2009-12-1 生物工程学院 1
第五章
紫外 -可见吸收
光谱分析法
第一节 概 述
generalization
第二节 光的吸收
第三节 光吸收的基本定律
Lambert-Beer’sLaw
第四节 紫外可见光分光光
度计 UV-VIS spectrometer
第五节 定性与定量分析
Qualitative- Quantitative
Analysis
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
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第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第一节 概 述
generalization
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、定义
二,分光光度法
与 比色法区别
三、特点
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紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。
波长范围,100-760 nm.
(1) 远紫外光区,100-200nm
(2) 近紫外光区, 200-400nm
(3)可见光区,400-760nm
250 300 350 400nm
1
2
3
4
e
λ
可用于结构鉴定和定量分析。
电子跃迁的同时，伴随着振
动转动能级的跃迁 ;带状光谱。
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? 一、定义
? 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为
吸光光度法, 包括 比色法, 可见分光光度法及紫外分光光度
法 等 。 本章重点讨论可见光区的吸光光度法及紫外光区的紫
外分光光度法 。
? 日常分析工作中 ----KMn04水溶液呈深紫色, K2CrO4溶液
呈黄色, CuSO4溶液呈蓝色 ……当这些有色物质溶液的浓度改
变时, 溶液颜色的深浅也随之改变, 溶液越浓, 颜色越深 ----
可以通过比较溶液颜色的深浅来测定物质的含量 。
? 这种基于比较溶液颜色的深浅进行定量分析的方法, 称
为 目视比色法 。 采用分光光度计对物质吸光度进行测定, 从
而求出物质含量的方法, 称之为 分光光度法 。
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? 紫外 -可见吸收光谱分析法 是利用物质的分子对
某一波长范围的光的吸收作用, 对物质进行定性分
析, 定量分析及结构分析的方法 。
? 按所吸收光的波长区域不同, 分为紫外分光光
度法 (200-400nm)和可见分光光度法 (400-760nm)，
合称为紫外 —可见分光光度法 (200-760nm)。
? 分光光度法是在比色法 ( colorimetry)的基础上
发展起来的 。
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二,分光光度法 与 比色法区别
? 比色法只限于在 可见光区,分光光度法则
可以扩展到 紫外光区和红外光区 。
? 比色法用的 单色光 是来自滤光片，谱带宽
度从 40－ 120nm,精度 不高，分光光度法则要
求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过 3
－ 5nm,在紫外区可到 1nm以下，来自棱镜或
光栅，具有较高的精度。
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三、紫外 —可见分光光度法特点
? (1) 仪器设备和操作都比较简单, 费用少, 分析速度
较快 。
? (2)灵敏度较高 。
? (3)有较好的选择性 。 通过适当地选择测量条件, 一
般可在多种组分共存的体系中, 对某一种物质进行测
定 。
? (4)精密度和准确度较高 。 在仪器设备和其他测量条
件较好的情况下, 其相对误差可减小到 1％ 一 2％ 。
? (5)用途广泛 。 医药, 化工, 冶金, 环境保护, 地质
等诸多领域 ---已成为必不可少的测试手段之一 。
? 无机和有机物质 --定性和定量测定,结构分析 。
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第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第二节 光的吸收
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、光的基本性质
二,物质的颜色和对
光的选择性吸收
三,吸收光谱曲线
四、紫外吸收光谱的
产生
五、有机物吸收光谱
与电子跃迁
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? 一, 光的基本性质
? 光是一种电磁波, 具有波动性和微粒性 。
? 波动性 ??＝ C
微粒性
? 波长 (或频率 )一定, 光子的能量一定 。 波长越短,
光子的能量越大 。
?? E，注,?
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? 自然界中存在各种不同波长的电磁波, 电磁辐射 (电磁
波 )按其波长可分为不同区域,
? ?一射线 5*10-3?0.14nm
? X一射线 10-3?10nm
? 远紫外 10?200nm
? 近紫外 200?400nm
? 可见光 400?760nm
? 近红外 0.75?2.5?m
? 中红外 2.5?50?m
? 远红外 50?1000?m
? 微波 0.1?100cm
? 无线电波 1?1000m
? 分光光度法所使用的光谱范围在 200nm-10μ（ 1μ= 1,
000nm ） 之间 。 其中 200nm－ 400nm为紫外光区, 400nm－
760nm为可见光区, 760nm－ 10,000nm为红外光区 。
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? 理论上将具有同一波长的光称为 单色光,
由不同波长的光组成的光称为 复合光 。
? 人眼能感觉到的光称为 可见光, 它的波长
范围约为 400—760nm。 白光 (日光, 白炽灯光,
日光灯光等 )是由各种不同色光按一定强度比
例混合而成的 。
? 一束白光通过三棱镜可分为红, 橙, 黄,
绿, 青, 蓝, 紫等七种色光, 这七种色光可以
混合为白光 。 实验证明, 如果把适当的两种色
光按一定强度比例混合, 也可以成为白光, 这
两种色光称为 互补色光 。
? 日光等白光是一对对互补色光按适当的强
度比例混合而成的 。
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? 二, 物质的颜色和对光的选择性吸收
? 物质呈现的颜色与光有着密切的关系 -----与光
的组成和物质本身的结构有关 。
? 当光束照射到物质上时，物质对于不同波长的
光的 吸收、透射、反射、折射的程度 不同，而使
物质呈现不同的颜色。
? 对 固体 物质来说，当 白光照射到物质上 时，
如果物质对各种波长的光 完全吸收,则 呈现黑色 ；
如果 完全反射,则 呈现白色 ；如果对各种波长的
光 均匀吸收,则 呈现灰色 ；如果 选择地吸收 某些
波长的光，则 呈现反射或透射光的颜色 。
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? 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是
由于溶液中的质点 (离子或分子 )对不同波长
的光具有选择性吸收而引起的。
? 当白光通过某种溶液时，如果它选
择性地吸收了白光中某种色光，则溶液
呈现透射光的颜色，也就是说,溶液呈
现的是它吸收光的互补色光的颜色 。物
质呈现颜色与吸收光波长的关系见表
? 1—2。
?
? 互补色光图
紫
青蓝
青
蓝
黄
橙
红
白光
绿
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? 表 1—2物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系
物质的颜色 吸收光
颜色 波长（ nm）
黄绿 紫 400-450
黄 蓝 450-480
橙 青蓝 480-490
红 青 490-500
紫红 绿 500-560
紫 黄绿 560-580
蓝 黄 580-600
青蓝 橙 600-650
青 红 650-760
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? 三、吸收光谱曲线
? 如果将各种波长的单色光依次通过某一
固定浓度的有色溶液，测量每一波长下有色
溶液对光的吸收程度 (即吸光度 A),然后以
波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到
一条曲线，称为 吸收光谱曲线 (简称吸收曲线 )。
从曲线可以清楚地看到该有色溶液对光的吸
收情况。（图 1-1）
图 1-1 吸收光谱图示意 图 1-2 KMnO4 溶液的光吸收曲线
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? 吸收峰（ 1） -------最大吸收波长 (?max),谷（ 2） -
---最低吸收波长 (?min)；
? 肩峰（ 3） ；
? 末端吸收（ 4） 。
? 图 1—2是四个不同浓度 KMnO4溶液的光吸收曲线 。
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? 从图上可以看到：
? (l) KMnO4溶液对不同
? 波长的光吸收情况不同 。
? 对波长为 525nm的绿色
? 光吸收最多, 在吸收曲线上有一高峰, 而对红色光和
紫色光吸收很少, 几乎能完全透过, 因此 KMnO4溶液
呈紫红色；
? (2)不同浓度 KMnO4溶液的吸收曲线形状相似, 最大
吸收波长不变 。 可作为物质 定性分析的依据 ；
? (3)同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随
浓度增加而增大 。若 在最大吸收波长处测定吸光度，
灵敏度最高 。这个特性可作为 物质定量分析的依据 。
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四、紫外吸收光谱的产生
— 电子跃迁与分子吸收光谱
?物质分子内部三种运动形式：
（ 1）电子相对于原子核的运动；
（ 2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；
（ 3）分子本身绕其重心的转动。
?分子具有三种不同能级,电子能级、振动能级和转动能级
?三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。
?分子的内能,电子能量 Ee, 振动能量 Ev,转动能量 Er
?一个分子吸收了外来辐射后，其 能量变化 ΔE为这 3种 能量变化
之和。 即, Δ E＝ Δ Ee+ Δ Ev+ Δ Er
能量大小顺序为,ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
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能级跃迁
当分子从外界吸收能量
之后，产生 电子跃迁,即分
子最外层电子或价电子由 基
态跃迁至激发态 。
电子能级间跃迁的同时
，总伴随有振动和转动能级
间的跃迁。即电子光谱中总
包含有振动能级和转动能级
间跃迁产生的若干谱线而呈
现 光谱带 --带状光谱 。
E2激发态
E1基态
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（ 1） 转动能级 间的能量差 ΔΕr,0.005～ 0.050eV,跃迁
产生吸收光谱位于 远红外区 。 远红外光谱或分子转动光谱 ；
（ 2） 振动能级 的能量差 ΔΕv约为,0.05～１ eV,跃迁产
生的吸收光谱位于 红外区, 红外光谱或分子振动光谱 ；
（ 3） 电子能级 的能量差 ΔΕe较大 1～ 20eV。 电子跃迁产生
的吸收光谱在 紫外 — 可见光区, 紫外 — 可见光谱或分子的电
子光谱 ；
讨论
能量大小顺序为,ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
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五、有机物吸收光谱与电子跃迁
ultraviolet spectrometry of organic compounds
?预备知识,? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键
π电子 不饱和的 π键
n电子
? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率 ;轨道不同, 电子所具有能量不同
? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态
? 成键轨道 (σ)与反键轨道 (σ*),σ <π<n <π*<σ*
?分子轨道理论的基本内容
?（ 1）分子轨道是由原子轨道线性组合而成的,分子轨道属于所有结合
在一起的 原子所共有。并且 ——参加组合的原子轨道数 =组成的分子轨
道数
?（ 2）成键两原子各提供一个原子轨道，将产生两个能量不同的分子轨
道 。 能量低于原来原子轨道的称成键分子轨道，能量高于原来原子
轨道的称反键分子轨 。并且：成键分子轨道数 = 反键分子轨道数。
有机化合物，他们在化学组成上有什么共
同点？都含有 C原子，多数含有 H原子 --含
碳的化合物或碳氢化合物及其衍生物。
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1．紫外 — 可见吸收光谱,紫外 —可见吸收光谱是由于 分子
中价电子的跃迁 而产生的。按分子轨道理论，在有机分子中存
在 σ, π, n三种价电子,它们对应有 σ 和 σ ＊, π 和 π ＊ 及 n轨道。
当它们吸收一定能量 ?E后，可以产生 σ → σ ＊, π → π ＊, n→ σ ＊,
n→ π ＊ 类型的电子跃迁（从基态向激发态 (反键轨道 )跃迁）。
这些电子跃迁所需能量大小的顺序为,n→ π ＊ <π → π ＊ <n→ σ ＊ <
σ → σ ＊ 。
五、有机物吸收光谱与电子跃迁
ultraviolet spectrometry of organic compounds
s
p *
s *
RK
E,B np?E
C O
H
n
p
sH
形成单键的电子 -σ 键电子 ； 形成双键的
电子 - π 键电子 ； 氧、氮、硫、卤素等含有
未成键的孤对电子 -n键电子。
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2、紫外、可见吸收光谱法 研究的主要对象 几乎所
有有机分子的紫外、可见吸收光谱都是由于 n→ π ＊
和 共扼的 π → π ＊ 跃迁产生。并随着共轭系统延长
