实验十一 亲和层析纯化胰蛋白酶 一、引言 前面我们所学的凝胶过滤法、离子交换法以及电泳等一系列分离纯化生物大分子的手段，比起早期采用的盐析法，有机溶剂及等电点沉淀法等，分离效果要好得多。但是，这些方法中，或是利用生物大分子在一定条件下不同的溶解度、电荷分布、总电荷的不同，或是依据其分子的大小和形状的不同。一句话，多是利用生物分子间物理和化学性质的差异来进行分离纯化的。由于这些方法的特异性比较低，加之待分离物质之间的物化性质差异较小，常常要综合不同的分离方法。经过许多步骤才能使生物分子达到一定的纯度。这样既费时间，又费试剂，有时最后产品还不能令人满意。 另外 ，有些生物大分子，往往在生物组织或发酵液中的含量很低，相对地说杂质很多，特别是一些具有生物活性的分子，往往由于分离纯化的步骤很多，时间过长，造成破坏以致失活，产率很低。这就促使人们去寻求新的方法来解决存在的问题。 亲和层析法是近十多年来迅速地发展并广泛被采用来分离纯化生物大分子的一种十分有效的方法。它具有分离快速，纯化效率高。特别是对于那些含量少，杂质多，采用常规方法难于分离的生物活性分子，显示了独特的优越性。有时一次被分离物质的纯度可提高几倍，十几倍甚至几百倍。因此，亲和层析技术已成为纯化生物分子，特别是纯化生物活性物质最重要的方法之一。 二、实验目的与要求 1. 理解亲和层析法的基本原理，并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法； 2. 理解和掌握亲和层析实验操作技术； 3. 学会一种测定蛋白水解酶活力及比活的方法。 三、基本原理 简言之，亲的层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。 许多生物分子都有一种独特的生物学功能。即它们都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性（分子间通过某些次级键结合，如范德华力，疏水力，氢键等，在一定条件下又可解离）。如：酶 和底物（包括酶的抑制剂、产物、辅酶及其底物的类似物）的结合。特异性的抗体一抗 原（包括病毒、细胞）、激素与其受体、载体蛋白，基因与其互补DNA、mRNA及阻遏蛋白的结合，植物凝集素与淋巴细胞表面抗原及某些多糖的结合等。均属于专一性而可逆的结合。这种分子之间的结合能力叫做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”或“功能层析技术”。 在实际工作中，只要把被识别的分子，称为配基（ Ligand ），在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（Matrix, 如Sepharose 4B）制成亲和吸附剂，然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子，这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。这样，原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。其过程可用简图表示如下： 亲和层析原理示意图 本实验为了纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，但不抑制糜蛋白酶。在pH = 7~8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH =2~3时，又能被解离下来。 因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和层析直接获得活力大于10,000 BAEE单位/ 毫克蛋白 胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10 ~ 20 倍以上。 