实验八 离子交换柱层析分离核苷酸 一、实验目的 本实验以酵母RNA为材料，将RNA用碱水解成单核苷酸，再用离子交换柱层析进行分离，最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量，可以计算出酵母RNA的碱基组成。 本实验的目的是： 1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法 2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法 3. 熟练掌握紫外吸收分析方法 二、实验原理 1. RNA的碱水解 实验室制备单核苷酸一般用化学水解法（酸、碱水解）和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基；用碱水解可得到2'一核苷酸和3'一核苷酸的混合物；用5'一磷酸二酯酶或3'一磷酸二酯酶水解则分别可得到5'一核苷酸或3'一核苷酸。 RNA用碱水解，经过2'、3'一环核苷酸中间物，而后水解生成2'一核苷酸和3'一核苷酸。如下图所示。 碱水解一般采用0.3M的KOH，37℃保温18~20小时就能水解完全（也可以用1M KOH，80℃水解60min或0.1M KOH 100℃水解20min）。水解毕，用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右，生成的KClO4沉淀，离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型，将上清液调至适当的pH值，作样品液备用。一般用阳离子交换剂，pH调至1.5左右，用阴离子交换剂，pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。 2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离 离子交换层析是根据各种物质带电状态（或极性）的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力，因此，要成功地分离某种混合物，必须根据其所含物质的解离性质，带电状态选择适当类型的离子交换剂，并控制吸附和洗脱条件（主要是洗脱液的离子强度和pH值）,使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。 在离子交换层析中，分配系数或平衡常数（Kd）是一个重要的参数： Kd = Cs / Cm 式中：Cs是某物质在固定相（交换剂）上的摩尔浓度，Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。可以看出，与交换剂的亲和力越大，Cs越大，Kd值也越大。各种物质Kd值差异的大小决定了分离的效果。差异越大，分离效果越好。影响Kd值的因素很多，如被分离物带电荷多少，空间结构因素，离子交换剂的非极性亲和力大小，温度高低等。实验中必须反复摸索条件，才能得到最佳分离效果。 核苷酸分子中各基团的解离常数（pK）和等电点 p I 值见表1。 表 1 四种核苷酸的解离常数（pK）和等电点pI值 核苷酸  第一磷酸基 pKa1  第二磷酸基 pKa2 含氮环的亚氨基（－NH( =） pKa3  等电点 pI值*   尿苷酸UMP 鸟苷酸GMP 腺苷酸AMP 胞苷酸CMP  1.0 0.7 0.9 0.8  6.4 6.1 6.2 6.3  2.4 3.7 4.5  1.55 2.35 2.65  *注：pI = (pKa1 + pKa3) / 2 由表1可见,含氮环亚氨基的解离常数（ pK ）值相差较大，它在离子交换分离四种核苷酸中将起决定作用。 用离子交换树脂分离核苷酸，可通过调节样品溶液的pH值使它们的可解离基团解离，带上正电荷或负电荷。同时减少样品溶液中除核苷酸外的其它离子的强度。这样，当样品液加入到层析柱时，核苷酸就可以与离子交换树脂相结合。洗脱时，通过改变pH值或增加洗脱液中竞争性离子的强度，使被吸附的核苷酸的相应电荷降低，与树脂的亲和力降低，结果使核苷酸得到分离。 混合核苷酸可以用阳离子或阴离子交换树脂进行分离。采用阳离子交换时，控制样品液pH值在1.5，此时UMP带负电，而AMP、CMP、GMP带正电，可被阳离子树脂吸附。然后通过逐渐升高pH值，将各核甘酸洗脱下来，次序是UMP-GMP-CMP-AMP。AMP与CMP洗脱位置的互换，是由于聚苯乙烯树脂母体对嘌呤碱基的非极性吸附力大于对嘧啶碱基的吸附力造成的。 本实验采用聚苯乙烯一二乙烯苯三甲胺季铵碱型粉末阴离子树脂（201×8）分离四种核苷酸.