，其最大吸收波长向长波方向移动。因此 紫外、可
见吸收光谱法主要研究醛、酮,?,?-不饱和醛酮
、芳香化合物、杂环化合物、共扼多烯等化合物。
3、紫外、可见吸收光谱所 使用的溶剂 含有 σ → σ
＊ 和 n→ σ ＊ 跃迁的化合物是测定紫外和 (或 )可见
吸收光谱时的良好溶剂，如 醇、醚和饱和烷烃 等。
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4、溶剂对吸收曲线的影响
当溶剂的极性由非极性改变到极性时，吸收峰
的精细结构消失，吸收带变向平滑；同时还会使吸
收的最大吸收波长 ?max发生变化，如由 n→ π ＊ 跃
迁产生的吸收带发生紫移（ λ max向短波方向移动 ），
而由 π → π ＊ 跃迁产生的吸收带发生红移（ λ max向
长波方向移动） 。
吸收强度即摩尔吸光系数 ε 增大
或减小的现象分别称为 增色效应 或
减色效应,如图所示。
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二、紫外 -可见吸收光谱的电子跃迁类型
?预备知识：
? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键
π电子 不饱和的 π键
n电子
? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率
轨道不同, 电子所具有能量不同
? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态 c
? 成键轨道与反键轨道,σ<π<n <π*<σ*
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图示
b
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?电子跃迁类型：
1.σ→ σ *跃迁：
? 饱和烃 （甲烷，乙烷）
? E很高,λ<150nm（ 远紫外区）
2,n → σ *跃迁：
? 含杂原子饱和基团 （ —OH,—NH2）
? E较大,λ150~250nm（ 真空紫外区）
3,π→ π *跃迁：
? 不饱和基团 （ —C＝ C—,—C ＝ O ）
? E较小,λ~ 200nm
? 体系共轭,E更小,λ更大
4,n→ π *跃迁：
? 含杂原子不饱和基团 （ —C ≡N, C＝ O ）
? E最小,λ 200~400nm（ 近紫外区）
? 按能量大小,σ→ σ * >n → σ * >π→ π * >n→ π *
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图示
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续前
?注：
?紫外光谱电子跃迁类型, n— π*跃迁
π— π*跃迁
? 饱和化合物无紫外吸收
? 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系
? 根据分子结构 →推测可能产生的电子跃迁类型；
? 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型
→推测分子中可能存在的基团 （ 分子结构鉴定 ）
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三、相关的基本概念
1,吸收光谱 （ 吸收曲线 ）,
不同波长光对样品作用不同, 吸收强度不同
以 λ~A作图 next
2,吸收光谱特征：定性依据
吸收峰 →λmax
吸收谷 →λmin
肩峰 →λsh
末端吸收 →饱和 σ-σ跃迁产生
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图示
back
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续前 3,生色团 （ 发色团 ）, 能吸收紫外 -可见光的基团
? 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团
具 n 电子和 π电子的基团
产生 n→ π*跃迁和 π→ π*跃迁
跃迁 E较低
?例,C＝ C； C＝ O； C＝ N； — N＝ N—
4,助色团,本身无紫外吸收, 但可以使生色团吸收
峰加强同时使吸收峰长移的基团
?有机物：连有杂原子的饱和基团
?例,— OH,— OR,— NH—, — NR2—, — X
注：当出现几个发色团共轭, 则几个发色团所产生的
吸收带将消失, 代之出现新的共轭吸收带, 其波
长将比单个发色团的吸收波长长, 强度也增强
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续前
5,红移和蓝移：
由于化合物结构变化 （ 共轭, 引入助色团取代基 ）
或采用不同溶剂后
吸收峰位置向长波方向的移动, 叫红移 （ 长移 ）
吸收峰位置向短波方向移动, 叫蓝移 （ 紫移, 短移 ）
6,增色效应和减色效应
增色效应：吸收强度增强的效应
减色效应：吸收强度减小的效应
7,强带和弱带：
εmax>105 → 强带
εmin<103 → 弱带
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四、吸收带类型和影响因素
1,R带：由含杂原子的不饱和基团的 n →π*跃迁产生
?C＝ O； C＝ N； — N＝ N—
? E小, λmax250~400nm,εmax<100
? 溶剂极性 ↑,λmax↓ → 蓝移 （ 短移 ）
2,K带：由共轭双键的 π→ π*跃迁产生
?(— CH＝ CH— )n,— CH＝ C— CO—
? λmax >200nm,εmax>104
? 共轭体系增长, λmax↑→红移, εmax↑
? 溶剂极性 ↑,对于 — (— CH＝ CH— )n— λmax不变
对于 — CH＝ C— CO— λmax↑→红移
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续前 3,B带：由 π→ π*跃迁产生
?芳香族化合物的主要特征吸收带
? λmax =254nm,宽带, 具有精细结构；
? εmax=200
? 极性溶剂中, 或苯环连有取代基, 其精细结构消失
4,E带：由苯环环形共轭系统的 π→ π*跃迁产生
?芳香族化合物的特征吸收带
? E1 180nm εmax>104 （ 常观察不到 ）
? E2 200nm εmax=7000 强吸收
? 苯环有发色团取代且与苯环共轭时, E2带与 K带合并
一起红移 （ 长移 ）
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图示
2009-12-1 生物工程学院 37
图示
2009-12-1 生物工程学院 38
图示
2009-12-1 生物工程学院 39
续前
?影响吸收带位置的因素：
1,溶剂效应：
?对 λmax影响,next
n-π*跃迁：溶剂极性 ↑,λmax↓蓝移
π-π*跃迁：溶剂极性 ↑, λmax↑红移
?对吸收光谱精细结构影响 next
溶剂极性 ↑,苯环精细结构消失
?溶剂的选择 —— 极性；纯度高；截止波长 <λmax
2,pH值的影响：影响物质存在型体, 影响吸收波长
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图示
back
2009-12-1 生物工程学院 41
图示
back
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第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第三节 光吸收的基
本定律
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、朗伯 ——比耳定
律
二,透光度、吸光
度、吸光系数、摩
尔吸光系数
三,偏离朗伯 —比
耳定律的因素
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? 一、朗伯 ——比耳定律
? 分 光 光 度 法 的 定 量 依 据 是 朗 伯 ——比 耳 定 律
（ Lambert-Beer’sLaw ） 。
? A＝ lg（ I0/I） ＝ KCL
? 式中,I0为入射光强度； I为透射光强度；
? A为吸光度； L为液层厚度 (即光程长度 )；
? C为溶液浓度； K为吸光系数；
? 上式是朗伯 ——比耳定律的数学表达式, 其 物理意义
为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时, 溶液
的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比 。
? 朗伯 ——比耳定律 不仅适用于有色溶液，也适用于其
它均匀、非散射的吸光物质 (包括液体、气体和固体 )，
是各类吸光光度法的定量依据 。
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? 朗伯－比尔定律是 分光光度法 的基本原理，这个
定律是有色溶液对 单色光 的吸收程度与溶液及液层厚
度间的定量关系。 是由朗伯定律和比尔定律归纳而得 。
? 1 朗伯定律 一束单色光通过溶液后, 由于溶液吸
收了一部分光能, 光的强度就要减弱：若溶液浓度不
变, 则 溶液的厚度 愈大 （ 即光在溶液中所经过的途径
愈长 ）, 光的强度 减低也愈显著 。 即 A=k′l
? 2 比尔定律 一束单色光照射厚度一定的均匀溶
液时, 吸光度与溶液的浓度成正比, 即 A=k″C
? 3 朗 伯 － 比 尔 定 律
如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收
的影响, 则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来, 吸
光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比, 这就
是朗伯－比尔定律 。
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? 二、透光度、吸光度、吸光系数、摩尔吸光系
数。
? 透过光的强度 I与入射光的强度 I0之比称为透光度,
用 T（ Transmittance） 表示 。 其值不大于 l。 常用百分
数 (T％ )表示：即 T=I/I0, T％ =100 T。
? 为了表示物质对光的吸收程度, 常采用 吸光度 A
（ Absorbance） 这一概念 。 即 透光度倒数的对数值
? A= lg（ 1/T） =lg（ I0/I） 。 如果 I＝ I0,说明溶液对光完
全不吸收, 则 lg（ I0/I） ＝ 0； I值越小, 说明溶液对光的
吸收程度越大, lg（ I0/I） 值也越大 。 因此, 将 lg（ I0/I）
一项称为溶液的吸光度, 常用符号 A表示 。 即
? A＝ lg（ I0/I） = lg（ 1/T） =KCL
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? 通过上述讨论，可知吸光度与有色溶液的浓度
成正比，而透光度与有色溶液的浓度成反比，
从图 1一 5可以清楚地看出它们之间的关系。
图 l一 5 吸光度、透光度与溶液浓度的关系
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? 式 A＝ KCL中的 K值为吸光系数，随 C,L所用单位
不同而不同。 如果液层厚度 L的单位为 cm,浓度 C的
单位为 g／ l时，则常数 K用 a表示,a称为吸光系数,
它的单位为 l／ g.cm； 如果 L的单位为 cm,C 的单位
为 mol／ l时，则常数 K用 e表示,e称为摩尔吸光系数,
它的单位为 l／ mo1.cm,e 在数值上等于浓度为 1mol／
l,液层厚度为 1cm时有色溶液的吸光度，但是,在分
析实践中，不能直接取浓度为 lmol／ l的有色溶液测定
e值，而是测定适当低浓度溶液的吸光度。通过汁算
求得 e 值。 由于 e值与入射光的波长有关,故在表示某
物质溶液的 e时,常用下面标注的入射光的波长。在
某 —物质的最大吸收波长 (峰 )处所测得的摩尔吸光系
数用 e?max表示。 e?max 数值范围在 10一 105之间，
e?max?104认为是强吸收 ；在 103?104之间是中强吸收 ；
e?max ＜ 103是弱吸收。
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? 吸光系数与物质的熔点或沸点等物理常数
一样, 是鉴定物质的重要依据 。 有时不同物质
可能有相同的入 max, 但它们的吸收系数却不一
定相同 。 在化合物组成成分不明的情况下, 物
质的相对分子量是一无所知的,故而摩尔浓度无
法确定,就无法使用摩尔吸光系数 。 为了方便起
见, 还 常 采 用 比 吸 光 系 数 （ Special
Absorptirity)这一概念 。
? 比吸光系数是质量浓度为１ ％ （ W/V),l为１ cm时
的吸光度值, 用 E1cm1%表示 。 E1cm1%与 e间的关系
式为 e=M,E1cm1%/10 ； 式中 M为吸光物质的相对分
子质量 。
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? 举例,Fe（ Ⅱ ） -2,2′,2′′-三联吡啶在波长 522nm
处的摩尔吸光系数为 e为 1.11*104L·mol-1·cm-1, 用 1cm
吸收池在该波长处测得百分透光度为 38.5 。 试计算铁
的浓度为多少？
? 解：
? （ 1） 首先将百分透光度改写成透光度并换算成吸光度：
? 100T= 38.5 ； T=0.385； A=-lgT= 0.415
? （ 2） 由朗伯 -比耳定律得,A=eCL
? C=A/ eL= 0.415/（ 1.11*104* 1） =3.74*10-5 mol·l-1
? 答：略
2009-12-1 生物工程学院 50
? 三, 偏离朗伯 —比耳定律的因素
? 根据朗伯 —比耳定律，当吸收池厚度不变，
以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点
直线 。但在实际工作中，吸光度与浓度间的线
性关系常常发生偏离，即对比耳定律发生偏离，
一般以负偏离的情况居多。引起偏离比耳定律
的因素很多，下面讨论一些较为常见的因素 。
2009-12-1 生物工程学院 51
? 1 非单色光,在所有偏离比耳定律的因素中,非单色光是
较为重要的一个因素 。严格地说，朗伯 —比耳定律 仅适用
于单色光 。但在实际上,经过分光后用于测量的是一小段
波长范围的复合光。 由于吸光物质对不同波长的光的吸收
能力不一样，就导致了对比耳定律的负偏离。
? 在所使用的波长范围内，吸光物质的吸收能力变化越
大，这种偏离就越显著。例如，按图 1-6所示的吸收光谱，
谱带 I的吸光系数变化不大，用谱带 I进行分析，造成的偏
离就比较小。 而谱带 Ⅱ 的吸光系数变化较大，用谱带 ?进
行分析就会造成较大的负偏离。所以,通常选择吸光物质
的最大吸收波长作为分析用波长。
? 这样，不仅能保证测定有较高
? 的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，