四、试剂与器材 主要试剂：丙酮 三氯乙酸 HCl NaOH NaCl NaHCO3 Na2CO3 氯代环氧丙烷 乙腈 甲酸 Tris CaCl2 KCl DEAE-纤维素 Sepharose-4B. 新鲜猪胰脏 鸡蛋清 乙酸 二氧六环 二甲基亚砜 主要贮存溶液： 1. 鸡卵粘蛋白层析液（1升）0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer。 2. DEAE-纤维素处理液：0.5 mol/L HCl 300ml 和0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 0.3升。 3. 卵粘蛋白洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris -HCl Buffer 含0.3mol/L NaCl, 150ml. 4. 标准胰蛋白酶溶液：结晶胰蛋白酶以0.001N HCl 配制成50(g/ml。 5. 亲和层析柱平衡液：0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl Buffer ,含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl2, 500ml。（配1000ml：12.1g Tris，37.5g KCl，5.6g Cacl2）。 6. 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer 含0.2% Cacl2（全斑公用，配1000ml：6.05g Tris水溶后，先用4mol/L HCl调pH为8.0，然后方可加2g Cacl2 ）。 7. 亲和柱解吸液：0.1mol/L甲酸—0.5 mol/L KCl pH = 2.5 , 500ml。（配1000ml：37.5g KCl，4.35ml 甲酸）。 8. Sepharose 4B胶清洗液：0.5mol/L NaCl 和0.1mol/L NaHCO3 缓冲液，pH = 9.5, 各500ml. 9. BAEE底物缓冲液：34mg BAEE 溶于50ml 0.05 mol/L pH = 8.0 Tris -HCl buffer中，临用前配制，冰箱内可保存3天。 主要器材： 恒温水浴，温度计，G2玻璃漏斗，抽滤瓶，布氏漏斗，离心杯（50ml），透析袋，层析柱（2×30cm,26×30cm），秒表，移液管，贮液瓶（1升），电磁搅拌器，pH计，紫外分光光度计，纱布，匀浆器，pH试纸。 五、实验操作步骤 （一）鸡卵粘蛋白的分离及纯化 1. 鸡卵粘蛋白（Ovomucoid）的一些性质: Ovomucoid是一种糖蛋白，在中性及偏酸性溶液中对热及高浓度脲、有机溶剂，均有较高的耐受性。但在较酸、碱条件下，易引起变性。 Ovomucoid带有四种糖基，因此有较强的吸水性。在50%丙酮或5%三氯乙酸盐的水溶液中，仍有较好的溶解度。所以，选择合适的pH，丙酮浓度和三氯乙酸盐的浓度，可以从蛋清中除去大量的非卵粘蛋白。 由于Ovomucoid所带的糖基不同，电泳行为呈现出不均一性，等电点在3.9 ~ 4.5之间并呈现出四条电泳条带，但它们在生物学功能上差异不大，在氨基酸组成上几乎无差异，分子量约为28,000。每1摩尔的卵粘蛋白分子能抑制1摩尔的胰蛋白酶。所以每毫克高纯度的卵粘蛋白能抑制约0.84毫克的胰蛋白酶。Ovomucoid 在 280nm处的百分消光系数A1%1cm.280 = 4.13. ， 即蛋白酶浓度为1mg/ml时,溶液的吸光度A280 = 0.413 ，据此可以测定其溶液中蛋白质的含量。 