实验十四 “干实验”：微机模拟蛋白质纯化实验 将计算机辅助教学手段（即CAI）用于高等学校的教学工作，近年来已取得了很大发展，这是高校教学改革的重要方向。而将CAI用于实验教学，模拟动态的实验过程，则难度较大，目前成熟的实用软件还不多见。在生物化学大实验中使用计算机模拟纯化生物大分子的实验软件，意义就更为重大，因为生化大实验的试剂十分昂贵，要用到各种离心机和分光光度计，以及自动部份收集器、电泳仪等十几种仪器设备，对实验室的仪器装备条件要求很高。此外，由于生物材料的组成十分复杂，生物大分子的含量通常极微量，实验流程又长，有的实验要连续做一、二周，因而实验难度较大，如果能在生化大实验中使用CAI，则可以获得比其他实验课更显著的教学效果。 清华大学生物系生化大实验教学组多年前就十分重视CAI的工作，从1989年开始我们就将计算机模拟蛋白质纯化的实验教学软件用于生化大实验的教学，简称为“干实验”。由于该软件还有许多不足之处，1996年我们组织由朱涛同学负责的研究生科技小组重新编制了Windows界面下的实验教学软件，学生们试用后，效果良好。 下面分别介绍这两套软件。 用于DOS系统的计算机模拟蛋白质纯化教学软件： 这套软件是国外赠送的，由于在普通微机上无法使用，我系计算机室的教师对其进行了改造，用于本科生和研究生的生化大实验。该软件准备了20种假想的酶，每种酶的起始量都是527mg。软件中提供了六种常用的生化分离纯化方法，即： ①热处理(Heat treatment) ②硫酸铵沉淀(Ammoniun sulphate precipitation) ③离子交换层析(Ion exchange Chromatography) ④凝胶过滤(Gel filtration) ⑤制备等电聚焦(Preparation isoelectric focusing) ⑥聚焦层析(Chromatofocusing) 分离纯化时要求获得尽可能高的产率［Engyme yield (%)］、纯化倍数［Enrichmant］和尽可能少的“人——时”消耗［Cost (man-hours/100Units)］。每种分离纯化方法都可以反复进行。每一步操作后都可以用一维和二维电泳检验产物的纯度，并列表显示实验结果。实验结果要求所提纯的酶达到一维电泳一条带，二维电泳一个点和纯化倍数达到最大值。 Windows界面下计算机模拟纯化蛋白质的实验软件： 由于DOS系统下的实验软件已使用多年，而且是八十年代编制的，现已十分落后，分离纯化实验条件的选择太少，产率的计算时常超过100%，同一种酶使用不同的分离纯化实验条件，有时会得到相同的结果，因此由1996年开始编制新的Windows界面下的实验软件，软件名称是“Protein”，该软件是用Visual Basic编写的Win 3.1/Win 95应用程序，界面简洁明了，可以用鼠标很方便的操作，并有完整的帮助文件，对操作方法和使用的各种生化实验技术详加说明，使用者短时间即可熟练操作。 “Protein”软件有36个任务，即36组待分离纯化的蛋白。任务要求利用软件提供的几种实验技术，提纯每一个目的蛋白，最终达到单向电泳一条带，双向电泳一个点，而且使用的人时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过一个特定值。在每个任务开始时，软件给出目的蛋白的一些性质，如热稳定的温度范围和pH稳定范围等，利用这些信息，可以使实验少走弯路。 “Protein”提供的分离纯化方法有七种：①热变性；②硫铵沉淀；③排阻层析(凝胶色谱)；④离子交换层析；⑤吸附层析；⑥聚焦层析；⑦制备电泳。 例如，在使用层析方法时，可在Chromatography菜单下点选上述四种层析方法，弹出相应的参数对话框，此时要求输入柱长、内径、柱填料类型、缓冲液组分及pH值和洗脱速度等。如果采用梯度洗脱，还要求输入梯度洗脱的初始和终末浓度及洗脱体积，在输入参数之后，计算机模拟洗脱过程，并且画出A280洗脱曲线和酶活曲线，此时，可以根据分离的情况和酶活的峰位来收集组份，在收集之前还可以用电泳查看洗脱曲线上某一部位的分离效果。在确认收集之后，“Protein”软件记录该步操作的条件，计算回收率、纯化倍数以及消耗的人时和经费等。 经过反复多次的模拟实验，初步纯化了目的蛋白，在双向电泳图上能够确定该蛋白质的分子量和等电点之后，还需要重新对其各步骤的实验条件，尤其是离子交换层析、排阻层析和制备电泳等实验步骤的实验条件进行修改，以找到适合该蛋白质的最佳分离纯化实验方案和实验条件。 在“Protein”所提供的各种分离纯化方法中，热变性法和盐析法是比较好的粗提方法，在提纯的早期使用效果较好。层析是各种方法中最强有力的方法，制备电泳虽然纯化倍数高，但是回收率低。在各种层析方法中，又以离子交换层析最为有效和易于使用，并且耗费的人时和经费也较少。排层层析和聚焦层析耗费较大，但在某些特定情况下，这两种方法是不可替代的。 “Protein”提供了四种电泳方法：即，SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。这些电泳方法不但可以用以检测样品的纯度，而且也给出了样品的一些信息，如分子量、等电点等，这些信息对于后续提纯有重要的参考价值，等电聚焦电泳和PAGE还可以用于制备。 通过多年的CAI教学实践，尤其是“Protein”新软件的投入使用，使我系生化大实验的CAI教学水平上了一个新台阶，它的优点是：在几小时内可以模拟完成大量的生化实验分离纯化过程，既经济，效率又很高，实现了学生们想设计生化大实验的要求，而在实验室里要想实现这一过程是非常困难的。通过“干实验”的教学，对生化大实验中的各种实验条件进行反复的比较和选用，对所用的几种主要生化实验技术可以加深认识和理解。 本实验要求完成DOS版中的四号酶和Windows版实验软件中四至五种酶的分离纯化，而且要挑选一种酶做出其盐析曲线。 实验报告要求列表详细写出分离纯化的实验步骤、实验条件和实验结果（包括分子量和等电点），并画出洗脱曲线。 现在由生8江健森同学编制的升级软件又即将投入使用，该软件在前两版的基础上，作了新的改进和升级，定将取得更好的教学效果。