? 吸光系数变化不大，对比耳定律的
? 偏离程度就比较小。
2009-12-1 生物工程学院 52
? 2 朗伯 -比耳定律通常只适用于稀溶液。
? 3 光的散射也会造成对朗伯 -比耳定律的偏离。
? 4 光的折射，溶液中物质产生的荧光、非平
行光等都可以造成对比耳定律的偏离。但这些因
素造成的偏离对测定的影响很小，一般可忽略不
计。例如，在入射光束与光轴的夹角为 50时，非
平行光引起吸光度的最大相对偏差仅为 0,2％。
2009-12-1 生物工程学院 53
第五章
紫外 -可见吸收光
谱分析法 一、基本组成
general process
二、分光光度计的类型
types of spectrometer
三、分光光度计的校正
第四节
紫外 —可见分光
光度计
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
ultraviolet -visible spectrometer
2009-12-1 生物工程学院 54
仪器
紫外 -可见分光光度计
2009-12-1 生物工程学院 55
一、基本组成
general process
光源 单色器 样品室 检测器 显示
1,光源,作用 --提供入射光
在整个紫外光区或可见光谱区 可以发射连续光谱,具
有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区, 钨灯 作
为光源，其辐射波长范
围在 320～ 2500 nm。
紫外区,氢,氘灯 。
发射 185～ 400 nm的连
续光谱。
2009-12-1 生物工程学院 56
2.单色器
作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选
出一任波长单色光（的光学系统） 。
①入射狭缝,光源的光由此进入单色器；
②准光装置,透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件,将复合光分解成单色光； 棱镜或光栅；
④聚焦装置,透镜或
凹面反射镜，将分光
后所得单色光聚焦至
出射狭缝；
⑤出射狭缝 。
2009-12-1 生物工程学院 57
能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅
棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的 色散原理是依
据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长
的光分开 。 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用
于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石
英棱镜可使用的波长范围较宽，可从 185 ~ 4000nm,即可
用于紫外、可见和近红外三 个光域 。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的, 它可用于
紫外、可见及红外光域,而且在整个波长区具有良好的、
几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨
本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各
级光谱会重叠而产生干扰。
2009-12-1 生物工程学院 58
3.样品室
样品室 放置各种类型的吸收池
（比色皿）和相应的池架附件 。吸
收池主要有石英池和玻璃池两种。
在 紫外区须采用石英池, 可见区一般用玻璃池。
注意,用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿
应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反
射损失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。
? 不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，
可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超
过 15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
2009-12-1 生物工程学院 59
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的
光信号变成可测的电信号,常用的
有光电池、光电管或 光电倍增管 。
5,结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行
仪器自动控制和结果处理
2009-12-1 生物工程学院 60
?紫外 -可见分光光度计与 可见分光光度计的异同点：
相同点：均遵守朗伯 -比耳定律 。
不同点,
（ 1） 测定波长范围不同：可见分光光度计是 400-760nm。
紫外可见分光光度计是 200-760nm。
（ 2） 使用的光源不同：可见分光光度计使用的是钨丝灯
或卤钨灯；紫外可见分光光度计在可见区使用的是钨丝灯
或卤钨灯, 在紫外区使用的是氘灯 。
（ 3） 使用的吸收池不同：可见分光光度计使用的是玻璃
比色皿；紫外可见分光光度计在可见区使用的是玻璃比色
皿, 在紫外区使用的是石英比色皿 。
（ 4） 单色器中的色散元件不同：可见分光光度计使用的
是玻璃棱镜；紫外可见分光光度计使用的是石英棱镜
2009-12-1 生物工程学院 61
二、分光光度计的类型 types of spectrometer
? 按光路结构可分为：
?单光束分光光度计 (如上分厂的 751型、日本岛津 Uv—120
型,721分光光度计 )；
? 单波长双光束分光光度计 (如日本岛津 Uv一 200型，国产
710型,730型,740型 )；
?双波长双光束分光光度计
?（国产 WFZ800-5型，
?岛津 Uv一 260,265,300型）
?三种。
2009-12-1 生物工程学院 62
二、分光光度计的类型 types of spectrometer
?1.单光束,经单色器分光后的 一束平行光,轮流通过参比
溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。
简单，价廉，适于在给定
波长处测量吸光度或透光度，
一般不能作全波段光谱扫描。
2.双光束,经单色器分光后
经反射镜分解为 强度相等的两束光,一束通过参比池，一束
通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为
试样的 透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的
函数记录下来 。 自动记录，快速全波段扫描。特别适合于结
构分析。仪器复杂，价格较高。
2009-12-1 生物工程学院 63
3.双波长,由同一 光源发出的光被分成两束,分别经过 两
个单色器,得到两束不同波长（ ?1和 ?2）的单色光；快速 交替
照射同一吸收池 而后到达检测器。产生交流信号 。 最后由显
示器显示出两个波长处的 吸光度差值 ΔA（ ΔA=A?1-A?2）。
对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，
以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波
长分光光度法，往往能提高方法
的灵敏度和选择性。利用双
波长分光光度计，能获得导
数光谱。
2009-12-1 生物工程学院 64
三、分光光度计的校正
通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使
用过一段时间后都要进行 波长校正和吸光度校正 。
建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行
校正：
镨铷玻璃或钬玻璃 都有若干特征的吸收峰，可
用来 校正分光光度计的波长标尺,前者用于可见光
区，后者则对紫外和可见光区都适用。也可用
K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度 。
2009-12-1 生物工程学院 65
四、分析条件的选择
在分析工作中，要使分析方法有较高的灵
敏度和准确度，就要选择最佳的试样测定条件，
这些条件包括仪器测量条件、试样反应条件以
及参比溶液的选择等等。
2009-12-1 生物工程学院 66
(一 )仪器测量条件的选择
1,适宜的吸光度范围
偏离朗伯 -比尔定律的一些因素可以给测
量带来误差；除此以外，仪器光源不稳定、实
验条件的偶然变动、读数精度变动等也可以带
来测量误差。这些因素特别是对于浓度较大或
较小试样的测定结果影响较大，这就要求选择
适宜的吸光度范围（ 0.2—0.8），以使测量结
果的误差最小。
2009-12-1 生物工程学院 67
? 2,入射光波长的选择
? 通常是根据被测组分的吸收光谱, 选择最
强吸收带的最大吸收波长 ( ? max)为入射光波长 。
这样可以得到最大的测量灵敏度, 称为 最大吸
收原则 。 当最强吸收峰的 峰形比较尖锐 时, 往
往选用吸收稍低, 峰形稍坦的 次强峰或肩峰 进
行测定 。
2009-12-1 生物工程学院 68
?
3,狭缝宽度的选择
较为精密的分光光度计的狭缝宽度都是可
调节的。狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和校
准曲线的线性范围。狭缝宽度增大，入射光的
单色性降低，在一定的程度上会使灵敏度下降
，校准曲线偏离朗伯 -比尔定律。当然，并不是
狭缝宽度越小越好。 为了选择合适的狭缝宽度
，应以减小狭缝宽度时试样的吸光度不再增加
为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰
半宽度的 l／ 10。
2009-12-1 生物工程学院 69
?
(二 )显色反应条件的选择
对多种物质进行测定时, 常常利用显色反
应将被测组分转变为在一定波长范围内有吸收
或吸收较大的物质 。 常见的显色反应有配位反
应, 氧化还原反应以及增加生色基团的衍生化
反应等等 。
2009-12-1 生物工程学院 70
?
1,酸度
溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 。
例如影响显色剂的颜色变化, 影响有机弱酸的配
位反应, 影响被测组分的存在形式等 。 显色反应
最适宜的酸度范围可通过实验来确定,测定某一
固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化, 以吸光
度为纵坐标, 溶液的 pH值为横坐标作图 。 曲线的
平直部分 ——吸光度恒定部分, 所对应的 pH范围,
就是最适宜的酸度范围 。
2,显色剂的用量
加入过量的显色剂 (developer)可使显色反应趋
于完全 。 但显色剂浓度过大, 有可能改变化合物
的组成, 使溶液的颜色发生变化 。
2009-12-1 生物工程学院 71
3.显色时间和温度
各种显色反应的反应速率各有不同, 需要的反应
时间也不一样 。 有些显色反应在实验条件下可瞬间完成,
颜色很快达到稳定, 并在较长的时间范围内变化不大 。
但也有的显色反应需要一段时间颜色才能达到稳定 。 在
实际工作中应通过实验测定溶液在某波长下的吸光度随
时间变化的曲线, 以确定显色反应所需的最佳时间 。
显色反应大多是在室温下进行的, 但也有的反应在
室温下进行较慢, 需要加热才能迅速完成 。 应该注意的
是, 某些反应产物在加热条件下会发生分解 。 所以, 对
需要加热完成的反应, 也应 通过实验测定吸光度与温度
的变化曲线来选择显色反应适宜的温度 。
2009-12-1 生物工程学院 72
（ 三 )参比溶液的选择
测量试样溶液的吸光度时, 先要用参比溶液 (有时称为空
白 )调节透光率为 100％, 以消除溶液中其他成分以及吸收池
和溶剂对光的反射和吸收所带来的误差 。 参比溶液的组成视
试样溶液的性质而定, 合理地选择参比溶液是很重要的 。
1.溶剂参比 --当试样溶液的组成较为简单, 共存的其他组分很少
且对测定波长的光几乎无吸收时, 可采用溶剂作为参比溶液 。
2.试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收, 而显色剂
不与试样基体显色时, 可按与显色反应相同的条件处理试样,
只是不加入显色剂 。
3.试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收, 按显色
反应相同的条件, 不加入试样, 同样加入试剂和溶剂作为参
比溶液 。
4.平行操作参比 用不含被测组分的试样, 在相同的条件下与被
测试样同时进行处理, 由此得到平行操作参比溶液 。 （ 对照 -
处理 ）
2009-12-1 生物工程学院 73
第五章
紫外 -可见吸收
光谱分析法
一,定性、定量分析
qualitative and quanti-
tative analysis
二、在农业和生物学研究中
的应用
三、有机物结构确定
structure determination of
organic compounds
第五节 紫外 -可
见吸收光谱的应用
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
applications of UV-VIS
2009-12-1 生物工程学院 74
一、定性、定量分析
qualitative and quantitative analysis
1,定性分析
? 依据,主要根据 光谱上一些特征吸收，包括最大吸收波
长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸光度比值等,特别
是最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 和 E1%1cm?max 是鉴定物
质的常用物理常数,
（ 1） 比较光谱的一致性 (未知试样的鉴定 )
? 两个化合物若是相同，其吸收光谱应完全一致。在鉴定
时，试样和标准品以相同浓度配制在相同溶剂中，分别测定
吸收光谱，比较光谱图是否一致。如果没有标准品，也可以
和现成的标准品光谱图 (有专门杂志收载，常称为标准图谱 )
相比较。若光谱图一致，那未两者可能是同一物质了。
2009-12-1 生物工程学院 75
? （ 2）比较最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 或
E1%1cm?max 的一致性。
? 紫外吸收光谱相同，两种化合物有时不一
定相同，所以在比较 ?max 的同时，还要比较
emax 或 E1%1cm?max 是否一致。
2009-12-1 生物工程学院 76
（ 3） 比较吸光度比值的一致性
? 有时物质的吸收峰较多，往往规定在几个
吸收 峰处吸光度或吸收系数的比值 作鉴别标准。
如维生素 B12,有三个吸收峰 278,361及 550nm，
就利用下列比值进行比较：
?
45.382.2
5 5 0
3 6 1
88.162.1
2 7 8
3 6 1
1
%1
1
%1
1
%
1
%1
???
