课件 002 兽医微生物学教学课件 1






兽医微生物学
(多媒体教学课件 )
天津农学院动科系动物预防医学教研室制作
2003/02/28
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绪言 共六部分,介绍微生物与微生物学的概念,微生物学发展简史,微生
物学理论与技术成就及应用,兽医微生物学的地位、任务与贡献。
细菌总论 共七章,介绍细菌的形态、构造、生理,消毒与灭菌,细菌生态、
致病机理、遗传变异,细菌分类与命名等。
免疫基础 共七章,介绍抗原抗体,免疫系统,抗感染免疫,变态反应,免
疫调节,免疫技术及应用等。
细菌各论 共十二章,介绍各属重要病原细菌的形态、生化特性、致病性、
微生物学诊断和免疫防治等。
真菌 共二章,介绍真菌的分类、形态、生化及致病特性,真菌病的诊断与
防治等。
病毒 共十四章,介绍病毒的形态、构造、繁殖、遗传、培养,病毒的致病
性。各科属重要病毒形态、生化及致病特性,微生物学诊断和防治等。
实验 共十多个,显微镜油镜的使用,细菌形态及构造观察,细菌抹片制备
及染色,培养基的制备,细菌的分离培养、生长表现观察、生化试验、药
敏试验,沉淀反应和凝集反应,重要病原菌的认识,真菌与病毒培养测定
等 。




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第八章 抗原与抗体
第九章 免疫系统与免疫应答
第十章 抗感染免疫
第十一章 变态反应
第十二章 免疫调节与免疫遗传
第十三章 免疫血清学技术
第十四章 免疫学的应用
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第十二章 免疫调节与免疫遗传(自学)
第十三章 免疫血清学技术
第一节 概念
第二节 凝聚性反应
第三节 标记抗体技术
第四节 补体参与的试验
第五节 中和试验
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抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性
结合, 因抗体主要来自血清, 因此在体外进行的抗
原抗体反应称为 血清学反应 或 免疫血清学技术 。
第一节 概 述
免疫血清学技术按抗原抗体反应性质不同可分为,
1,凝聚性反应 包括凝集试验和沉淀试验 。
2,标记抗体技术 包括荧光抗体, 酶标抗体, 放射
性标记抗体, 发光标记抗体技术等 。
3,补体参与的反应 补体结合试验, 免疫黏附试验
等 。
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4,中和反应 病毒中和试验, 毒素中和试验 。
一、血清学反应的一般特点
1,特异性与交叉性 血清学反应具有高度特异性,如
抗猪瘟病毒的抗体只能与猪瘟病毒结合,而不能与
口蹄疫病毒结合。这是血清学试验用于分析各种抗
原和进行疾病诊断的基础。
但若两种天然抗原之间含有 部分共同抗原 时,则
发生 交叉反应 。交叉反应是区分血清型和亚型的重
要依据。
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2,抗原抗体结合机理 抗原和抗体的结合为 弱能非
共价键结合, 其结合力决定于抗原决定簇和抗体的
抗原结合点之间形成的非共价键的数量, 性质和距
离 。
常规的血清学反应,如凝集反应、沉淀反应、补
体结合反应等,只有在抗原与抗体呈 适当比例 时,
结合反应才出现凝集,沉淀等 可见反应,在最适比
例时,反应最明显。
这种因抗原过多或抗体过多而出现抑制可见反
应的现象,称为 带现象(图 13-1-166) 。
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二, 血清学反应的影响因素
1.电解质 特异性的抗原和抗体具有对应的极性基 (羧
基, 氨基等 ),它们互相吸附后, 其电荷和极性被中
和因而失去亲水性, 变为憎水系统 。
易 受电解质作用失去电荷 而互相凝聚, 发生凝集或
沉淀反应 。
2.温度 较高的温度可以增加抗原和抗体接触的机会,
从而加速反应的出现 。 常用 37℃ 水浴保温 。
3.酸碱度 血清学反应常用 pH为 6-8,过高或过低的
pH可使抗原抗体复合物重新离解 。
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第二节 凝聚性试验
抗原与相应抗体结合形成复合物, 在有电解质存
在下, 复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝聚小块或
沉淀物, 根据此现象来测定相应抗体或抗原, 称为
凝聚性试验 。 分为 凝集试验和沉淀试验 。
一, 凝集试验
细菌, 红细胞等颗粒性抗原, 与相应抗体结合,