2. Ovomucoid的分离及粗品制备： 取2只鸡蛋，得蛋清约50 ml ，将其温热至25℃左右，加入等体积10 % pH = 1.0的三氯乙酸溶液（配制三氯乙酸：称取10克三氯乙酸，用70 ml 蒸馏水溶解，再用5mol/L NaOH 调pH = 1.0左右，最后加蒸馏水至100ml。），这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，测定溶液的pH值，此时溶液的pH值应当是3.5±0.2 ,若偏离此值，用5N HCl或5mol/L NaOH溶液调pH = 3.5±0.2 ，注意在调pH值时，要严防局部过酸或过碱。接着25℃放置4小时或过夜。次日用4000~6000转/分 离心20分钟，收集清液，再用三层纱布过滤并检查滤液的pH值是否仍为3.5±0.2，若不是，则要调回到此范围内。然后将清液放冰浴冷却至0℃，缓缓加入3倍体积预先冷却的丙酮，用玻璃棒搅拌均匀并用塑料薄膜盖好防止丙酮挥发，放冰箱或冰浴中3 ~ 4小时后，离心（ 3000转/ 分，15 ~ 20 分钟）收集沉淀（清液留待回收丙酮）。将沉淀抽真空去净丙酮，得到粗的卵粘蛋白。将其用20 ml左右蒸馏水溶解。若溶解后的溶液浑浊，可用滤纸过滤或离心去掉不溶物。取上清装透析袋，并对蒸馏水透析去除三氯乙酸（或用Sephadex G - 25凝胶层析柱脱盐去除三氯乙酸）。测定其抑制胰蛋白酶的比活力。若比活力大于7000 BAEE / mg ，可直接用作亲和配基制备亲和吸附剂，否则应进一步纯化。 3. Ovomucoid的纯化 DEAE-纤维素的处理：称取10克DEAE - Cellulose粉（DE - 32），先用约150 ml 0.5mol/L NaCl ( 0.5mol/L NaOH溶液溶胀30分钟，用G2漏斗抽干并用去离子水冲洗至中性，转入烧杯中再用约150ml 0.5mol/L HCl浸泡20分钟，再在G2漏斗中用蒸馏水洗至中性，最后用约150 ml 0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl缓冲液浸泡，抽真空去气泡后装柱（(2cm×20cm柱），并用同一缓冲液平衡一个床体积即可使用。 将粗的Ovomucoid制品加入等体积的0.02mol/L pH=7.3 Tris-HCl绥冲液后上柱吸附，并用同一缓冲液洗杂蛋白至A280<0.05为止。最后用含0.3mol/L NaCl的上述Tris - HCl缓冲液洗脱。收集具有胰蛋白酶抑制活性的蛋白峰。测定合并液的蛋白含量及卵粘蛋白的比活性及总活力。 最后将其对蒸馏水透析（或用Sephadex G-25）脱盐，精确调溶液pH = 4.0 ~ 4.5，加入3倍体积予冷的丙酮沉淀，放冰箱或冰浴3 ~ 4小时，然后离心（3000转/ 分，15 ~ 20分钟）收集沉淀（清液回收丙酮），真空下抽去丙酮即得卵粘蛋白干粉。如将透析后溶液吹风浓缩，冰冻干燥则得海绵状松软白色干粉的卵粘蛋白。 鸡卵粘蛋白粗提物在DEAE-Cellulose柱上的层析图 平衡缓冲液：0.02mol/L pH =7.3 Tris-HCl 缓冲液 冲洗缓冲液：同上 洗脱液：0.02mol/L pH = 7.3 Tris- HCl 缓冲液并含0.3mol/L NaCl （二）亲和吸附剂的合成 目前有多种方法活化载体和偶联配基制备亲和吸附剂。本实验采用氯代环氧丙烷活化载体与偶联配基（在附录中注明了溴化氰活化载体与偶联配基的方法）。 1. 载体Sepharose 4B 的活化 - 氯代环氧丙烷活化. 可用下面两种溶剂。 (1) 二氧六环 取10ml 沉淀体积的Sepharose 4B于G2玻璃烧结漏斗中，抽滤成半干，先用约100 ml. 0.5mol/L NaCl 溶液淋洗，再用100~150ml蒸馏水洗涤，以除去其中的保护剂和防腐剂。