???
nmE
nmE
nmE
nmE
cm
cm
cm
cm
如果被鉴定的物质，吸收波长相同，峰处吸光度或吸收系数
的比值在规定范围内，则可考虑与标准品分子结构基本相同。
2009-12-1 生物工程学院 77
? （ 4） 化合物中杂质的检查 (纯度检查 )
? 如果一化合物在光谱的可见区及近紫外区没有明显
的吸收峰, 而它的杂质有较强的吸收峰, 那末含有少量杂
质就能被检查出来, 例如乙醇中的杂质如苯, 苯的 ?max
为 256nm,而乙醇在此波长处几乎无吸收, 又如四氯化
碳中有没有 CS2杂质, 只要观察在 318nm处有没有明显
的吸收即可决定 。
? 如果一化合物，在可见区或近紫外区有较强的吸收峰，
可用吸收系数来检查它的纯度 。例如，菲的氯仿溶液，在
296nm处有强吸收 (Lge=4,10),用某一方法精制的菲，溶
点 100℃,沸点 340℃,似乎已很纯粹，但用紫外吸收光谱
检查，测得的 Lge数值比标准菲低 10％，实际含量只有 90
％，其余很可能是蒽等杂质。
?
2009-12-1 生物工程学院 78
? 紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含
有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱
比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全
一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不
一定相同。
? 除了特殊情况外，不能单独依靠紫外吸
收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法
配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的
定量分析和纯度分析。
2009-12-1 生物工程学院 79
2,定量分析
依据：朗伯 -比耳定律
吸光度,A= e b c
透光度,-lgT = e b c
灵敏度高：灵敏度用吸收物质在最大吸收波长 ?max处的
摩尔吸光系数表示。
emax,104～ 105 L· mol-1 ·cm -1；（ 比红外大 ）
测量误差与吸光度读数有关：
A=0.434,读数相对误差最小；
A（ 0.2-0.8） 误差较小。
2009-12-1 生物工程学院 80
? （ 1） 标准曲线法
? 配制一系列的标准溶液, 其浓度包括待测
样品的浓度范围, 在干扰少的吸收峰波长处,
测定其吸光度 A与浓度 c的标准曲线, 待测样
品溶液在相同条件下进行测量, 根据测得的吸
光度 Ai值, 从标准曲线上即可查出相应的浓度
Ci。
?
A
CCi
Ai
0
2009-12-1 生物工程学院 81
? （ 2） 标准样品对照法
? 当样品溶液遵守比耳定律时, 可在同样测量条件
下测量标准溶液及待测样品溶液, 测量到的吸光度分
别为 A标 和 A样, 根据比耳定律可得到：
? 式中,C标 是已知的, 因此待测样品溶液的浓度 C
样 可计算出来 。
? 这种方法的误差比标准曲线法要大些, 但不需做
标准曲线因而要简便些 。
标
样
标
样
C
C
A
A
?
2009-12-1 生物工程学院 82
? （ 3） 多组分的定量分析
? 当溶液中含有多种物质成分时, 如果它们之间不发生
化学反应, 则 总吸光度将是各个成分的吸光度之和 。
? A＝ A1十 A2十 … 十 A。 ＝ K1LC1十 K2LC2十 … 十 KnLCn
? 我们以溶液中存在两个组分为例来说明, 可在两个波
长 ?1及 ?2处测量待测溶液的吸光度, 设它们分别为 A1及 A2，
则：
? A1＝ K11LC1十 K12LC2
? A2＝ K21LC1十 K22LC2
? K值可事先测得或从其它文献资料中查得, 解上面的联
立方程式即可得到两组分的浓度 C1及 C2。
2009-12-1 生物工程学院 83
? 例,混合液中 KMn04和 K2Cr207含量的测定 。
? (1)吸收曲线的绘制：用 2只 l cm吸收池分别测定 KMn04和 K2Cr207标准
溶液在 420—700nm的吸光度 (每隔 10nm测一次 ),在同一坐标纸上绘制两
者的吸收曲线 。 如果仪器波长准确, KMn04在 520nm和 545nm有吸收峰,
K2Cr207在 440nm有吸收峰 。
? (2)摩尔吸光系数的测定：分别吸取 3,0mL标准 KMn04和 K2Cr207溶液
加到 2个 50mL容量瓶中, 用 1mol／ LH2SO4稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收
池, 以 l mol ／ LH2SO4 溶液作参比, 分别在 440nm和 545nm处测定其吸光
度, 根据 A＝ ebc公式, 可算出摩尔吸光系数
? (3)混合液中 KMn04和 K2Cr207浓度的测定：吸取 5,0mL试液加到 50mL
容量瓶中, 以 1mol／ LH2SO4 溶液稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收池在 440
nm和 545nm处测定吸光度 。
? (4)计算：将测得的 和 代入下式解联
立方程, 即可求出 KMn04和 K2Cr207的浓度 。
?
?
MnMnCrCr AAAA 5 4 54 4 05 4 54 4 0,、、
MnMnCrCr 545440545440 eeee,、、
MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0,
MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0, MnMnCrCr
545440545440 eeee,、、
MnMn
nm
CrCr
nm
MnCr
MnMn
nm
CrCr
nm
MnCr
CCA
CCA
545545545
440440440
ee
ee
??
??
?
?
2009-12-1 生物工程学院 84
? （ 4） 示差分光光度法
? 在分光光度法中, 待测试液的浓度过大 (吸
光度过高 )或浓度过低 (吸光度过低 ),测量误差
都较大 （ A,0.2-0.8） 。 为了克服这一缺点, 改
用标准溶液代替空白溶液来调节仪器的 100％ 透
光度或 0％ 透光度, 以提高方法的准确度 。 这种
方法称为 示差分光光度法, 简称为示差法 。
? 目前有浓溶液示差法, 稀溶液示差法和使
用两个参比溶液的示差法, 其中以浓溶液示差
法应用最多 。
2009-12-1 生物工程学院 85
? ① 浓溶液 (高浓度试样 )示差分光光度法是采用浓度
与试样含量接近的标准溶液作为参比溶液, 来测量未知试
样的吸光度 A值, 根据测得的吸光度计算试样的含量, 如
果标准溶液浓度为 Cs,待测试样浓度为 Cx,而且 Cx＞ Cs。
根据朗伯 ——比耳定律
? Ax=el Cx As=el Cs
? A=? A= Ax – As= el (Cx–Cs)= el ? C
? 测定时先用比试样稍小的标准溶液, 加入各种试剂后
作参比, 调节仪器的透光度为 100％, 即吸光度为 0,然后
测量试样溶液的吸光度 。 这时的吸光度实际上是 两者之差
? A,它与两者浓度差 ? C成正比, 且处在正常的读数范围 。
(见图 )
2009-12-1 生物工程学院 86
? 由于用已知浓度的标准溶液作参比,
如果该参比溶液的透光度为 10％, 现调
至 100％, 就意味着将仪器透光度标尺扩
展了 10倍 。 如待测试样的透光度原是 7％,
用示差分光光度法测量时将是 70％ 。
2009-12-1 生物工程学院 87
? ② 低浓度试样的测定
? 先用空白溶液调节仪器的透光度为 100％,
再用一个 浓度比试液稍高的标准溶液调节
透光度为 0％, 然后测量待测试液的透光度 。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）
示差法 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）
x
2009-12-1 生物工程学院 88
?
?? 测定浓度适中的试样, 如果希望得到更加准确的读数, 则可选择两个组分相同, 浓度不同的溶液
作参比溶液, 试液浓度应介于此两种溶液的浓度之
间 。 调节仪器, 使 浓度大的参比溶液的透光度为 0％,
浓度小的参比溶液的透光度为 100％, 作工作曲线,
并测定试液的透光度, 见上图 。
③ 浓度适中的试样（高精密度）的测定
2009-12-1 生物工程学院 89
? 二, 在农业和生物学研究中的应用
? 1,叶片色素提取液中叶绿素 a,b的含量测定
? 叶片色素的 85%丙酮提取液中叶绿素 a,b
的含量 （ mg/l） 可按 Arnon式计算：
? Ca=12.72A663-2.58A645
? Cb=22.87A645-4.67A663
? 该公式是依据叶绿素 a,b在 663,645nm的
吸光系数, 通过解二元联立方程得到 。 式中
A663, A645分别为提取液在 1cm样品池内, 对波
长 663,645nm光的吸光度 。
?
2009-12-1 生物工程学院 90
? 2,在蛋白质定量分析中的应用,
? 除经典的凯式定氮法外, 很多蛋白质定量方法是利
用紫外可见光谱法, 常用的是以下几种：
? （ 1） 酚试剂法,其原理是根据酚试剂与蛋白质中的芳香
族氨基酸 （ 色氨酸, 酪氨酸 ） 产生显色反应, 反应液在
可见区的吸光度与蛋白质含量成正比 。 分析波长的选用
与样品浓度有关：低浓度时可用 750nm,高浓度时可用
500nm。
? （ 2） 双缩脲法,其原理是蛋白质分子中的肽健在碱性溶
液中能与二价铜离子形成兰色的络合物 。 分析波长可选
用 550nm。
? （ 3） 紫外吸收光谱测定蛋白质含量,其原理是蛋白质分
子中的色氨酸和酪氨酸在 280nm处有较强的吸收 。 此外还
可用样品在 215nm与 225nm吸光度之差来测定蛋白质含量 。
2009-12-1 生物工程学院 91
? 3,氨基酸的吸收光谱测定
? 蛋白质水解产生氨基酸, 氨基酸中的游离氨基能
与水合茚三酮反应, 产生蓝紫色化合物, 其吸光度与
氨基酸含量成正比 。 可在 580nm处测定反应物的吸光
度, 确定样品中全氨基酸的含量 。
? 4,在测定 DNA中的应用
? DNA分子在紫外区有吸收, 纯的 DNA在 280,260，
230nm的吸光度之比大体上等于 0.515,1,0.450,因
此根据该吸光度比, 可以检查 DNA溶液的纯度 。
?
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三、有机化合物结构辅助解析
structure determination of organic compounds
可获得的结构信息
（ 1） 200-400nm无吸收峰 。 饱和化合物, 单烯 。
（ 2） 270-350 nm有吸收峰 （ ε=10-100） 醛酮 n→ π* 跃迁产生
的 R 带 。
（ 3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰 （ ε=200-2000）, 芳环
的特征 吸收 （ 具有精细解构的 B带 ） 。
（ 4） 200-250 nm有强吸收峰 （ ε?104）, 表明含有一个共轭
体系 （ K） 带 。 共轭二烯,K带 （ ?230 nm） ； ???? 不饱和醛
酮,K带 ?230 nm, R带 ?310-330 nm
260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰, 3,4,5个双键的共轭体系 。
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结束
欢迎您再来，再见！
第五章
紫外 -可见吸收
光谱分析法
第一节 概 述
generalization
第二节 光的吸收
第三节 光吸收的基本定律
Lambert-Beer’sLaw
第四节 紫外可见光分光光
度计 UV-VIS spectrometer
第五节 定性与定量分析
Qualitative- Quantitative
Analysis
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
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第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第一节 概 述
generalization
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、定义
二,分光光度法
与 比色法区别
三、特点
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紫外吸收光谱：分子价电子（最外层电子）能级跃迁。
波长范围,100-760 nm.
