实验十二 兔肌肌酸激酶的分离纯化及部分性质的测定 一、实验原理 肌酸激酶 Creatine Kinase（CK）通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应： 肌酸激酶有四种同工酶形式：即肌肉型（ＭＭ）、脑型(BB)、杂化型(MB)和线粒体型(MiMi)。MM型主要存在于各种肌肉细胞中，BB型主要存在于脑细胞中，MB型主要存在于心肌细胞中，上述3种肌酸激酶为胞浆肌酸激酶，而MiMi型存在于线粒体内膜上。 细胞在线粒体上发生氧化磷酸化，产生ATP。但动物体内贮存能量的高能物质不是ATP而是磷酸肌酸。能量贮存和运送是通过磷酸肌酸穿梭机制(Creatine Phosphaate Shuttle)来完成的，这个机制包含了肌酸激酶的线粒体型和肌肉型两种同工酶。氧化磷酸化产生的ATP在ATP-ADP转位酶(Translocase)的帮助下被直接送到位于线粒体内膜外侧的线粒体型肌酸激酶所在部位，线粒体型肌酸激酶将ATP内的高能磷酸键转移到肌酸上，变成ADP和高能物质磷酸肌酸。磷酸肌酸在胞内扩散到达肌原纤维(Myofibrils)，肌原纤维的M-区带上结合有肌肉型肌酸激酶，当肌肉收缩时，需要大量的ATP供给能量，肌肉型肌酸激酶催化磷酸肌酸转化为ATP，而反应产生的肌酸再扩散回线粒体，重新磷酸化。 肌酸激酶同工酶在临床诊断中有十分重要的意义，在各种病变包括肌肉萎缩和心肌梗塞时，人的血清中肌酸激酶水平迅速提高，目前认为在心肌梗塞的诊断中，测定肌酸激酶的活性比作心电图更为可靠。鉴于这个酶具有重要的生理功能和临床应用价值，因而引起人们广泛的重视和深入的研究。 肌肉型肌酸激酶分子是有两个相同的亚基组成的二聚体。根据目前已经测定的兔、人、鸡、鼠肌酸激酶的一级结构，M型亚基由387个氨基酸残基组成，分子量为43000左右，分子内有8个巯基，但无二硫键。天然的肌酸激酶分子是一个紧密的球状结构。根据旋光色散研究的结果，这个酶的亚基大约有25-30％的α-螺旋，15 ％左右的β-折叠。 肌酸激酶是由两个亚基组成的寡聚酶，该酶在催化过程中，最小功能单位是亚基还是二聚体，一直是有很大争议的问题。我系生化与分子生物学教研室的王希成教授等用化学修饰和分子杂交的方法证明了肌酸激酶的两个亚基分别在二聚体中独立地起催化作用，即最小功能单位是亚基。 肌酸激酶的纯化方法有许多种，本实验采用的提纯方法为改进的Kuby 法。该酶的测活方法也有许多种，本实验采用的是pH-比色法。 肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）如下： 肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的H+，其最适pH为7.5～9.0，是一个宽阔的平台状，在此范围内测定H+ 的生成速度，可以作为酶活力的指标。本实验采用百里酚蓝作为pH指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的活性，在597nm波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H+使溶液的pH值降低，底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。肌酸激酶测活的底物溶液通常可配制20ml，当天使用。配制方法为：取10ml 48mmol/L的肌酸溶液，加入1.0ml 0.1mol/L的MgAC2，2.0ml 0.1％的百里酚蓝(称100mg百里酚蓝，加20ml乙醇溶解后再加水60ml)，1.0ml 0.1mol/L pH9.0的Gly-NaOH 缓冲液，称48mg ATP溶于此溶液，再补加水5.0ml，用0.1～0.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.8～2.0）即可。 测活时，取1.0ml的底物溶液置于微量比色皿中，加入10(l 酶溶液，迅速盖盖，混匀后立即监测597nm 处光吸收的变化，每15 秒或30 秒读一次吸光度值(A597 )，共读取5～6个数据点，用A597 对时间作图，从图中求出每min吸光度值的变化，即 △A597，按下式计算酶的比活力（U）：  [μmol／(min(mg)] 其中：1.3 为吸光度的变化换算成H+的系数。VA =1.0ml (底物溶液)，VB =0.01ml (加入的酶溶液)。C为加入酶溶液的浓度。酶溶液浓度C的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光系数为 E1％1cm=8.8。  