抽干约得6克半干滤并，置于50ml三角瓶中，加入6.5 ml 2mol/L NaOH，2ml氯代环氧丙烷及15ml 56%二氧六环，并置于40℃温和搅拌2小时，然后将胶转移到G2玻璃漏斗中以蒸馏水淋洗除去多余的试剂，最后再用约100ml 0.2mol/L Na2CO3 pH = 9.5缓冲液洗涤。接着尽快进行偶联实验。 （2）二甲基亚砜 同（1）法将6克半干滤并置于50ml三角瓶中，加入6.5 ml 2mol/L NaOH，2 ml氯代环氧丙烷及15ml 56%二甲基亚砜，充分混匀，在40℃ 振荡2小时，然后同（1）法洗涤凝胶后尽快进行偶联。 2. 鸡卵粘蛋白与活化的载体Sepharose-4B偶联 将已活化好的Sepharose-4B转移到三角瓶中。用10ml 0.2mol/L Na2CO3, pH = 9.5缓冲液将上述制备好的卵粘蛋白溶解（或0.1mol/L NaOH 10ml 溶解），取出0.1ml溶液稀释20 ~ 30倍，用紫外分光光度计测定卵粘蛋白的含量。剩余的溶液全部转移到三角瓶中与活化好的Sepharose 4B偶联。在40℃恒温摇床振荡24小时左右。偶联终止后，将凝胶倒入G2漏斗中抽干并用100ml 0.5mol/L NaCl 溶液洗去未偶联上的蛋白（收集滤液，测蛋白含量及总活力，以计算偶联率）, 再用100ml 蒸馏水淋洗。接着用亲和洗脱液（ 0.1mol/L甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5）50ml 洗一次。最后用蒸馏水洗至中性，浸泡于亲和柱平衡液 0.05 mol/L CaCl2 0.1mol/L pH = 8.0 Tris -HCl缓冲液中，放冰箱待用。 环氧氯丙烷活化载体与蛋白质配基的偶联反应式如下： （三）亲和层析分离纯化胰蛋白酶 1. 粗胰蛋白酶的制备 取100g新鲜冰冻猪胰脏，剥去脂肪及结缔组织后在匀浆机器中搅碎，加入约200ml,预冷的乙酸酸化水（pH = 4.0）, 8~10℃条件下, 搅拌提取4~5小时 ，然后四层纱布挤滤（残渣再用约100ml乙酸酸化水搅拌提取1小时，四层纱布挤滤），收集合并两次滤液，用2.5mol/L H2SO4调pH = 2.5.~3.0，放置1~2小时（静置期间要检查一下pH值，应始终保持pH = 2.5~3.0）,最后用滤纸过滤，收集滤液待激活。 2. 胰蛋白酶原的激活： 将滤液用5mol/L NaOH调pH = 8.0，加固体CaCl2 ，使溶液中Ca2+的终浓度达到0.1mol/L。( 注意先取2ml胰蛋白酶粗提液测定激活前的蛋白含量及酶活性。)然后加入2 ~5mg结晶胰蛋白酶进行激活 ，于5℃冰箱放置18~20小时进行激活（或在室温下，20 ~ 25℃左右激活 2 ~ 4 小时）即可完成。激活期间，分别在16、18小时取样测酶的活性，待酶的比活达到800 ~ 1000 BAEE单位/ mg 时停止激活。用2.5mol/L H2SO4 调至pH = 2.5 ~ 3.0, 滤去CaSO4 沉淀物，滤液放冰箱内备用。 3. 亲和层析纯化胰蛋白酶： （1） 装柱：取一支层析柱，先装入1/4体积的亲和柱平衡液（0.1mol/L pH = 8.0,含0.05mol/L CaCl2的Tris - HCl 溶液）。然后将亲和吸附剂轻轻搅匀，缓缓加入柱内，待其自然沉降，调好流速 3ml / 10 min 左右,用亲和柱平衡液平衡，检测流出液A280值小于0.02 . （2）上样：将胰蛋白酶粗提液用5mol/L NaOH 调至pH = 8.0,（若有沉淀，过滤去除之）。取一定体积上述澄清溶液上柱吸附。上样体积可大致计算如下： 胰蛋白酶上样体积（ml）=  式中： W：是卵粘蛋白偶联的总mg数； 0.84：是1mg卵粘蛋白能抑制约0.84mg胰蛋白酶； 3×104 ：是纯化后胰蛋白酶比活的近似值； C：是胰蛋白酶粗提液的浓度（mg/ml）； A：是胰蛋白酶粗提液的比活（BAEE/mg）； 1.5：是上样量过量 50% 。 