首先使RNA碱水解液中的其它离子强度降至0.02以下，然后调pH值至6以上，使样品核苷酸都带上负电荷，它们都能与阴离子交换树脂结合。结合能力的强弱，与核苷酸的pI 值有关，pI 越大，与阴离子交换树脂的结合力越 弱，洗脱时越易交换下来。由表1可见，当用含竞争性离子的洗脱液进行洗脱时，洗脱下来的次序应该是CMP、AMP、GMP和UMP。由于本实验所用的树脂的不溶性基质是非极性的,它与嘌呤碱基的非极性亲和力大于与嘧啶碱基的非极性亲和力。所以，实际洗脱下来的次序为：CMP、AMP、UMP和GMP。对于同一种核甘酸的不同异构体而言，它们之间的差别仅在于磷酸基位于核糖的不同位置上，2'—磷酸基较3'—磷酸基距离碱基更近，因而它的负电性对碱基正电荷的电中和影响较大,其pK 值也较大。例如2'-胞苷酸的pK1=4.4 ，3'-胞苷酸的pK1 = 4.3 ，因此2'一核苷酸更易被洗脱下来。 应注意的是，样品不易过浓，洗脱的流速不宜过快，洗脱液的pH值要严格控制。否则将使吸附不完全，洗脱峰平坦而使各核苷酸分离不清。 3. 核苷酸的鉴定 由于核苷酸中都含有嘌呤与嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键（—C=C—C=C—），它能够强烈地吸收250~280毫微米波段的紫外光，而且有特征的紫外吸收比值。因此，通过测定各洗脱峰溶液在220~300毫微米波长范围内的紫外吸收值，作出紫外吸收光谱图，与下图所示的标准吸收光谱进行比较，并根据其吸光度比值（250nm/260nm, 280nm/260nm, 290nm/260nm）以及最大吸收峰与下页“表2”所列标准值比较后，即可判断各组分为何种核苷酸。 根据各组分在其最大吸收波长（(max）处总的吸光度（总Amax ）以及相应的摩尔消光系数（E260 nm）, 可以计算出RNA中四种核苷酸的微摩尔数和碱基摩尔数百分组成。 四种核苷酸在pH = 2 ~ 4时的紫外吸收光谱曲线 （1） （2） 溶液的pH值对核苷酸的紫外吸收光度值影响较大，故测定时需要调至一定的pH值。 三、试剂与器材 试剂： 1. 酵母RNA 2. 强碱型阴离子交换树脂201×8。聚苯乙烯 一 二乙烯苯 一 三甲胺季铵碱型，全交换量大于3毫摩尔/克干树脂，粉末型100~200目。 3. 1M甲酸：21.4ml 88%甲酸定容至500ml。 4. 1M甲酸钠：34.15g纯甲酸钠（注意结晶水问题）用蒸餾水溶解，定容至500ml。 5. 0.3 M KOH: 1.68g KOH用蒸餾水溶解定容至 100ml。 6. 2 M过氯酸HClO4：17ml 过氯酸( 70~72 % )定容至100ml。 7. 2 M NaOH (50ml)，0.5 M NaOH (100ml)。 8. 1M HCl（100ml）。 9. 1% AgNO3溶液。 器材： 1. 层析柱 2. 梯度洗脱器，电磁搅拌器 3. 恒流泵 4. 自动部分收集器 5. 酸度计 6. 紫外分光光度计 7. 旋涡混合器 8. 核酸蛋白检测仪 9. 台式离心机 四、操作步骤 1. RNA的碱水解： 称取20mg酵母RNA，置于刻度离心试管中，加2ml新配制的0.3 M KOH, 用细玻璃棒搅拌溶解，于37℃水浴中保温水解20小时。然后用2M HClO4（过氯酸）调水解液pH至2以下（要少量多次，只需几滴即可）。由于核苷酸在过酸的条件下易脱嘌呤，所以滴加HClO4时需用旋涡混合器迅速搅拌，防止局部过酸，再以4000转/分的转速离心15分钟，置冰浴中10分钟，以沉淀完全。将清液倒入另一刻度试管中，用2 M NaOH逐滴将清液pH值调至8～9，作上样样品液备用。样品液上柱前，取0.1ml稀释到500倍，测定其在260nm波长处的光吸收值，用以最后计算离子交换柱层析的回收率。 离子交换树脂的预处理： 取201×8粉末型强碱型阴离子交换树脂8克（湿），先用蒸馏水浸泡2小时，浮选除去细小颗粒，同时用减压法除去树脂中存留的气泡，然后用四倍树脂量的0.5M NaOH溶液浸泡1小时，除去树脂中的碱溶性杂质。用去离子水洗至近中性后，再用四倍量 1M HCl浸泡半小时，以除去树脂中酸溶性杂质。接着用蒸馏水洗至中性（可以上柱洗），此时阴离子交换树脂为氯型。 离子交换层析柱的装柱方法： 离子交换层析柱可使用内径约1cm、长10 cm的层析柱，柱下端有烧结上的垂熔滤板，柱上端使用橡皮塞，塞子中间打一小孔。紧紧插入一根细聚乙烯管，层析柱夹在铁架台上，调成垂直，柱下端细胶管用螺旋夹夹紧，向柱内加入蒸馏水至2/3柱高，再用滴管将经过预 处理的离子交换树脂加入柱内，使树脂自由沉降至柱底，放松螺旋夹，使 蒸馏水缓慢流出，再继续加入树脂，使树脂最后沉降的高度约为6~7cm.。注意在装柱和以后使用层析柱的过程中，切勿干柱，树脂不能分层，树脂面以上要保持一定高度的液面（不能太高，约1cm），以防气泡进入树脂内部，影响分离效果。 