大小与溶质浓度成比例。例如，离子交换柱层析分离核苷酸实验中可利用吸光度计算回收率： m＝C·V ， ∵  ， ∴  m——溶质的量 C——溶质浓度 V——溶液体积 A——吸光度 ε——吸光系数 b——吸收池光径 ∴ 回收率（100%） （上式中假设ε总和各核苷酸的ε近似相等） 例一：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系数 = 8.2×103 M－1cm－1（M＝mol / L）。 ∵ A＝ εbC ∵ A＝（溶剂加样品的吸光度）－（溶剂的吸光度） ∴ A＝0.650－0.070＝0.580 ∵ b＝1cm ∴ C==7.1×10－5 mol / L 例二：1%（W/V，10 mg / ml）酪氨酸酶溶液的吸光度为24.9（1cm吸收池，280nm），计算A280=0.250的酪氨酸酶溶液的浓度。 由于这两种酶溶液的百分吸光系数“E1%1cm，280nm”是相同的，因此可用正比例法计算浓度。 ∵  ∴  ∴ C未知＝0.01％＝0.1mg / ml 6.2 分光光度计的组成和构造： 1. 组成：各种型号的紫外/可见分光度计，不论是何种型式，基本上都由五部分组成：（1）光源；（2）单色器（包括产生平行光和把光引向检测器的光学系统）；（3）样品室；（4）接收检测放大系统；（5）显示或记录器。 光 源 单色器 样品室 检测放大系统 显示器 国产分光光度计近年来已有很大的发展，各种档次的分光光度计都已更新升级换代，可见光系列有：721、722、723等型号，紫外/可见光系列有：751、752、753、754、756等型号，主要生产厂为上海分析仪器总厂等。 我系1985年购买的瑞士KONTRON康强公司生产的UNICON 860型紫/可见光分光光度计，是双光束、快速自动扫描、荧屏显示的高档分光光度计。这种双光束分光光度计的特点是来自光源的连续光谱经凹面全息光栅分光后，由出射狭缝得到单色光，经过由电机带动的25周/秒左右的旋转镜分解为“样品”、“参比”光束，顺序分时通过参比池和样品吸收池，照射到光电倍增管上，由于两条光路是几乎同时测量，参比信号又不断与标准电压比较，使参比信号恒定，所以由光源、单色器、外界杂光、光电倍增管以及电源电压等带来的影响，仪器均能自动消除。最快波长扫描速度为1200nm/min，有五种测量功能和五种数据处理功能。 我系2000年购买的德国耶拿（蔡司）公司生产的SPECORD 200型高档紫外/可见光分光光度计的光路原理图如下： SPECORD 200分光光度计的样品和参比光路，分别有各自的带温控的光电二极管检测器，因而取消了电机带动的旋转镜，大大提高了仪器的稳定性及各项检测指标，其波长范围是190nm～1100nm，吸光度测定范围是0～3A，可变狭缝宽度为1nm、2nm和5nm，仪器使用微机控制时，扫描速度最高可达6000nm/min，宽大的样品室可以安装各种附件，仪器性能优良，适合教学、科研使用。该仪器的使用说明详见附录。 2. 构造： ⑴ 光源： 理想光源的条件是：①能提供连续的辐射；②光强度足够大；③在整个光谱区内光谱强度不随波长有明显变化；④光谱范围宽；⑤使用寿命长，价格低。 用于可见光和近红外光区的光源是钨灯，现在最常用的是卤钨灯（Halogen lamp），即石英钨灯泡中充以卤素，以提高钨灯的寿命。适用波长范围是320～1100nm。由于能量输出的波动为电压波动的四次方倍，因此电源电压必须稳定。 用于紫外光区的是氘灯（Deuterium lamp），适用波长范围是195～400nm，由于氘灯寿命有限，国产氘灯寿命仅五百小时左右，要注意节约灯时。 ⑵ 单色器： 单色器是分光光度计的心脏部分，它的作用是把来自光源的混合光分解为单色光并能随意改变波长。它的主要组成部件和作用是：①入射狭缝——限制杂散光进入。②色散元件——即棱镜或光栅，是核心部件，可将混合光分解为单色光。 ③准直镜——把来自入射狭缝的光束转化为平等光，并把来自色散元件的平等光聚焦于出射狭缝上。 ④出射狭缝——只让额定波长的光射出单色器。 转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长；调节出入射狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度。 光栅：光栅有透射光栅和反射光栅，实际应用的都是反射光栅，它又可分为平面反射光栅（即通称的反射光栅或闪烁光栅）和凹面反射光栅两类，凹面反射光栅可以起色散元件和准直镜两个作用，使色散后的光束聚焦于出射狭缝，得到锐线光谱。 光栅的刻制方法有两种： 机刻光栅：用金刚刀挤压镀于硬质玻璃上0.5~1的铝反射层而得。刻制工作量极大，一般每分钟只能刻10条线，刻100mm宽的600线/mm的光栅要100小时。最多刻到3600线/mm。由于其制造周期长，成本高，一般只能制得少量的母光栅，而实际应用的多是复制光栅，即在母光栅上涂上硅油，再镀上一层铝，用环氧树脂粘下来，就得到复制光栅。机刻光栅的缺点是线槽稍有缺陷时就会出现“鬼线”，即位于光谱强线两侧的模糊不清的假线。 全息光栅：用全息照相法刻制的高精度光栅。即用高强度的相干性极好的单色光，如激光，用高分辨的感光材料——光致抗蚀剂记录干涉条纹，曝光1小时，化学处理掉受光部分，再进行真空镀膜（镀铝），得到全息反射光栅。这种光栅几乎没有线槽间的周期误差，几乎没有“鬼线”，杂散光很少。最大线槽密度可达6500线/mm，最大直径可达400mm，刻线越多，分辨率就越高，最常用的是1200~1500线/mm的全息光栅。 狭缝、光谱频带宽度和分辨率： 出射狭缝的宽度通常有两种表示方法：一为狭缝的实际宽度，以毫米（mm）表示，另一种为光谱频带宽度，即指由出射狭缝射出光束的光谱宽度，以毫微米nm表示。例如，出射狭缝的宽度是6nm，并不是说出射狭缝的宽度是6nm，而是指由此狭缝射出的光具有6nm的光谱带宽。 纯粹的单色光只是一种理想情况，分光光度计所能得到的“单色光”，实际上只是具有一定波长范围的谱带，狭缝越宽，所包括的波长范围也愈宽。 对单色光纯度来说，狭缝是愈窄愈好，但光的强度也就越弱，因此狭缝不能无限制地小，狭缝的最小宽度取决于检测器能准确地进行测量的最小光能量。目前达到的最小宽度为0.1nm。 光谱有效频带宽度“b’”——是检测器检测到的光能量为峰值一半处的二点间的波长间隔，如下图所示：  光强度 P b’ ——光谱有效频带宽（nm） b ——狭缝宽度（mm） 1/2h  ——线色散率 b’ 光谱有效频带宽b’ dλ——波长差 1/2h dS——出射狭缝平面上二条 波长λ 光线（dλ）所分开的距离（mm） 由上式可以看出，b’与b成正比， 与线色散率成反比。线色散率越大，则可得到的有效频带宽度越小。 分辨率：是仪器对相邻的两个峰可分辨的最小波长间隔，是仪器分辨邻近二条谱线的能力。 分辨率 ：  例如若可分开钠双线：则  高的分辨率可达：R=105。 所以，狭缝宽度b越小，光谱带宽b’越小，分辨率就越高。 何种情况算是能够分辨：定义为二条谱线的峰与谷处于同一位置时，此二个峰认为是刚好能分辨。 由于光栅分光其色散是线性的，所以只用一种狭缝宽度对各种波长的光的测量，其分辨率都相同，即狭缝宽度不必经常调节。只要光强能达到要求，应使用尽可能小的狭缝宽度，以提高分辨率。 ⑶ 样品室：包括有池架、吸收池（即比色杯）、以及各种可更换的附件。池架有普通池架和恒温池架，恒温池架有水恒温池架和电恒温池架。水恒温池架需用循环水恒温装置打入循环水保持池架恒温，控温精度为 0.1℃，电恒温池架十分昂贵，控温精度可达 0.05℃。 吸收池有光学玻璃杯和石英玻璃杯两种。光学玻璃杯因为普通光学玻璃吸收紫外光，因此只能用于可见光，适用波长范围是400nm～2000nm。