吸附毕，先用平衡液洗涤，至流出液A280<0.02。换洗脱液洗脱。 （3）洗脱及收集胰蛋白酶：用0.1mol/L甲酸—0.5mol/L KCl pH = 2.5洗脱液进行洗脱。洗脱速度约2 ~ 4ml / 10min. 然后收集蛋白峰并测定收集液的蛋白含量、酶的比活力及总活力。 亲和层析柱用平衡缓冲液平衡后可再次作亲和层析。若柱内加入防腐剂0.01% 叠氮化钠NaN3在冰箱中保存，至少一年内活性不丧失。 最后可用两种方法将纯化的胰蛋白酶制成固体保存： （1）将比活力最高部分用固体(NH4)2SO4以0.8饱和度盐析，放置4小时以上，抽滤收集硫酸铵沉淀（要抽干）。滤并先用少量蒸馏水溶解，再加入1/4体积0.8mol/L pH = 9.0的硼酸溶液，冰箱中放置, 数日后即可获得棒状结晶。（注：只有胰蛋白酶的量较多时，才能得到结晶品）。 （2）将亲和层析获得的胰蛋白酶溶液放入透析袋內，在4℃对蒸馏水透析，然后冷冻干燥成干粉。 胰蛋白酶在亲和柱上的分离曲线 六、实验结果处理 1. 绘制亲和柱层析洗脱曲线。 2. 计算鸡卵粘蛋白的比活力。 3. 计算鸡卵蛋白的偶联量。 4. 绘制酶促反应动力学曲线（求初速度）。 5. 计算亲和层析纯化胰蛋白酶的比活力及纯化效率。 最后将亲和层析过程中的各项数据详细列入下表中。 亲和层析实验数据 参数  数据   亲和柱床体积（ml）    洗脱的胰蛋白酶溶液体积 ( ml )    洗脱的胰蛋白酶溶液吸光值 A280    洗脱的胰蛋白酶溶液蛋白浓度 ( mg / ml )    亲和柱吸附率 ( mg / ml 凝胶)    亲和柱洗脱酶液活力 ( u / ml )    亲和柱洗脱酶液比活力 ( u / mg )    上柱前样品比活力 ( u / mg )    亲和柱纯化效率（倍数）       附录一 ： 用溴化氰活化载体及偶联配基方法 1. 载体Sepharose4B的活化：取15ml沉淀体积的Sepharose4B,抽滤成半干物，用约10倍体积0.5mol/L NaCl洗，再用10~15倍蒸馏水洗去其中的保护剂和防腐剂。抽干约得8克半干滤并，放一小烧杯中，加入等体积的2mol/L pH = 10.5 NaHCO3 缓冲溶液，外置一冰浴，在通风厨内于电磁搅拌器上轻轻地进行搅拌，然后再缓慢加CNBr—乙腈溶液3ml（含CNBr 1g / ml乙腈），边测pH，通过逐滴加入2mol/L NaOH，始终维持pH在10.5左右，待CNBr—乙腈溶液加完并且pH不再明显变化时，即可终止反应（一般在30~35分钟内完成）。立即投入少许冰块，取出并迅速转移至G2玻璃烧结漏斗中抽滤，用大量冰水洗，最后用冷的0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 缓冲溶液洗，其用量约为凝胶体积的10~15倍。接着抽干待用。 2. 鸡卵粘蛋白的偶联：将30ml（约0.5g蛋白质）对0.1mol/L pH = 9.5 NaHCO3 透析平衡过的鸡卵粘蛋白立即加入上述活化好的凝胶中，室温缓慢搅拌反应6小时，这一步动作要快，从载体活化后到加入配基的时间最好不超过2分钟，因活化好的载体极不稳定，易变成无活性的产物。 反应6小时后取出抽滤，先用大量去离子水洗，然后用20ml 1mol/L乙醇胺（pH = 9~9.5）封闭残存的活性基团，室温搅拌反应2小时，抽滤。再用凝胶体积2~3倍的0.2mol/L甲酸和0.1mol/L pH = 8.3 Tris—HCl缓冲液交替洗涤，直到流出液中A280<0.05为止。抽干后用0.05mol/L pH = 8.3 Tris-HCl Buffer浸泡,然后置冰箱中待用。 溴化氰活化载体与蛋白质配基偶联反应式如下： 附录二： 酶活力的测定 1. 胰蛋白酶活力的测定：本实验以苯甲酰L—精氨酸乙酯（英文缩写为BAEE）为底物，用紫外吸收法进行测定。