第六章 食品中蛋白质的测定
【教学目标】：
1.掌握蛋白质、蛋白质消化的概念和知识；
2.了解蛋白质测定的原理、方法，熟练地掌握常量凯氏定氮法，掌握样品消化、蒸馏、吸收的操作技能。
蛋白质是生命的物质基础，是构成人体及动植物细胞组织的重要成发之一，蛋白质在体内有构成新生组织、修补组织及制造体内氧化还原所必需的酶和激素等生命基础物质的用途及作用。食品中蛋白质含量的多少，不仅表示食品的质量，而且也关系着人体的健康。因此，其蛋白质的含量有一定的规定。
一、标准方法（GB5009.5—85）
（一）半微量凯氏定氮法
1原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
2试剂
所有度剂均用不含氨的蒸馏水配制。
（1）硫酸铜（CuSO4?5H2O）；
（2）硫酸钾；
（3）硫酸；
（4）硼酸溶液（20g/L）；
（5）混合指示液：1份（1g/L）甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份（1g/L）甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液，临用时混合。
（6）氢氧化钠溶液（400g/L）;
(7)标准滴定溶液：硫酸标准溶液[c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L]或盐酸标准溶液[c(HCI)=0.0500moL/L]。
3仪器
定氮蒸馏装置如图3-5所示。1-电炉；2-水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3-螺旋夹；4-小玻杯及棒状玻塞；5-反应室；6-反应室外层；7-橡皮管及螺旋夹；8-冷凝管；9-蒸馏液接收瓶
4操作方法
(1)样品处理：精密称取0.02-2.00g固体样品或2.00-5.00g半固体样品或吸取10.00-20.00mL液体样品（约相当于氮30-40mg），移入干燥的100mL或500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°斜于于小孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部碳化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。取下放冷，小心加20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。
(2)按图3-5装好定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至约三分之二处，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
(3)向接收瓶内加入10mL 20g/L硼酸溶液及混合指示剂1-2滴，并使冷凝管下端插入液面下，吸取10.0mL样品消化稀释液，由小漏斗流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻杯的棒状玻塞，将10mL 400g/L氢氧化钠溶液倒入小玻杯，提起玻塞，使其缓慢流入反应室，立即将玻塞盖紧，并加水于小烧杯中，以防漏气，夹紧螺旋夹7，开始蒸馏，蒸气通入反应室，使氨通过冷凝管而入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准溶液（0.05moL/L）滴定至灰色或蓝紫色为终点。同时准确吸取10mL试剂空白消化液按（3）操作。
5计算
……………………………（3-9）
式中：X---样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL);
V1---样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL;
V2---试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL;
c---硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L;
0.014---1.00mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液中相当的氮的质量，g;
m---样品的质量(或体积)，g或mL;
F---氮换算为蛋白质的系数。一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；玉米、高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；大麦、小米、蒸麦、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵为5.30。
6说明
凯氏定氮法测定氮的含量，依据蛋白质中含氮的多少，换算为蛋白质的含量。
消化过程中，加入硫酸钾可以提高反应温度，加入硫酸铜作为催化剂，提高反应速度。
蒸馏过程中，不能使系统漏气，放入碱液时，应小心、缓慢。
食品中含氮量一般为15％-17.6％，根据不同食品含氮量略有差异，采用不同的换算系数。以上换算系数是食品中含氮量为16％的氮换算为蛋白质的系数。
食品中还有非蛋白质物质含氮，故用此法测定蛋白质称为粗蛋白。
蒸馏时，蒸汽发生要充足，均匀，加碱要够量，动作要快，防止氨损失。冷凝管出口应浸入吸收液中，防止氨损失。
我国规定含乳饮料中蛋白质?1.0％。
二、参考方法
（一）全量凯氏定氮法
1原理
蛋白质为含氮有机物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再以硫酸或盐酸的标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
2试剂
所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
（1）硫酸铜；
（2）硫酸钾；
（3）硫酸；
（4）混合指示液：1份1g/L甲基红乙醇溶液与5份1g/L溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合，也可用2份1g/L甲基红乙醇溶液与1份1g/L次甲基蓝乙醇溶液。临用时混合。
（5）氢氧化钠溶液（400g/L）;
（6）硼酸溶液（20g/L）；
（7）标准滴定溶液：硫酸标准溶液[ c(1/2H2SO4)=0.0500moL/L]或盐酸标准溶液[c(HCI)=0.0500moL/L]
3仪器
凯氏定氮装置如图3-6所示。
1-500mL定氮瓶；2-定氮蒸馏球；3-节流夹；4-漏斗；5-冷凝管；6-接收瓶
4操作方法
（1）精密称取0.20—2.00g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20mL液体样品(相当于氮30-40mg)，小心移入已干燥的500mL定氮瓶中，加入0.5g硫酸铜，10g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后，于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°斜支于有小圆孔的石棉网上，小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体沸腾（微沸）。至液体呈蓝色澄清透明后，再继续加热0.5h，放冷，小心加入200mL水，再放冷，连接已准备好的蒸馏装置上，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面下，接收瓶内盛有（20g/L），硼酸溶液50mL及2-3滴混合指示液。
（2）放松节流夹，通过漏斗倒入70-80mL（400g/L）氢氧化钠溶液，并振摇定氮瓶，至内容物转为深蓝色或产生褐色沉淀，再倒入100mL水，夹紧节流夹，加热蒸馏，至氨被完全蒸出。停止加热前，先将接收瓶放下少许，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏1min，然后停止加热，并用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶。
（3）以硫酸或盐酸标准溶液（0.0500moL/L）滴定至灰色为终点。同时做试剂空白试验。
5计算
………………（3-10）
式中X---样品中蛋白质的含量，g/100g(g/100mL);
V1---样品消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL;
V2---试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL;
c---硫酸或盐酸标准溶液的浓度，moL/L;
0.014---1.00mL硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000moL/L]或盐酸[c(HCI)=1.000moL/L]标准溶液中相当的氮的质量，g;
m---样品的质量(或体积)，g或mL;
F---氮换算为蛋白质的系数。
6说明
本法为直接蒸馏法，蒸馏终点的确定对测定样品含量的准确程度影响很大，一般样品馏出液超过250mL，氮可完全蒸出，注意蒸馏时勿烧干。