二、实验步骤 1. 兔肌肌酸激酶的分离纯化方法如下： 将兔子颈动脉放血杀死后剥皮，取50g大腿肌或背肌，去除结缔组织和神经后剪碎，加150ml 0.01mol/L KCl，用组织打碎机(或食品加工机)和高速分散器各粉碎3次以上，每次不超过30 s 。冰浴搅拌提取15～30min，用8000r/min ， 0℃， 离心10min，弃去沉淀，测上清体积为V1，取样0.5ml后，将其余上清加入研细的NH4Cl至浓度为0.1mol/L，用5mol/L NH4OH调pH至9.0，冰浴搅拌30min，加入1.5倍V1体积的95％冷乙醇，20℃搅拌2.5h，－8℃， 8000r/min 离心 10min，弃沉淀，测上清体积为V2，取样0.5ml后加入VA ml的2 mol/L MgSO4(pH=8.5)至终浓度为0.03mol/L，并补加1.5 VA体积的95％冷乙醇，搅拌30min ，－8℃，8000r/min 离心 10min，弃去上清，沉淀加1/10 V1体积的MgAC2 (0.07mol/L，pH=9.0)溶解悬浮(可置冰箱过夜)，冰浴搅拌1h后，0℃，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V3，取样0.5ml后用0.5～1mol/L NaOH 调pH=8.0，置冰盐浴内缓慢加入VB 体积的95％的冷乙醇至终浓度为36％。 VB的计算式为：  搅拌30min后，－8℃，12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V4，取样0.5ml，置冰盐浴内缓慢加入VC 体积的95％的冷乙醇至终浓度为50％。 VC的计算式为：  搅拌30min后，－8℃，12000r/min 离心 10 min，弃上清，沉淀溶于2～3ml pH 9.0 0.05mol/L 的柠檬酸铵溶液，即为V5，取样0.2ml，并对此缓冲液透析过夜，再对1.7mmol/L的NH4OH透析，0℃， 12000r/min 离心 10 min，弃去沉淀，测上清体积为V6，取样0.5ml，其余的V6溶液用此NH4OH透析液调蛋白的质量浓度为～5g/L后上样至DEAE-32离子交换层析柱，用0.01mol/L pH 8.0的Tris-HCl平衡缓冲液洗至基线平，用凸形梯度洗脱法洗脱兔肌肌酸激酶，收集活性峰，合并得到V7样品，取样0.5ml，其余冰冻干燥得到最终的兔肌肌酸激酶样品。取样做SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，测亚基分子量，并检测其是否达到电泳一条带的纯度，再取样用凝胶层析测该酶的分子量。 酶分离纯化过程实验记录表格的各个项目为：实验步骤、溶液体积( ml)、 蛋白的质量浓度(g/L) 、 总蛋白量(mg)、比活力[μmol／(min(mg)]、总活力((mol/min)、纯化倍数和回收率。 离子交换柱层析的方法是：取约10mL 湿的DE-32阴离子交换纤维素，抽干后在0.5mol/L NaCl-NaOH溶液中浸泡30min ，水洗至中性，在0.5mol/L HCl 中浸泡30min，水洗至中性，在0.5mol/L NaOH 中浸泡30min，水洗至中性抽干，用0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl 平衡缓冲液浸泡过夜。凸形梯度洗脱液体系为：C1（混合瓶）：0.01 mol/L pH8.0 Tris-HCl ，50mL，（此瓶塞不可漏气）；C2（贮液瓶）：0.04mol/L pH8.0 Tris-HCl ，150mL。洗脱速度：0.2～0.3ml/min，收集体积：2～3ml/管。要从上样开始收集，洗脱完毕，逐管测定A280，选择A280 较大的管测活，绘制洗脱图。凸形梯度洗脱用在此处的优点是在前几十管分离杂蛋白时，盐梯度增长很快，而后几十管洗脱兔肌肌酸激酶时，盐梯度变化缓馒，有利于该酶与杂蛋白的分离。洗脱后还可以逐管测电导，画出凸形梯度洗脱曲线，并换算出该酶洗脱下来时相应的Tris-HCl缓冲液的盐浓度。 层析系统装置图如下： 2. 肌酸激酶动力学参数的测定： ⑴ 表观Km (ATP) 和Vmax的测定： 固定肌酸(Cr)的浓度，改变ATP的浓度 。 