(1) 远紫外光区,100-200nm
(2) 近紫外光区, 200-400nm
(3)可见光区,400-760nm
250 300 350 400nm
1
2
3
4
e
λ
可用于结构鉴定和定量分析。
电子跃迁的同时，伴随着振
动转动能级的跃迁 ;带状光谱。
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? 一、定义
? 基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为
吸光光度法, 包括 比色法, 可见分光光度法及紫外分光光度
法 等 。 本章重点讨论可见光区的吸光光度法及紫外光区的紫
外分光光度法 。
? 日常分析工作中 ----KMn04水溶液呈深紫色, K2CrO4溶液
呈黄色, CuSO4溶液呈蓝色 ……当这些有色物质溶液的浓度改
变时, 溶液颜色的深浅也随之改变, 溶液越浓, 颜色越深 ----
可以通过比较溶液颜色的深浅来测定物质的含量 。
? 这种基于比较溶液颜色的深浅进行定量分析的方法, 称
为 目视比色法 。 采用分光光度计对物质吸光度进行测定, 从
而求出物质含量的方法, 称之为 分光光度法 。
2009-12-1 生物工程学院 5
? 紫外 -可见吸收光谱分析法 是利用物质的分子对
某一波长范围的光的吸收作用, 对物质进行定性分
析, 定量分析及结构分析的方法 。
? 按所吸收光的波长区域不同, 分为紫外分光光
度法 (200-400nm)和可见分光光度法 (400-760nm)，
合称为紫外 —可见分光光度法 (200-760nm)。
? 分光光度法是在比色法 ( colorimetry)的基础上
发展起来的 。
2009-12-1 生物工程学院 6
二,分光光度法 与 比色法区别
? 比色法只限于在 可见光区,分光光度法则
可以扩展到 紫外光区和红外光区 。
? 比色法用的 单色光 是来自滤光片，谱带宽
度从 40－ 120nm,精度 不高，分光光度法则要
求近于真正单色光，其光谱带宽最大不超过 3
－ 5nm,在紫外区可到 1nm以下，来自棱镜或
光栅，具有较高的精度。
2009-12-1 生物工程学院 7
三、紫外 —可见分光光度法特点
? (1) 仪器设备和操作都比较简单, 费用少, 分析速度
较快 。
? (2)灵敏度较高 。
? (3)有较好的选择性 。 通过适当地选择测量条件, 一
般可在多种组分共存的体系中, 对某一种物质进行测
定 。
? (4)精密度和准确度较高 。 在仪器设备和其他测量条
件较好的情况下, 其相对误差可减小到 1％ 一 2％ 。
? (5)用途广泛 。 医药, 化工, 冶金, 环境保护, 地质
等诸多领域 ---已成为必不可少的测试手段之一 。
? 无机和有机物质 --定性和定量测定,结构分析 。
2009-12-1 生物工程学院 8
第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第二节 光的吸收
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、光的基本性质
二,物质的颜色和对
光的选择性吸收
三,吸收光谱曲线
四、紫外吸收光谱的
产生
五、有机物吸收光谱
与电子跃迁
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? 一, 光的基本性质
? 光是一种电磁波, 具有波动性和微粒性 。
? 波动性 ??＝ C
微粒性
? 波长 (或频率 )一定, 光子的能量一定 。 波长越短,
光子的能量越大 。
?? E，注,?
2009-12-1 生物工程学院 10
? 自然界中存在各种不同波长的电磁波, 电磁辐射 (电磁
波 )按其波长可分为不同区域,
? ?一射线 5*10-3?0.14nm
? X一射线 10-3?10nm
? 远紫外 10?200nm
? 近紫外 200?400nm
? 可见光 400?760nm
? 近红外 0.75?2.5?m
? 中红外 2.5?50?m
? 远红外 50?1000?m
? 微波 0.1?100cm
? 无线电波 1?1000m
? 分光光度法所使用的光谱范围在 200nm-10μ（ 1μ= 1,
000nm ） 之间 。 其中 200nm－ 400nm为紫外光区, 400nm－
760nm为可见光区, 760nm－ 10,000nm为红外光区 。
2009-12-1 生物工程学院 11
? 理论上将具有同一波长的光称为 单色光,
由不同波长的光组成的光称为 复合光 。
? 人眼能感觉到的光称为 可见光, 它的波长
范围约为 400—760nm。 白光 (日光, 白炽灯光,
日光灯光等 )是由各种不同色光按一定强度比
例混合而成的 。
? 一束白光通过三棱镜可分为红, 橙, 黄,
绿, 青, 蓝, 紫等七种色光, 这七种色光可以
混合为白光 。 实验证明, 如果把适当的两种色
光按一定强度比例混合, 也可以成为白光, 这
两种色光称为 互补色光 。
? 日光等白光是一对对互补色光按适当的强
度比例混合而成的 。
2009-12-1 生物工程学院 12
? 二, 物质的颜色和对光的选择性吸收
? 物质呈现的颜色与光有着密切的关系 -----与光
的组成和物质本身的结构有关 。
? 当光束照射到物质上时，物质对于不同波长的
光的 吸收、透射、反射、折射的程度 不同，而使
物质呈现不同的颜色。
? 对 固体 物质来说，当 白光照射到物质上 时，
如果物质对各种波长的光 完全吸收,则 呈现黑色 ；
如果 完全反射,则 呈现白色 ；如果对各种波长的
光 均匀吸收,则 呈现灰色 ；如果 选择地吸收 某些
波长的光，则 呈现反射或透射光的颜色 。
2009-12-1 生物工程学院 13
? 对溶液来说，溶液呈现不同的颜色是
由于溶液中的质点 (离子或分子 )对不同波长
的光具有选择性吸收而引起的。
? 当白光通过某种溶液时，如果它选
择性地吸收了白光中某种色光，则溶液
呈现透射光的颜色，也就是说,溶液呈
现的是它吸收光的互补色光的颜色 。物
质呈现颜色与吸收光波长的关系见表
? 1—2。
?
? 互补色光图
紫
青蓝
青
蓝
黄
橙
红
白光
绿
2009-12-1 生物工程学院 14
? 表 1—2物质的颜色与吸收光颜色和波长的关系
物质的颜色 吸收光
颜色 波长（ nm）
黄绿 紫 400-450
黄 蓝 450-480
橙 青蓝 480-490
红 青 490-500
紫红 绿 500-560
紫 黄绿 560-580
蓝 黄 580-600
青蓝 橙 600-650
青 红 650-760
2009-12-1 生物工程学院 15
? 三、吸收光谱曲线
? 如果将各种波长的单色光依次通过某一
固定浓度的有色溶液，测量每一波长下有色
溶液对光的吸收程度 (即吸光度 A),然后以
波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到
一条曲线，称为 吸收光谱曲线 (简称吸收曲线 )。
从曲线可以清楚地看到该有色溶液对光的吸
收情况。（图 1-1）
图 1-1 吸收光谱图示意 图 1-2 KMnO4 溶液的光吸收曲线
2009-12-1 生物工程学院 16
? 吸收峰（ 1） -------最大吸收波长 (?max),谷（ 2） -
---最低吸收波长 (?min)；
? 肩峰（ 3） ；
? 末端吸收（ 4） 。
? 图 1—2是四个不同浓度 KMnO4溶液的光吸收曲线 。
2009-12-1 生物工程学院 17
? 从图上可以看到：
? (l) KMnO4溶液对不同
? 波长的光吸收情况不同 。
? 对波长为 525nm的绿色
? 光吸收最多, 在吸收曲线上有一高峰, 而对红色光和
紫色光吸收很少, 几乎能完全透过, 因此 KMnO4溶液
呈紫红色；
? (2)不同浓度 KMnO4溶液的吸收曲线形状相似, 最大
吸收波长不变 。 可作为物质 定性分析的依据 ；
? (3)同一物质不同浓度的溶液，在一定波长处吸光度随
浓度增加而增大 。若 在最大吸收波长处测定吸光度，
灵敏度最高 。这个特性可作为 物质定量分析的依据 。
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四、紫外吸收光谱的产生
— 电子跃迁与分子吸收光谱
?物质分子内部三种运动形式：
（ 1）电子相对于原子核的运动；
（ 2）原子核在其平衡位置附近的相对振动；
（ 3）分子本身绕其重心的转动。
?分子具有三种不同能级,电子能级、振动能级和转动能级
?三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量。
?分子的内能,电子能量 Ee, 振动能量 Ev,转动能量 Er
?一个分子吸收了外来辐射后，其 能量变化 ΔE为这 3种 能量变化
之和。 即, Δ E＝ Δ Ee+ Δ Ev+ Δ Er
能量大小顺序为,ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
2009-12-1 生物工程学院 19
能级跃迁
当分子从外界吸收能量
之后，产生 电子跃迁,即分
子最外层电子或价电子由 基
态跃迁至激发态 。
电子能级间跃迁的同时
，总伴随有振动和转动能级
间的跃迁。即电子光谱中总
包含有振动能级和转动能级
间跃迁产生的若干谱线而呈
现 光谱带 --带状光谱 。
E2激发态
E1基态
2009-12-1 生物工程学院 20
（ 1） 转动能级 间的能量差 ΔΕr,0.005～ 0.050eV,跃迁
产生吸收光谱位于 远红外区 。 远红外光谱或分子转动光谱 ；
（ 2） 振动能级 的能量差 ΔΕv约为,0.05～１ eV,跃迁产
生的吸收光谱位于 红外区, 红外光谱或分子振动光谱 ；
（ 3） 电子能级 的能量差 ΔΕe较大 1～ 20eV。 电子跃迁产生
的吸收光谱在 紫外 — 可见光区, 紫外 — 可见光谱或分子的电
子光谱 ；
讨论
能量大小顺序为,ΔΕe>ΔΕv>ΔΕr
2009-12-1 生物工程学院 21
五、有机物吸收光谱与电子跃迁
ultraviolet spectrometry of organic compounds
?预备知识,? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键
π电子 不饱和的 π键
n电子
? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率 ;轨道不同, 电子所具有能量不同
? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态
? 成键轨道 (σ)与反键轨道 (σ*),σ <π<n <π*<σ*
?分子轨道理论的基本内容
?（ 1）分子轨道是由原子轨道线性组合而成的,分子轨道属于所有结合
在一起的 原子所共有。并且 ——参加组合的原子轨道数 =组成的分子轨
道数
?（ 2）成键两原子各提供一个原子轨道，将产生两个能量不同的分子轨
道 。 能量低于原来原子轨道的称成键分子轨道，能量高于原来原子
轨道的称反键分子轨 。并且：成键分子轨道数 = 反键分子轨道数。
有机化合物，他们在化学组成上有什么共
同点？都含有 C原子，多数含有 H原子 --含
碳的化合物或碳氢化合物及其衍生物。
2009-12-1 生物工程学院 22
1．紫外 — 可见吸收光谱,紫外 —可见吸收光谱是由于 分子
中价电子的跃迁 而产生的。按分子轨道理论，在有机分子中存
在 σ, π, n三种价电子,它们对应有 σ 和 σ ＊, π 和 π ＊ 及 n轨道。
当它们吸收一定能量 ?E后，可以产生 σ → σ ＊, π → π ＊, n→ σ ＊,
n→ π ＊ 类型的电子跃迁（从基态向激发态 (反键轨道 )跃迁）。
这些电子跃迁所需能量大小的顺序为,n→ π ＊ <π → π ＊ <n→ σ ＊ <
σ → σ ＊ 。
五、有机物吸收光谱与电子跃迁
ultraviolet spectrometry of organic compounds
s
p *
s *
RK
E,B np?E
C O
H
n
p
sH
形成单键的电子 -σ 键电子 ； 形成双键的
电子 - π 键电子 ； 氧、氮、硫、卤素等含有
未成键的孤对电子 -n键电子。
2009-12-1 生物工程学院 23
2、紫外、可见吸收光谱法 研究的主要对象 几乎所
有有机分子的紫外、可见吸收光谱都是由于 n→ π ＊
和 共扼的 π → π ＊ 跃迁产生。并随着共轭系统延长
，其最大吸收波长向长波方向移动。因此 紫外、可
见吸收光谱法主要研究醛、酮,?,?-不饱和醛酮
、芳香化合物、杂环化合物、共扼多烯等化合物。
3、紫外、可见吸收光谱所 使用的溶剂 含有 σ → σ
＊ 和 n→ σ ＊ 跃迁的化合物是测定紫外和 (或 )可见
吸收光谱时的良好溶剂，如 醇、醚和饱和烷烃 等。
2009-12-1 生物工程学院 24
4、溶剂对吸收曲线的影响
当溶剂的极性由非极性改变到极性时，吸收峰
的精细结构消失，吸收带变向平滑；同时还会使吸
收的最大吸收波长 ?max发生变化，如由 n→ π ＊ 跃
迁产生的吸收带发生紫移（ λ max向短波方向移动 ），
而由 π → π ＊ 跃迁产生的吸收带发生红移（ λ max向
长波方向移动） 。
吸收强度即摩尔吸光系数 ε 增大