在有适当电解质存在下, 形成肉眼可见的凝集团块,
称为 凝集试验 。 参与的抗体主要为 IgG,IgM。 凝
集试验可用于检测抗原或抗体, 优点是操作简便 。
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根据抗原的性质分为 直接凝集试验 和 间接凝集试验 。
1.直接凝集试验 颗粒性抗原与凝集素直接结合并出现
凝集现象的试验称作直接凝集试验。按操作方法可分
玻片法 和 试管法 两种。
( 1)玻片法 为一种 定性试验 。将含有已知抗体的诊
断血清与待检抗原悬液在玻片上混合,数分钟后,如
出现颗粒状或絮状凝集,即为阳性反应。
此法简便快速,适用于新分细菌的鉴定或分型。如
沙门氏菌的鉴定。也可用已知的诊断抗原,检测待检
血清中的相应抗体,如布氏杆菌、鸡白痢全血平板凝
集试验。
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( 2)试管法 为一种 定量试验,用以检测血清抗体
含量。
将待检血清用生理盐水作倍比稀释,然后加入等
量抗原,置 37℃ 水浴数小时观察。视不同凝集程度
记录为 ++++(100%凝集 ),+++(75%凝集 ),++(50
%凝集 ),+(25%凝集 )和 -(不凝集 )。以其 ++以上的
血清最大稀释度为该血清的凝集价 (或称滴度 )。
试验时必须设置 阳性血清, 阴性血清和生理盐水
等对照 。
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2.间接凝集试验 将可溶性抗原 (或抗体 ) 吸附不溶性
颗粒载体的表面, 与相应抗体 (或抗原 )作用, 在电解
质存在条件下, 出现的特异性的凝集反应称为 间接
凝集反应 。
优点 敏感性高, 比直接凝集反应敏感 2-8倍 。
常用载体 红细胞 (绵羊红细胞 ),胶乳颗粒等 。 当
载体吸附了可溶性抗原后即称为 致敏颗粒 。
间接血凝试验 是将 可溶性抗原 致敏于红细胞表面,
用以检测相应抗体 。
反向间接血凝试验 如将 抗体 致敏于红细胞表面,
用以检测检样中相应抗原 。
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3.乳胶凝集试验 (LAT) 用它胶乳微球 ( 直径约
0.8um) 作载体吸附某些抗原 (或抗体 ),可用以检
测相应的抗体 (或抗原 )。
优点 快速简便, 易保存, 较准确等 。
4.协同凝集试验 (COAG) 葡萄球菌 A蛋白 (SPA) 能
与多种动物 IgG分子的 Fc片结合, 结合后保持其
抗体活性, 当与相应的抗原结合时, 就可产生凝
集反应 。 本法广泛应用于多种细菌和某些病毒的
快速诊断 。
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二、沉淀试验
可溶性抗原与相应抗体结合,在电解质存在下,形
成肉眼可见的白色沉淀,称为 沉淀试验 。
参与沉淀试验的抗原称 沉淀原,抗体称为 沉淀素。
抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等,抗原分子较小,如细菌的
外毒素、内毒素、菌体裂解液,病毒的可溶性抗原、血清、组
织浸出液等。
1.环状沉淀试验 在小口径试管内 先加入已知抗血清,
然后小心沿管壁加入 待检抗原 于血清表面, 使之成为
分界清晰的两层 。 数分钟后, 两层液面交界处出现白
色环状沉淀, 即为阳性反应 。
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用途 用于抗原的定性试验,如诊断炭疽的 Ascoli试
验、链球菌血清型鉴定、沉淀素的效价滴定等。试
验时出现白色沉淀带的最高血清稀释倍数,即为血
清的沉淀价。
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2.琼脂(免疫)扩散试验 琼脂凝胶呈多孔结构,孔
内充满水分,1%琼脂凝胶的孔径约为 85nm,各种
抗原抗体在琼脂凝胶中自由扩散。抗原抗体在琼脂
凝胶中扩散,当二者在比例适当处相遇,即发生沉
淀反应,形成肉眼可见的 沉淀带,称为琼脂免疫扩
散,又简称 琼脂扩散 和 免疫扩散 。双向双扩散最常
用。
双向双扩散 双向双扩散试验,简称双扩散。即用
1%琼脂浇成厚 2-3mm的凝胶板,在其上打圆孔,于
相邻孔内滴加抗原和抗体,在饱和湿度下,扩散 24h
或数日,观察沉淀带。
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抗原抗体在琼脂凝胶内相向扩散,在两孔之间比
例最合适的位置上出现 沉淀带 。
双向扩散主要 用于抗原和抗体的测定。 用 8%
Nacl溶液制 1%琼脂糖平板,打孔( 7孔梅花形、孔
径 6 mm周边与中心孔距 3 mm)。