底物溶液：2.5ml 48mmol/L Cr ；0.25ml 0.1mol/L Mg++；0.5ml 0.1％ 百里酚蓝；0.25ml 0.1mol/L Gly-NaOH pH9.0；12g/L ATP加入量见表1： 表1 12g/L ATP加入量表 试管号 ATP终浓度( mol/L ) ATP加入量(ml) 1 4.0 1.0 2 2.0 0.5 3 1.0 0.25 4 0.5 0.125 5 0.4 0.100 6 0.25 0.063 对以上试液调pH至9.0，最后用水调节体积至5.0ml，分别测活。对上述数据进行双倒数作图法处理，即用1/V对1/［ATP］作图(V=1.3×△A597)，可求得表观Km (ATP) 和Vmax。 ⑵ 表观Km (Cr) 和Vmax的测定： 固定ATP浓度，改变肌酸(Cr)浓度。 底物溶液：1.0ml ATP(12g/L)；0.25ml 0.1mol/L Mg++；0.5ml 0.1％百里酚蓝； 0.25ml 0.1mol/L Gly-NaOH pH9.0；48mmol/L Cr加入量见表2： 表2 48mmol/L Cr加入量表 试管号 Cr终浓度(mol/L) Cr 加入量(ml) 1 20 2.08 2 10 1.04 3 7.5 0.78 4 5.0 0.52 5 3.3 0.344 6 2.0 0.208 对各试液调pH至9.0，最后用水调节体积至5.0ml，分别测活。对上述数据进行双倒数作图法处理，即用1/V 对1/［Cr］作图(V=1.3×△A597)，可求得表观Km (Cr)和Vmax 。 3. DTNB修饰肌酸激酶的反应动力学及酶表面可反应巯基数及总巯基数的测定： 蛋白质分子中的巯基与5,5(-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应如下： 反应结果为每当蛋白质分子中修饰掉一个-SH，就产生一个芳硫负离子，芳硫负离子在412nm处有光吸收，根据其摩尔吸光系数：ε＝13600 L. mol－1. cm－1，可以计算被修饰的巯基数。 ⑴ 修饰反应动力学： 取1.0ml酶溶液(～1mg/ml)置于微量比色皿中，加入10(l DTNB 溶液（10mmol/L），立即监测412nm处光吸收(A412 )随时间变化的动力学过程。由于DTNB的浓度［DTNB］ ＞＞［E］酶浓度，所以修饰反应是伪一级反应。用(A(－Ａt)/( A(－Ａ0)对时间进行半对数作图，求出反应的速度常数。 ⑵ 肌酸激酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定： 用微量比色皿分别测定没有变性剂和有变性剂存在下，酶溶液与DTNB溶液充分反应后的A412，按下式计算反应的巯基数，有变性剂的是总巯基数，变性剂可用SDS或脲。(文献值：总巯基数= 8 ，可反应巯基数= 2 ) 兔肌肌酸激酶(CK)的分子量= 86000 ，C为酶浓度，C= A280／0.88／86000 (mol/L)。 三、试剂 1. KCl 0.01mol/L 200ml (0.15g KCl 溶于200ml H2O) 2. NH4OH 1.7mmol/L 1000ml (取0.12ml 浓氨水，加1000ml H2O) 3. 柠檬酸铵 0.05mol/L pH9.0 1000ml (称12.15g 溶于1000ml H2O) 4. Tris-HCl 0.1mol/L pH8.0 1000ml (参见蔗糖酶实验) 5. NH4Cl 研细 10g 6. NH4OH 5mol/L 100ml (公用) 7. MgSO4 2.0mol/L pH8.5 20ml (公用) 8. MgAC2 0.07mol/L pH9.0 100ml (公用) 9. NaOH ： 0.2 0.5 1.0 2.0 5.0 ( mol/L ) (公用) 10. HAC 0.2mol/L 11. 95% CH3CH2OH乙醇 12. 粗盐 酶的纯化记录表： 实验步骤 体积 (ml) 蛋白质浓度 (mg/ml) 总蛋白 (mg)  比活力 ((mol/(mg.min))  总活力 ((mol/min) 纯化倍数 回收率         1.0  100   参 考 文 献 1.Kenyon G L.,Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 1993, 54: 367. 2. Seraydrarian M W.and Abbot B C. J.Mol.Cell.Cardiol., 1976, 8: 741. 3. Nada L. , Kuby S. , Lardy H. Methods in Enzymol., 1954, 2: 605. 4. 姚启智, 邹承鲁, 生物化学与生物物理进展, 1981, 3: 52。