4. 树脂的转型处理： 树脂的转型处理就是使树脂带上洗脱时所需要的离子。本实验需要将阴离子交换树脂由氯型转变为甲酸型，先用200ml 1M 甲酸钠洗柱，用1%AgNO3检查柱流出液，直至不出现白色AgCl沉淀为止。然后改用约200ml 0.2M甲酸继续洗柱，测定流出液的A260 ≤ 0.020为止。最后用蒸馏水洗柱，直至流出液的pH值接近中性（或与蒸馏水的pH相同）。 5. 加入样品并淋洗除去不被树脂吸附的组分： 加样就是将RNA碱水解产物转移到离子交换层析柱内，使其被离子交换树脂吸附。先将柱内液体用滴管轻轻吸去，使液面下降到刚接近树脂表面。旋紧下端螺旋夹，用滴管准确移取1.0 ml RNA碱水解样品液，沿柱壁小心加到树脂表面，然后松开下端螺旋夹，使样品液面下降至树脂表面，接着用滴管加入少量蒸馏水，当水面降至树脂表面时，再用约200ml蒸馏水洗柱，将不被阴离子交换树脂吸附的嘌呤及嘧啶碱基，核苷等杂质洗下来。检查流出液在260nm波长处的吸光度，直至低于0.020为止。关恒流泵，旋紧柱下端螺旋夹。 6. 梯度洗脱： 在梯度洗脱器的混合瓶内加入300ml蒸馏水，贮液瓶中加入300ml 0.20M甲酸—0.20M甲酸钠混合液（注意：梯度洗脱器底部的连通管要事先充满蒸馏水，赶尽气泡）。洗脱器出口与恒流泵入口用细塑料管相连，打开两瓶之间的连通伐和出口伐，打开电磁搅拌器，松开柱下端螺旋夹，开启恒流泵，控制 流速为5ml / 管 / 10分，开启部份收集器，分管收集流出液。以蒸馏水为对照，测定各管在260nm波长下的A260值，，给各管编号，并标出最高峰的收集管。 7. 核苷酸的鉴定： 分别测定最高峰管内液体在230nm ~ 300nm之间，每相差5nm间隔的光吸收值。其中包括有250、260、280，290nm各点（注意：液体均要保留，切勿倒掉。测量时用石英杯）。由于在小于250nm时，甲酸（ HCOOH ）具有很强的光吸收值，因此测定时所用参比对照液近似为： 第一个峰用0.05M甲酸—0.05M 甲酸钠 第二个峰用0.10M甲酸—0.10M甲酸钠 第三个峰用0.15M甲酸—0.15M甲酸钠 第四，五两峰用0.20M甲酸( 0.20M甲酸钠 也可以根据最高峰所在位置，计算甲酸、甲酸钠的浓度选择参比液。 8. 测定各种核苷酸的含量和总回收率： 分别合并（包括最高峰管在内）各组份洗脱峰管内的洗脱液，用量筒测出溶液总体积，然后测定其 A260值，参比对照液同上。根据层析柱上样液的A260值以及层析后所得到的各组份A260值之和，可以计算出离子交换柱层析的回收率。（注：RNA 的摩尔消光系数E260nm为 7.7 ~ 7.8×103，水解后增值 40 % )。 9. 树脂的再生： 使用过的离子交换树脂经过再生处理后，可重复使用。可以在柱内处理，也可以将树脂取出后处理。取出树脂的方法是用橡皮球由层析柱的下端向柱内吹气，用烧杯收集流出的树脂。树脂再生的方法与未使用的新树脂预处理方法相同。也可以直接用1M NaCl溶液浸泡或洗涤，最后用蒸馏水洗至流出液的pH值接近中性。 五、结果处理 1. 作出阴离子交换树脂柱层析分离核苷酸的洗脱曲线，以层析流出液管数（或体积）为横座标，以相应的A 260值为纵座标，作出洗脱曲线图。 2. 作出各单核苷酸的紫外吸收光谱图，根据各组份溶液在230~300nm波长范围内的吸光度值，以波长（nm）为横座标，吸光度值为纵座标，作出它们的吸收光谱图。由图上求出每个单核苷酸组分的最大吸收峰的波长值 (max ，同时，计算出各个组份在不同波长的吸光度值比值（250/260，280/260，290/260），将它们与各核苷酸的标准值（见表2，取pH=2和pH=7两组值的平均值为标准值）列表比较，从而鉴定出各组份为何种核苷酸。 3. 根据各组份溶液的合并体积（V），平均吸光度值（A260）,再查出该核苷酸的摩尔消光系数（E260），从而可以计算出每个核苷酸的微摩尔数（m）。 因为： m = C ( V 浓度  L（比色杯光程）= 1 cm 则：  ( 微摩尔 ) 由此，可以计算出各核苷酸的相对摩尔百分含量以及嘌呤与嘧啶的相对摩尔数比值。然后讨论RNA中嘌呤与嘧啶的摩尔数比值关系。 4. 根据层析上样液 A260值，以及层析后所得到的各组份 A260值之和，计算出离子交换柱层析的回收率。 参考文献 1. 张龙翔，张庭芳、李令媛主编：《生化实验方法和技术》，人民教育出版社出版（1982）。 2. 蔡武城、李碧羽、李玉民编著：《生物化学实验技术教程》，复旦大学出版社（1983）。 3. 苏拔贤主编：《生物化学制备技术》， 科学出版社（1986）。 4. 王重庆等： 《高级生物化学实验教程》， 北京大学出版社（1994）。