或减小的现象分别称为 增色效应 或
减色效应,如图所示。
2009-12-1 生物工程学院 25
二、紫外 -可见吸收光谱的电子跃迁类型
?预备知识：
? 价电子,σ电子 → 饱和的 σ键
π电子 不饱和的 π键
n电子
? 轨道,电子围绕原子或分子运动的几率
轨道不同, 电子所具有能量不同
? 基态与激发态,电子吸收能量, 由基态 →激发态 c
? 成键轨道与反键轨道,σ<π<n <π*<σ*
2009-12-1 生物工程学院 26
图示
b
2009-12-1 生物工程学院 27
?电子跃迁类型：
1.σ→ σ *跃迁：
? 饱和烃 （甲烷，乙烷）
? E很高,λ<150nm（ 远紫外区）
2,n → σ *跃迁：
? 含杂原子饱和基团 （ —OH,—NH2）
? E较大,λ150~250nm（ 真空紫外区）
3,π→ π *跃迁：
? 不饱和基团 （ —C＝ C—,—C ＝ O ）
? E较小,λ~ 200nm
? 体系共轭,E更小,λ更大
4,n→ π *跃迁：
? 含杂原子不饱和基团 （ —C ≡N, C＝ O ）
? E最小,λ 200~400nm（ 近紫外区）
? 按能量大小,σ→ σ * >n → σ * >π→ π * >n→ π *
2009-12-1 生物工程学院 28
图示
2009-12-1 生物工程学院 29
续前
?注：
?紫外光谱电子跃迁类型, n— π*跃迁
π— π*跃迁
? 饱和化合物无紫外吸收
? 电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系
? 根据分子结构 →推测可能产生的电子跃迁类型；
? 根据吸收谱带波长和电子跃迁类型
→推测分子中可能存在的基团 （ 分子结构鉴定 ）
2009-12-1 生物工程学院 30
三、相关的基本概念
1,吸收光谱 （ 吸收曲线 ）,
不同波长光对样品作用不同, 吸收强度不同
以 λ~A作图 next
2,吸收光谱特征：定性依据
吸收峰 →λmax
吸收谷 →λmin
肩峰 →λsh
末端吸收 →饱和 σ-σ跃迁产生
2009-12-1 生物工程学院 31
图示
back
2009-12-1 生物工程学院 32
续前 3,生色团 （ 发色团 ）, 能吸收紫外 -可见光的基团
? 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团
具 n 电子和 π电子的基团
产生 n→ π*跃迁和 π→ π*跃迁
跃迁 E较低
?例,C＝ C； C＝ O； C＝ N； — N＝ N—
4,助色团,本身无紫外吸收, 但可以使生色团吸收
峰加强同时使吸收峰长移的基团
?有机物：连有杂原子的饱和基团
?例,— OH,— OR,— NH—, — NR2—, — X
注：当出现几个发色团共轭, 则几个发色团所产生的
吸收带将消失, 代之出现新的共轭吸收带, 其波
长将比单个发色团的吸收波长长, 强度也增强
2009-12-1 生物工程学院 33
续前
5,红移和蓝移：
由于化合物结构变化 （ 共轭, 引入助色团取代基 ）
或采用不同溶剂后
吸收峰位置向长波方向的移动, 叫红移 （ 长移 ）
吸收峰位置向短波方向移动, 叫蓝移 （ 紫移, 短移 ）
6,增色效应和减色效应
增色效应：吸收强度增强的效应
减色效应：吸收强度减小的效应
7,强带和弱带：
εmax>105 → 强带
εmin<103 → 弱带
2009-12-1 生物工程学院 34
四、吸收带类型和影响因素
1,R带：由含杂原子的不饱和基团的 n →π*跃迁产生
?C＝ O； C＝ N； — N＝ N—
? E小, λmax250~400nm,εmax<100
? 溶剂极性 ↑,λmax↓ → 蓝移 （ 短移 ）
2,K带：由共轭双键的 π→ π*跃迁产生
?(— CH＝ CH— )n,— CH＝ C— CO—
? λmax >200nm,εmax>104
? 共轭体系增长, λmax↑→红移, εmax↑
? 溶剂极性 ↑,对于 — (— CH＝ CH— )n— λmax不变
对于 — CH＝ C— CO— λmax↑→红移
2009-12-1 生物工程学院 35
续前 3,B带：由 π→ π*跃迁产生
?芳香族化合物的主要特征吸收带
? λmax =254nm,宽带, 具有精细结构；
? εmax=200
? 极性溶剂中, 或苯环连有取代基, 其精细结构消失
4,E带：由苯环环形共轭系统的 π→ π*跃迁产生
?芳香族化合物的特征吸收带
? E1 180nm εmax>104 （ 常观察不到 ）
? E2 200nm εmax=7000 强吸收
? 苯环有发色团取代且与苯环共轭时, E2带与 K带合并
一起红移 （ 长移 ）
2009-12-1 生物工程学院 36
图示
2009-12-1 生物工程学院 37
图示
2009-12-1 生物工程学院 38
图示
2009-12-1 生物工程学院 39
续前
?影响吸收带位置的因素：
1,溶剂效应：
?对 λmax影响,next
n-π*跃迁：溶剂极性 ↑,λmax↓蓝移
π-π*跃迁：溶剂极性 ↑, λmax↑红移
?对吸收光谱精细结构影响 next
溶剂极性 ↑,苯环精细结构消失
?溶剂的选择 —— 极性；纯度高；截止波长 <λmax
2,pH值的影响：影响物质存在型体, 影响吸收波长
2009-12-1 生物工程学院 40
图示
back
2009-12-1 生物工程学院 41
图示
back
2009-12-1 生物工程学院 42
第五章
紫外 -可见吸
收光谱分析法
第三节 光吸收的基
本定律
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
一、朗伯 ——比耳定
律
二,透光度、吸光
度、吸光系数、摩
尔吸光系数
三,偏离朗伯 —比
耳定律的因素
2009-12-1 生物工程学院 43
? 一、朗伯 ——比耳定律
? 分 光 光 度 法 的 定 量 依 据 是 朗 伯 ——比 耳 定 律
（ Lambert-Beer’sLaw ） 。
? A＝ lg（ I0/I） ＝ KCL
? 式中,I0为入射光强度； I为透射光强度；
? A为吸光度； L为液层厚度 (即光程长度 )；
? C为溶液浓度； K为吸光系数；
? 上式是朗伯 ——比耳定律的数学表达式, 其 物理意义
为：当一束平行单色光通过均匀的有色溶液时, 溶液
的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比 。
? 朗伯 ——比耳定律 不仅适用于有色溶液，也适用于其
它均匀、非散射的吸光物质 (包括液体、气体和固体 )，
是各类吸光光度法的定量依据 。
2009-12-1 生物工程学院 44
? 朗伯－比尔定律是 分光光度法 的基本原理，这个
定律是有色溶液对 单色光 的吸收程度与溶液及液层厚
度间的定量关系。 是由朗伯定律和比尔定律归纳而得 。
? 1 朗伯定律 一束单色光通过溶液后, 由于溶液吸
收了一部分光能, 光的强度就要减弱：若溶液浓度不
变, 则 溶液的厚度 愈大 （ 即光在溶液中所经过的途径
愈长 ）, 光的强度 减低也愈显著 。 即 A=k′l
? 2 比尔定律 一束单色光照射厚度一定的均匀溶
液时, 吸光度与溶液的浓度成正比, 即 A=k″C
? 3 朗 伯 － 比 尔 定 律
如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收
的影响, 则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来, 吸
光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比, 这就
是朗伯－比尔定律 。
2009-12-1 生物工程学院 45
? 二、透光度、吸光度、吸光系数、摩尔吸光系
数。
? 透过光的强度 I与入射光的强度 I0之比称为透光度,
用 T（ Transmittance） 表示 。 其值不大于 l。 常用百分
数 (T％ )表示：即 T=I/I0, T％ =100 T。
? 为了表示物质对光的吸收程度, 常采用 吸光度 A
（ Absorbance） 这一概念 。 即 透光度倒数的对数值
? A= lg（ 1/T） =lg（ I0/I） 。 如果 I＝ I0,说明溶液对光完
全不吸收, 则 lg（ I0/I） ＝ 0； I值越小, 说明溶液对光的
吸收程度越大, lg（ I0/I） 值也越大 。 因此, 将 lg（ I0/I）
一项称为溶液的吸光度, 常用符号 A表示 。 即
? A＝ lg（ I0/I） = lg（ 1/T） =KCL
2009-12-1 生物工程学院 46
? 通过上述讨论，可知吸光度与有色溶液的浓度
成正比，而透光度与有色溶液的浓度成反比，
从图 1一 5可以清楚地看出它们之间的关系。
图 l一 5 吸光度、透光度与溶液浓度的关系
2009-12-1 生物工程学院 47
? 式 A＝ KCL中的 K值为吸光系数，随 C,L所用单位
不同而不同。 如果液层厚度 L的单位为 cm,浓度 C的
单位为 g／ l时，则常数 K用 a表示,a称为吸光系数,
它的单位为 l／ g.cm； 如果 L的单位为 cm,C 的单位
为 mol／ l时，则常数 K用 e表示,e称为摩尔吸光系数,
它的单位为 l／ mo1.cm,e 在数值上等于浓度为 1mol／
l,液层厚度为 1cm时有色溶液的吸光度，但是,在分
析实践中，不能直接取浓度为 lmol／ l的有色溶液测定
e值，而是测定适当低浓度溶液的吸光度。通过汁算
求得 e 值。 由于 e值与入射光的波长有关,故在表示某
物质溶液的 e时,常用下面标注的入射光的波长。在
某 —物质的最大吸收波长 (峰 )处所测得的摩尔吸光系
数用 e?max表示。 e?max 数值范围在 10一 105之间，
e?max?104认为是强吸收 ；在 103?104之间是中强吸收 ；
e?max ＜ 103是弱吸收。
2009-12-1 生物工程学院 48
? 吸光系数与物质的熔点或沸点等物理常数
一样, 是鉴定物质的重要依据 。 有时不同物质
可能有相同的入 max, 但它们的吸收系数却不一
定相同 。 在化合物组成成分不明的情况下, 物
质的相对分子量是一无所知的,故而摩尔浓度无
法确定,就无法使用摩尔吸光系数 。 为了方便起
见, 还 常 采 用 比 吸 光 系 数 （ Special
Absorptirity)这一概念 。
? 比吸光系数是质量浓度为１ ％ （ W/V),l为１ cm时
的吸光度值, 用 E1cm1%表示 。 E1cm1%与 e间的关系
式为 e=M,E1cm1%/10 ； 式中 M为吸光物质的相对分
子质量 。
2009-12-1 生物工程学院 49
? 举例,Fe（ Ⅱ ） -2,2′,2′′-三联吡啶在波长 522nm
处的摩尔吸光系数为 e为 1.11*104L·mol-1·cm-1, 用 1cm
吸收池在该波长处测得百分透光度为 38.5 。 试计算铁
的浓度为多少？
? 解：
? （ 1） 首先将百分透光度改写成透光度并换算成吸光度：
? 100T= 38.5 ； T=0.385； A=-lgT= 0.415
? （ 2） 由朗伯 -比耳定律得,A=eCL
? C=A/ eL= 0.415/（ 1.11*104* 1） =3.74*10-5 mol·l-1
? 答：略
2009-12-1 生物工程学院 50
? 三, 偏离朗伯 —比耳定律的因素
? 根据朗伯 —比耳定律，当吸收池厚度不变，
以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点
直线 。但在实际工作中，吸光度与浓度间的线
性关系常常发生偏离，即对比耳定律发生偏离，
一般以负偏离的情况居多。引起偏离比耳定律
的因素很多，下面讨论一些较为常见的因素 。
2009-12-1 生物工程学院 51
? 1 非单色光,在所有偏离比耳定律的因素中,非单色光是
较为重要的一个因素 。严格地说，朗伯 —比耳定律 仅适用
于单色光 。但在实际上,经过分光后用于测量的是一小段
波长范围的复合光。 由于吸光物质对不同波长的光的吸收
能力不一样，就导致了对比耳定律的负偏离。
? 在所使用的波长范围内，吸光物质的吸收能力变化越
大，这种偏离就越显著。例如，按图 1-6所示的吸收光谱，
谱带 I的吸光系数变化不大，用谱带 I进行分析，造成的偏
离就比较小。 而谱带 Ⅱ 的吸光系数变化较大，用谱带 ?进
行分析就会造成较大的负偏离。所以,通常选择吸光物质
的最大吸收波长作为分析用波长。
? 这样，不仅能保证测定有较高
? 的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，
? 吸光系数变化不大，对比耳定律的
? 偏离程度就比较小。
2009-12-1 生物工程学院 52
? 2 朗伯 -比耳定律通常只适用于稀溶液。
? 3 光的散射也会造成对朗伯 -比耳定律的偏离。
? 4 光的折射，溶液中物质产生的荧光、非平
行光等都可以造成对比耳定律的偏离。但这些因
素造成的偏离对测定的影响很小，一般可忽略不
计。例如，在入射光束与光轴的夹角为 50时，非
平行光引起吸光度的最大相对偏差仅为 0,2％。
2009-12-1 生物工程学院 53
第五章
紫外 -可见吸收光
谱分析法 一、基本组成
general process