方法如下： 取2个光程为1厘米的带盖石英比色杯，先在一只杯中加入25℃予热过的2.0ml缓冲液（0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer,含0.2%CaCl2）。0.2ml 0.001mol/L HCl，然后再加0.8ml BAEE-0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer（含0.2%CaCl2 和1mmol/L BAEE）作为空白，校正仪器的253nm处光吸收零点。再在另一比色杯中加入0.2ml待测酶液（用量一般为10微克结晶的胰蛋白酶），立即混匀并记时（杯内已有2.0ml缓冲液和0.8ml BAEE溶液）。每半分钟读数一次，共读3~4分钟。若(A253/min>0.400，则酶液应当稀释或减量，控制(A253/min 在0.05 ~ 0.100左右为宜。 绘制酶促反应动力学曲线，从曲线上求出反应起始点吸光度随时间的变化率（即初速度）(A253/min。 胰蛋白酶活力单位的定义规定为：以BAEE为底物反应液pH8.0，25℃，反应体积3.0ml，光径1厘米的条件下，测定(A253，每分钟使(A253增加0.001，反应液中所加入的酶量为一BAEE单位。 所以： 胰蛋白酶溶液的活力单位（BAEE单位 / ml）＝ 胰蛋白酶比活力（BAEE单位 / mg ）＝  2. 卵粘蛋白抑制活性的测定 胰蛋白酶抑制活力单位的定义：抑制一个胰蛋白酶活力单位（BAEE单位）所需卵粘蛋白的量，定为抑制剂的一个活力单位（英文缩写为BAEE TIu）。 具体测定方法如下：首先以底物（不加酶）于253nm处校正仪器光吸收零点 （操作如上述）；再测定标准酶的活力单位（操作如上述）；测定加入抑制剂后剩余酶活力单位；在比色杯中加入0.2ml上述标准酶液再加入适量的抑制剂（一般不能超过标准酶含量，以1：2左右为宜，具体视抑制剂的纯度而定），再加入1.8 ml 0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl缓冲液，摇匀后于25℃放置2分钟以上，让酶与抑制剂充分结合。最后加入0.8ml底物（BAEE溶液），摇匀立即记时，测定A253的变化。计算剩余酶活力单位。 按下面方式计算出抑制剂的抑制活力和抑制比活力： 抑制剂溶液的抑制活力 Iu＝  （BAEE抑制单位/ml） 抑制比活力 ＝  （ BAEE T Iu / mg ） 式中： (A0：未加抑制剂时，酶每分钟(A253增加值 (Ai.：加入抑制剂后，酶每分钟(A253的增加值 N i：抑制剂溶液的稀释倍数 V i：测定时加入抑制剂的体积。 附录三：猪胰蛋白和卵粘蛋白浓度的计算 1. 猪胰蛋白酶浓度（mg/ml）= A280 ×( 1 / 1.35 ) ×稀释倍数 2. 鸡卵粘蛋白浓度（mg/ml）= A280 ×( 1 / 0.413 ) ×稀释倍数 附录四： 活性测定加样顺序参照表 试 剂  空白杯  胰酶活力  抑制剂活力  0.05mol/L pH = 8.0 Tris-HCl Buffer ( ml )  2.0  2.0  1.9 ~ 1.8  胰蛋白酶溶液 ( ml )  (  0.2  0.2  鸡卵粘蛋白溶液 ( ml )  (  (  0.1 ~ 0.2  0.001mol/L HCl ( ml )  0.2  (  (  1 mmol/L 底物 ( BAEE ) ( ml )  0.8  0.8  0.8  总体积 ( ml )  3.0  3.0  3.0   注：测定胰酶活性时，酶的用量约 5 ~ 10 (g 。 测鸡卵粘蛋白抑制活性时，用标准胰蛋白酶。前几种溶液先反应2min后再加BAEE。 参考文献 1. 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