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1.双扩散用于疾病诊断,
以 IBD诊断为例,中心孔
加 IBD标准阳性血清,周
围孔分别加 IBD标准抗原、
生理盐水、待检抗原
1.2.3.4。
2.双扩散用于抗体检测,
以免疫鸡 IBD抗体检测为
例,中心孔加 IBD标准抗
原,周围孔分别加 IBD标
准阳性血清,,IBD阴性血
清、待检血清 1.2.3.4。
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3.对流免疫电泳
原理 抗原 在碱性溶液 (>pH8,2)中 带负电荷,
在电场中 向正极移动, 而抗体球蛋白带电荷弱,
在琼脂电泳时, 由于电渗作用, 向相反的负极泳
动 。 将抗体置正极端, 抗原置负极端, 电泳时抗
原抗体相向泳动, 在两孔之间形成沉淀带 。
琼脂凝胶制备 选用优质琼脂 ( 或琼脂糖 ), 浓
度为 1% -2%, pH通常用 pH8.2-8.6的巴比妥缓冲
液, 离子强度为 0.025-0.075mol/ L,并加 0.01%
硫柳汞作防腐剂 。
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极 - +极
Ab Ag
Ab
Ab
Ag
Ag
试验操作 制备琼脂凝胶玻板, 打孔, 挑去孔内琼脂
后, 将 抗原置负极一侧孔内, 抗血清置正极侧孔 。 加
样后电泳 30-90min观察结果 。
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试验操作 制备琼脂凝胶玻板, 打孔, 挑去孔内琼
脂后, 将 抗原置负极一侧孔内, 抗血清置正极侧孔 。
加样后电泳 30-90min观察结果 。
本法优点
a.敏感 较双扩散敏感 10-16倍;
b.快速 仅需 1h左右,大大缩短了沉淀带出现的时间。
c.用途 适用快速诊断检测。如乙型肝炎抗原的快速
检测,猪传染性水泡病和口蹄疫等的快速确诊,
IBD,MD的快速检测等。
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第三 节 标记 抗体技 术
抗体, 抗原分子小, 在含量低时形成的抗原抗体复
合物是不可见的 。 有一些物质即使在超微量时也能通
过特殊的方法将其检查出来, 如果将这些物质标记在
抗体分子上, 可以通过检测标记分子来显示抗原抗体
复合物的存在, 此种根据 抗原抗体结合的特异性 和 标
记分子的敏感性 建立的技术, 称为标记抗体技
术 。,
高敏感性的标记分子主要有 荧光素, 酶分子, 放射
性同位素 三种, 由此建立 荧光抗体技术, 酶标抗体技
术 和 同位素标记抗体技术 。
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其特异性和敏感性远远超过常规血清学方法,被
广泛应用于病原微生物鉴定、传染病的诊断、分子
生物学中的基因表达产物分析等。
第四节 补体结合试验
补体结合试验是应用可溶性抗原, 与相抗体结合
后, 其抗原抗体复合物可以结合补体, 但这一反应
肉眼不能察觉, 如再加入致敏红细胞 (溶血系 ),可根
据是否出现溶血反应判定反应系统中是否存在相应
的抗原和抗体 。 参与补体结合反应的抗体称为 补体
结抗体 。 补体结合抗体主要为 IgG和 IgM。 通常是利
用已知抗原检测未知抗体 。
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第五节 中和试验
根据 抗体能否中和病毒的感染性 而建立的免疫学试
验称为中和试验。中和试验极为特异和敏感,主要用
于病毒感染的血清学诊断,病毒分离株的鉴定、不同
病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫
血清的质量评价和测定动物血清抗体的检测等。
中和试验的基本过程 先将 抗血清与病毒混合,经
适当时间 作用 。然后 接种于宿主系统 以检测混合液中
的病毒 感染力 。宿主系统可以是鸡胚、动物或细胞培
养等,目前大多采用细胞中和试验。
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根据其产生的保护效果的差异,可判断该病毒是否
已被中和,并根据一定方法计算中和的程度 (中和指
数 ),即代表中和抗体的效价。
种类 根据测定中方法的不同, 中和试验主要有两种 。
一是测定能使动物或细胞死亡数目减少至 50% (半数保
护率, PD50)血清稀释度, 即终点法中和试验 。 二是
测定使病毒在细胞上形成的空斑数目减少至 50% 时血
清稀释度, 即空斑减少法中和试验 。
毒素和抗毒素 亦可进行中和试验,其方法与病毒中
和试验基本相同。
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