二、分光光度计的类型
types of spectrometer
三、分光光度计的校正
第四节
紫外 —可见分光
光度计
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
ultraviolet -visible spectrometer
2009-12-1 生物工程学院 54
仪器
紫外 -可见分光光度计
2009-12-1 生物工程学院 55
一、基本组成
general process
光源 单色器 样品室 检测器 显示
1,光源,作用 --提供入射光
在整个紫外光区或可见光谱区 可以发射连续光谱,具
有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区, 钨灯 作
为光源，其辐射波长范
围在 320～ 2500 nm。
紫外区,氢,氘灯 。
发射 185～ 400 nm的连
续光谱。
2009-12-1 生物工程学院 56
2.单色器
作用：将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选
出一任波长单色光（的光学系统） 。
①入射狭缝,光源的光由此进入单色器；
②准光装置,透镜或返射镜使入射光成为平行光束；
③色散元件,将复合光分解成单色光； 棱镜或光栅；
④聚焦装置,透镜或
凹面反射镜，将分光
后所得单色光聚焦至
出射狭缝；
⑤出射狭缝 。
2009-12-1 生物工程学院 57
能起分光作用的色散元件主要是棱镜和光栅
棱镜有玻璃和石英两种材料。它们的 色散原理是依
据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长
的光分开 。 由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用
于 350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见光域内。石
英棱镜可使用的波长范围较宽，可从 185 ~ 4000nm,即可
用于紫外、可见和近红外三 个光域 。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的, 它可用于
紫外、可见及红外光域,而且在整个波长区具有良好的、
几乎均匀一致的分辨能力。它具有色散波长范围宽、分辨
本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点是各
级光谱会重叠而产生干扰。
2009-12-1 生物工程学院 58
3.样品室
样品室 放置各种类型的吸收池
（比色皿）和相应的池架附件 。吸
收池主要有石英池和玻璃池两种。
在 紫外区须采用石英池, 可见区一般用玻璃池。
注意,用作盛空白溶液的比色皿与盛试样溶液的比色皿
应互相匹配，即有相同的厚度与相同的透光性。为了减少反
射损失，比色皿的光学面必须完全垂直于光束方向。
? 不能用手指拿比色皿杯的光学面，用后要及时洗涤，
可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超
过 15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。
2009-12-1 生物工程学院 59
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的
光信号变成可测的电信号,常用的
有光电池、光电管或 光电倍增管 。
5,结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行
仪器自动控制和结果处理
2009-12-1 生物工程学院 60
?紫外 -可见分光光度计与 可见分光光度计的异同点：
相同点：均遵守朗伯 -比耳定律 。
不同点,
（ 1） 测定波长范围不同：可见分光光度计是 400-760nm。
紫外可见分光光度计是 200-760nm。
（ 2） 使用的光源不同：可见分光光度计使用的是钨丝灯
或卤钨灯；紫外可见分光光度计在可见区使用的是钨丝灯
或卤钨灯, 在紫外区使用的是氘灯 。
（ 3） 使用的吸收池不同：可见分光光度计使用的是玻璃
比色皿；紫外可见分光光度计在可见区使用的是玻璃比色
皿, 在紫外区使用的是石英比色皿 。
（ 4） 单色器中的色散元件不同：可见分光光度计使用的
是玻璃棱镜；紫外可见分光光度计使用的是石英棱镜
2009-12-1 生物工程学院 61
二、分光光度计的类型 types of spectrometer
? 按光路结构可分为：
?单光束分光光度计 (如上分厂的 751型、日本岛津 Uv—120
型,721分光光度计 )；
? 单波长双光束分光光度计 (如日本岛津 Uv一 200型，国产
710型,730型,740型 )；
?双波长双光束分光光度计
?（国产 WFZ800-5型，
?岛津 Uv一 260,265,300型）
?三种。
2009-12-1 生物工程学院 62
二、分光光度计的类型 types of spectrometer
?1.单光束,经单色器分光后的 一束平行光,轮流通过参比
溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。
简单，价廉，适于在给定
波长处测量吸光度或透光度，
一般不能作全波段光谱扫描。
2.双光束,经单色器分光后
经反射镜分解为 强度相等的两束光,一束通过参比池，一束
通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为
试样的 透射比,经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的
函数记录下来 。 自动记录，快速全波段扫描。特别适合于结
构分析。仪器复杂，价格较高。
2009-12-1 生物工程学院 63
3.双波长,由同一 光源发出的光被分成两束,分别经过 两
个单色器,得到两束不同波长（ ?1和 ?2）的单色光；快速 交替
照射同一吸收池 而后到达检测器。产生交流信号 。 最后由显
示器显示出两个波长处的 吸光度差值 ΔA（ ΔA=A?1-A?2）。
对于多组分混合物、混浊试样（如生物组织液）分析，
以及存在背景干扰或共存组分吸收干扰的情况下，利用双波
长分光光度法，往往能提高方法
的灵敏度和选择性。利用双
波长分光光度计，能获得导
数光谱。
2009-12-1 生物工程学院 64
三、分光光度计的校正
通常在实验室工作中，验收新仪器或实验室使
用过一段时间后都要进行 波长校正和吸光度校正 。
建议采用下述的较为简便和实用的方法来进行
校正：
镨铷玻璃或钬玻璃 都有若干特征的吸收峰，可
用来 校正分光光度计的波长标尺,前者用于可见光
区，后者则对紫外和可见光区都适用。也可用
K2CrO4标准溶液来校正吸光度标度 。
2009-12-1 生物工程学院 65
四、分析条件的选择
在分析工作中，要使分析方法有较高的灵
敏度和准确度，就要选择最佳的试样测定条件，
这些条件包括仪器测量条件、试样反应条件以
及参比溶液的选择等等。
2009-12-1 生物工程学院 66
(一 )仪器测量条件的选择
1,适宜的吸光度范围
偏离朗伯 -比尔定律的一些因素可以给测
量带来误差；除此以外，仪器光源不稳定、实
验条件的偶然变动、读数精度变动等也可以带
来测量误差。这些因素特别是对于浓度较大或
较小试样的测定结果影响较大，这就要求选择
适宜的吸光度范围（ 0.2—0.8），以使测量结
果的误差最小。
2009-12-1 生物工程学院 67
? 2,入射光波长的选择
? 通常是根据被测组分的吸收光谱, 选择最
强吸收带的最大吸收波长 ( ? max)为入射光波长 。
这样可以得到最大的测量灵敏度, 称为 最大吸
收原则 。 当最强吸收峰的 峰形比较尖锐 时, 往
往选用吸收稍低, 峰形稍坦的 次强峰或肩峰 进
行测定 。
2009-12-1 生物工程学院 68
?
3,狭缝宽度的选择
较为精密的分光光度计的狭缝宽度都是可
调节的。狭缝宽度直接影响测定的灵敏度和校
准曲线的线性范围。狭缝宽度增大，入射光的
单色性降低，在一定的程度上会使灵敏度下降
，校准曲线偏离朗伯 -比尔定律。当然，并不是
狭缝宽度越小越好。 为了选择合适的狭缝宽度
，应以减小狭缝宽度时试样的吸光度不再增加
为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰
半宽度的 l／ 10。
2009-12-1 生物工程学院 69
?
(二 )显色反应条件的选择
对多种物质进行测定时, 常常利用显色反
应将被测组分转变为在一定波长范围内有吸收
或吸收较大的物质 。 常见的显色反应有配位反
应, 氧化还原反应以及增加生色基团的衍生化
反应等等 。
2009-12-1 生物工程学院 70
?
1,酸度
溶液的酸度对显色反应的影响是多方面的 。
例如影响显色剂的颜色变化, 影响有机弱酸的配
位反应, 影响被测组分的存在形式等 。 显色反应
最适宜的酸度范围可通过实验来确定,测定某一
固定浓度的试样的吸光度随酸度的变化, 以吸光
度为纵坐标, 溶液的 pH值为横坐标作图 。 曲线的
平直部分 ——吸光度恒定部分, 所对应的 pH范围,
就是最适宜的酸度范围 。
2,显色剂的用量
加入过量的显色剂 (developer)可使显色反应趋
于完全 。 但显色剂浓度过大, 有可能改变化合物
的组成, 使溶液的颜色发生变化 。
2009-12-1 生物工程学院 71
3.显色时间和温度
各种显色反应的反应速率各有不同, 需要的反应
时间也不一样 。 有些显色反应在实验条件下可瞬间完成,
颜色很快达到稳定, 并在较长的时间范围内变化不大 。
但也有的显色反应需要一段时间颜色才能达到稳定 。 在
实际工作中应通过实验测定溶液在某波长下的吸光度随
时间变化的曲线, 以确定显色反应所需的最佳时间 。
显色反应大多是在室温下进行的, 但也有的反应在
室温下进行较慢, 需要加热才能迅速完成 。 应该注意的
是, 某些反应产物在加热条件下会发生分解 。 所以, 对
需要加热完成的反应, 也应 通过实验测定吸光度与温度
的变化曲线来选择显色反应适宜的温度 。
2009-12-1 生物工程学院 72
（ 三 )参比溶液的选择
测量试样溶液的吸光度时, 先要用参比溶液 (有时称为空
白 )调节透光率为 100％, 以消除溶液中其他成分以及吸收池
和溶剂对光的反射和吸收所带来的误差 。 参比溶液的组成视
试样溶液的性质而定, 合理地选择参比溶液是很重要的 。
1.溶剂参比 --当试样溶液的组成较为简单, 共存的其他组分很少
且对测定波长的光几乎无吸收时, 可采用溶剂作为参比溶液 。
2.试样参比 如果试样基体溶液在测定波长有吸收, 而显色剂
不与试样基体显色时, 可按与显色反应相同的条件处理试样,
只是不加入显色剂 。
3.试剂参比 如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收, 按显色
反应相同的条件, 不加入试样, 同样加入试剂和溶剂作为参
比溶液 。
4.平行操作参比 用不含被测组分的试样, 在相同的条件下与被
测试样同时进行处理, 由此得到平行操作参比溶液 。 （ 对照 -
处理 ）
2009-12-1 生物工程学院 73
第五章
紫外 -可见吸收
光谱分析法
一,定性、定量分析
qualitative and quanti-
tative analysis
二、在农业和生物学研究中
的应用
三、有机物结构确定
structure determination of
organic compounds
第五节 紫外 -可
见吸收光谱的应用
Ultraviolet-visible
molecular absorption
spectrometry,UV-VIS
applications of UV-VIS
2009-12-1 生物工程学院 74
一、定性、定量分析
qualitative and quantitative analysis
1,定性分析
? 依据,主要根据 光谱上一些特征吸收，包括最大吸收波
长、最小吸收波长、肩峰、吸收系数、吸光度比值等,特别
是最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 和 E1%1cm?max 是鉴定物
质的常用物理常数,
（ 1） 比较光谱的一致性 (未知试样的鉴定 )
? 两个化合物若是相同，其吸收光谱应完全一致。在鉴定
时，试样和标准品以相同浓度配制在相同溶剂中，分别测定
吸收光谱，比较光谱图是否一致。如果没有标准品，也可以
和现成的标准品光谱图 (有专门杂志收载，常称为标准图谱 )
相比较。若光谱图一致，那未两者可能是同一物质了。
2009-12-1 生物工程学院 75
? （ 2）比较最大吸收波长 ?max及吸收系数 emax 或
E1%1cm?max 的一致性。
? 紫外吸收光谱相同，两种化合物有时不一
定相同，所以在比较 ?max 的同时，还要比较
emax 或 E1%1cm?max 是否一致。
2009-12-1 生物工程学院 76
（ 3） 比较吸光度比值的一致性
? 有时物质的吸收峰较多，往往规定在几个
吸收 峰处吸光度或吸收系数的比值 作鉴别标准。
如维生素 B12,有三个吸收峰 278,361及 550nm，
就利用下列比值进行比较：
?