石英玻璃杯可透过紫外光、可见光和红外光， 是最常使用的吸收池，使用波长范围是180nm～3000nm。 吸收池的形状有长方形，方形和园筒形，光程可由0.1cm至10cm，最常用的是1cm池（容积3ml），光程要求极精确，透光的玻璃面要严格垂直于光路，有的石英杯上方刻有箭头“→”，标明杯子使用时的透光方向，反方向使用会有偏差。 有各种用途的石英吸收池：如液体池、气体池、微量池（容积5μl～1ml）、流动池（测量连续流动的样品）、长光径池（测量稀溶液用）、可装拆池（便于清洗）等。 石英杯通常还配有玻璃或塑料盖，用以防止样品挥发和氧化，以及杯内样品的快速混合。 吸收池使用注意事项： ① 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 ② 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 ③ 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 ④ 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为： A= A1－A0 高档的分光光度计有自动置零系统，可将二个杯子的偏差置零。 其他重要附件：高档分光光度计的样品室还可以更换各种重要附件，用于各种特殊量测。如换上“积分球”，可用来检测微弱透光和不透光的样品。换上“凝胶扫描装置”，可用于电泳凝胶胶条上样品带的扫描测量。 ⑷ 检测器： 检测器是一种光电转换设备，即把光强度以电讯号显示出来，常用的检测器有光电管，光电倍增管和光电二极管等三种。 ①光电管：光电管可检测10微微安（10-11A）的光电流，管内抽真空充入惰性气体，常用国产真空光电管有GD-5兰敏光电管（适用波长为210～625nm）；GD-6红敏光电管（适用波长为625～1000nm）。751型分光光度计即使用这两只光电管。 ②光电倍增管：它是检测弱光的最灵敏最常用的光电元件，其灵敏度比光电管高200多倍，光电子由阴极到阳极重复发射9次以上，每一个光电子最后可产生106～107个电子，因此总放大倍数可达106～107倍，光电倍增管的响应时间极短，能检测10-8～10-9秒级的脉冲光。其灵敏度与光电管一样受到暗电流的限制，暗电流主要来自阴极发射的热电子和电极间的漏电。 ③光电二极管：其原理是这种硅二极管受紫外～近红外辐射照射时，其导电性增强的大小与光强或正比。近年来分光光度计使用光电二极管作检测器在增加，虽然其灵敏度还赶不上光电倍增管，但它的稳定性更好，使用寿命更长，价格便宜，因而许多著名品牌的高档分光光度计都在使用它作检测器。尤其值得注意的是由于计算机技术的飞速发展，使用光电二极管的二极管阵列分光光度计有了很大的发展，二极管数目已达1024个，大大提高了分辨率。这种新型分光光度计的特点是“后分光”，即氘灯发射的光经透镜聚焦后穿过样品吸收池，经全息光栅色散后被二极管阵列的各个二极管接收，信号由计算机进行处理和存储，因而扫描速度极快，约10ms就可完成全波段扫描，绘出吸光度、波长和时间的三维立体色谱图，可以最方便快速地得到任一波长的吸收数据，它最适宜用于动力学测定，也是高效液相色谱仪最理想的检测器。 ⑸ 显示装置： 低档分光光度计现在已都使用数字显示，有的还连有打印机。现代高性能分光光度计均可以连接微机，而且有的主机还使用带液晶或CRT荧屏显示的微处理机和打印绘图机，有的还带有标准软驱，存取数据更加方便（例如SPECORD 200）。 6.3 分光光度法在生化实验技术中的应用： 分光光度计除用于常规的吸光度测定和吸收光谱的扫描外，常用的分光光度法还有导数分光光度法、催化动力学分光光度法和差示分光光度法等。 在生化实验中主要用于氨基酸含量的测定、蛋白质含量的测定、核酸的测定、酶活力测定、生物大分子的鉴定和酶催化反应动力学的研究等。