45.382.2
5 5 0
3 6 1
88.162.1
2 7 8
3 6 1
1
%1
1
%1
1
%
1
%1
???
???
nmE
nmE
nmE
nmE
cm
cm
cm
cm
如果被鉴定的物质，吸收波长相同，峰处吸光度或吸收系数
的比值在规定范围内，则可考虑与标准品分子结构基本相同。
2009-12-1 生物工程学院 77
? （ 4） 化合物中杂质的检查 (纯度检查 )
? 如果一化合物在光谱的可见区及近紫外区没有明显
的吸收峰, 而它的杂质有较强的吸收峰, 那末含有少量杂
质就能被检查出来, 例如乙醇中的杂质如苯, 苯的 ?max
为 256nm,而乙醇在此波长处几乎无吸收, 又如四氯化
碳中有没有 CS2杂质, 只要观察在 318nm处有没有明显
的吸收即可决定 。
? 如果一化合物，在可见区或近紫外区有较强的吸收峰，
可用吸收系数来检查它的纯度 。例如，菲的氯仿溶液，在
296nm处有强吸收 (Lge=4,10),用某一方法精制的菲，溶
点 100℃,沸点 340℃,似乎已很纯粹，但用紫外吸收光谱
检查，测得的 Lge数值比标准菲低 10％，实际含量只有 90
％，其余很可能是蒽等杂质。
?
2009-12-1 生物工程学院 78
? 紫外线吸收是由不饱和的结构造成的，含
有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱
比较简单，同一种物质的紫外吸收光谱应完全
一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不
一定相同。
? 除了特殊情况外，不能单独依靠紫外吸
收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法
配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的
定量分析和纯度分析。
2009-12-1 生物工程学院 79
2,定量分析
依据：朗伯 -比耳定律
吸光度,A= e b c
透光度,-lgT = e b c
灵敏度高：灵敏度用吸收物质在最大吸收波长 ?max处的
摩尔吸光系数表示。
emax,104～ 105 L· mol-1 ·cm -1；（ 比红外大 ）
测量误差与吸光度读数有关：
A=0.434,读数相对误差最小；
A（ 0.2-0.8） 误差较小。
2009-12-1 生物工程学院 80
? （ 1） 标准曲线法
? 配制一系列的标准溶液, 其浓度包括待测
样品的浓度范围, 在干扰少的吸收峰波长处,
测定其吸光度 A与浓度 c的标准曲线, 待测样
品溶液在相同条件下进行测量, 根据测得的吸
光度 Ai值, 从标准曲线上即可查出相应的浓度
Ci。
?
A
CCi
Ai
0
2009-12-1 生物工程学院 81
? （ 2） 标准样品对照法
? 当样品溶液遵守比耳定律时, 可在同样测量条件
下测量标准溶液及待测样品溶液, 测量到的吸光度分
别为 A标 和 A样, 根据比耳定律可得到：
? 式中,C标 是已知的, 因此待测样品溶液的浓度 C
样 可计算出来 。
? 这种方法的误差比标准曲线法要大些, 但不需做
标准曲线因而要简便些 。
标
样
标
样
C
C
A
A
?
2009-12-1 生物工程学院 82
? （ 3） 多组分的定量分析
? 当溶液中含有多种物质成分时, 如果它们之间不发生
化学反应, 则 总吸光度将是各个成分的吸光度之和 。
? A＝ A1十 A2十 … 十 A。 ＝ K1LC1十 K2LC2十 … 十 KnLCn
? 我们以溶液中存在两个组分为例来说明, 可在两个波
长 ?1及 ?2处测量待测溶液的吸光度, 设它们分别为 A1及 A2，
则：
? A1＝ K11LC1十 K12LC2
? A2＝ K21LC1十 K22LC2
? K值可事先测得或从其它文献资料中查得, 解上面的联
立方程式即可得到两组分的浓度 C1及 C2。
2009-12-1 生物工程学院 83
? 例,混合液中 KMn04和 K2Cr207含量的测定 。
? (1)吸收曲线的绘制：用 2只 l cm吸收池分别测定 KMn04和 K2Cr207标准
溶液在 420—700nm的吸光度 (每隔 10nm测一次 ),在同一坐标纸上绘制两
者的吸收曲线 。 如果仪器波长准确, KMn04在 520nm和 545nm有吸收峰,
K2Cr207在 440nm有吸收峰 。
? (2)摩尔吸光系数的测定：分别吸取 3,0mL标准 KMn04和 K2Cr207溶液
加到 2个 50mL容量瓶中, 用 1mol／ LH2SO4稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收
池, 以 l mol ／ LH2SO4 溶液作参比, 分别在 440nm和 545nm处测定其吸光
度, 根据 A＝ ebc公式, 可算出摩尔吸光系数
? (3)混合液中 KMn04和 K2Cr207浓度的测定：吸取 5,0mL试液加到 50mL
容量瓶中, 以 1mol／ LH2SO4 溶液稀至刻度, 混匀, 用 l cm吸收池在 440
nm和 545nm处测定吸光度 。
? (4)计算：将测得的 和 代入下式解联
立方程, 即可求出 KMn04和 K2Cr207的浓度 。
?
?
MnMnCrCr AAAA 5 4 54 4 05 4 54 4 0,、、
MnMnCrCr 545440545440 eeee,、、
MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0,
MnCrMnCr AA ?? 5 4 54 4 0, MnMnCrCr
545440545440 eeee,、、
MnMn
nm
CrCr
nm
MnCr
MnMn
nm
CrCr
nm
MnCr
CCA
CCA
545545545
440440440
ee
ee
??
??
?
?
2009-12-1 生物工程学院 84
? （ 4） 示差分光光度法
? 在分光光度法中, 待测试液的浓度过大 (吸
光度过高 )或浓度过低 (吸光度过低 ),测量误差
都较大 （ A,0.2-0.8） 。 为了克服这一缺点, 改
用标准溶液代替空白溶液来调节仪器的 100％ 透
光度或 0％ 透光度, 以提高方法的准确度 。 这种
方法称为 示差分光光度法, 简称为示差法 。
? 目前有浓溶液示差法, 稀溶液示差法和使
用两个参比溶液的示差法, 其中以浓溶液示差
法应用最多 。
2009-12-1 生物工程学院 85
? ① 浓溶液 (高浓度试样 )示差分光光度法是采用浓度
与试样含量接近的标准溶液作为参比溶液, 来测量未知试
样的吸光度 A值, 根据测得的吸光度计算试样的含量, 如
果标准溶液浓度为 Cs,待测试样浓度为 Cx,而且 Cx＞ Cs。
根据朗伯 ——比耳定律
? Ax=el Cx As=el Cs
? A=? A= Ax – As= el (Cx–Cs)= el ? C
? 测定时先用比试样稍小的标准溶液, 加入各种试剂后
作参比, 调节仪器的透光度为 100％, 即吸光度为 0,然后
测量试样溶液的吸光度 。 这时的吸光度实际上是 两者之差
? A,它与两者浓度差 ? C成正比, 且处在正常的读数范围 。
(见图 )
2009-12-1 生物工程学院 86
? 由于用已知浓度的标准溶液作参比,
如果该参比溶液的透光度为 10％, 现调
至 100％, 就意味着将仪器透光度标尺扩
展了 10倍 。 如待测试样的透光度原是 7％,
用示差分光光度法测量时将是 70％ 。
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? ② 低浓度试样的测定
? 先用空白溶液调节仪器的透光度为 100％,
再用一个 浓度比试液稍高的标准溶液调节
透光度为 0％, 然后测量待测试液的透光度 。
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）
示差法 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100T（ %）
x
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?
?? 测定浓度适中的试样, 如果希望得到更加准确的读数, 则可选择两个组分相同, 浓度不同的溶液
作参比溶液, 试液浓度应介于此两种溶液的浓度之
间 。 调节仪器, 使 浓度大的参比溶液的透光度为 0％,
浓度小的参比溶液的透光度为 100％, 作工作曲线,
并测定试液的透光度, 见上图 。
③ 浓度适中的试样（高精密度）的测定
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? 二, 在农业和生物学研究中的应用
? 1,叶片色素提取液中叶绿素 a,b的含量测定
? 叶片色素的 85%丙酮提取液中叶绿素 a,b
的含量 （ mg/l） 可按 Arnon式计算：
? Ca=12.72A663-2.58A645
? Cb=22.87A645-4.67A663
? 该公式是依据叶绿素 a,b在 663,645nm的
吸光系数, 通过解二元联立方程得到 。 式中
A663, A645分别为提取液在 1cm样品池内, 对波
长 663,645nm光的吸光度 。
?
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? 2,在蛋白质定量分析中的应用,
? 除经典的凯式定氮法外, 很多蛋白质定量方法是利
用紫外可见光谱法, 常用的是以下几种：
? （ 1） 酚试剂法,其原理是根据酚试剂与蛋白质中的芳香
族氨基酸 （ 色氨酸, 酪氨酸 ） 产生显色反应, 反应液在
可见区的吸光度与蛋白质含量成正比 。 分析波长的选用
与样品浓度有关：低浓度时可用 750nm,高浓度时可用
500nm。
? （ 2） 双缩脲法,其原理是蛋白质分子中的肽健在碱性溶
液中能与二价铜离子形成兰色的络合物 。 分析波长可选
用 550nm。
? （ 3） 紫外吸收光谱测定蛋白质含量,其原理是蛋白质分
子中的色氨酸和酪氨酸在 280nm处有较强的吸收 。 此外还
可用样品在 215nm与 225nm吸光度之差来测定蛋白质含量 。
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? 3,氨基酸的吸收光谱测定
? 蛋白质水解产生氨基酸, 氨基酸中的游离氨基能
与水合茚三酮反应, 产生蓝紫色化合物, 其吸光度与
氨基酸含量成正比 。 可在 580nm处测定反应物的吸光
度, 确定样品中全氨基酸的含量 。
? 4,在测定 DNA中的应用
? DNA分子在紫外区有吸收, 纯的 DNA在 280,260，
230nm的吸光度之比大体上等于 0.515,1,0.450,因
此根据该吸光度比, 可以检查 DNA溶液的纯度 。
?
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三、有机化合物结构辅助解析
structure determination of organic compounds
可获得的结构信息
（ 1） 200-400nm无吸收峰 。 饱和化合物, 单烯 。
（ 2） 270-350 nm有吸收峰 （ ε=10-100） 醛酮 n→ π* 跃迁产生
的 R 带 。
（ 3） 250-300 nm 有中等强度的吸收峰 （ ε=200-2000）, 芳环
的特征 吸收 （ 具有精细解构的 B带 ） 。
（ 4） 200-250 nm有强吸收峰 （ ε?104）, 表明含有一个共轭
体系 （ K） 带 。 共轭二烯,K带 （ ?230 nm） ； ???? 不饱和醛
酮,K带 ?230 nm, R带 ?310-330 nm
260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰, 3,4,5个双键的共轭体系 。
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结束
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