实验四 体积排除色谱（SEC）法测定聚合物的 分子量及分子量分布 分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能与其分子量和分子量分布密切相关。体积排除色谱（size exclusion chromatography，SEC）是液相色谱的一个分支，已成为测定聚合物分子量分布和结构的最有效手段。其还可测定聚合物的支化度，共聚物及共混物的组成。采用制备型的色谱仪，可将聚合物按分子量的大小分级，制备窄分布试样，供进一步分析和测定其结构。该方法的优点是：快捷、简便、重视性好、进样量少、自动化程度高。 体积排除色谱在一段时期内常称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography，GFC）、凝胶色谱。从分离机理看，使用体积排除色谱较为确切。 一、实验目的： 1．了解SEC法测定高聚物分子量及分子量分布的原理； 2．掌握Waters—510型仪器的操作技术； 3．掌握SEC数据处理方法。 二、基本原理： 体积排除色谱（SEC）分离机理认为在多孔载体（其孔径大小有一定的分布，并与待分离的聚合物分子尺寸可比拟的凝胶或多孔微球）充填的色谱柱里引入聚合物溶液，用溶剂淋洗，体系是处于扩散平衡的状态。聚合物分子在柱内流动过程中，不同大小的分子向载体孔洞渗透的程度不同，大分子能渗透进去的孔洞数目比小分子少，有些孔洞即使大小分子都能渗透进去，但大分子能渗透的深度浅。溶质分子的体积越小渗透进去的几率越大，随着溶剂流动，它在柱中保留的时间越长。如果分子的尺寸超过载体孔的尺寸时，则完全不能渗透进孔里，只能随着溶剂从载体的粒间空隙中流过，最先淋出。当具有一定分子量分布的高聚物溶液从柱中通过时，较小的分子在柱中保留的时间比大分子保留的时间要长，于是整个样品即按分子尺寸由大到小的顺序依次流出。 色谱柱总体积为Vt，载体骨架体积为Vg，载体中孔洞总体积为Vi，载体粒间体积为V0，则 Vt＝Vg＋V0＋Vi V0和Vi之和构成柱内的空间。溶剂分子体积远小于孔的尺寸，在柱内的整个空间（V0＋Vi）活动；高分子的体积若比孔的尺寸大，载体中任何孔均不能进入，只能在载体粒间流过，其淋出体积是V0；高分子的体积若足够小，如同溶剂分子尺寸，所有的载体孔均可以进出，其淋出体积为（V0＋Vi）；高分子的体积是中等大小的尺寸，它只能在载体孔Vi的一部分孔中进出，其淋出体积Ve为 Ve＝V0＋KVi K为分配系数，其数值0≤K≤l，与聚合物分子尺寸大小和在填料孔内、外的浓度比有关。当聚合物分子完全排除时，K＝0；在完全渗透时，K＝1（见图4-1）。当K＝0时，Ve＝V0；，此处所对应的聚合物分子量是该色谱柱的渗透极限（PL），商品SEC仪器的PL常用聚苯乙烯的分子量表示。聚合物分子量超过PL值时，只能在V0以前被淋洗出来，没有分离效果。 V0和Vg对分离作用没有贡献，应设法减小；Vi是分离的基础，其值越大柱子分离效果越好。制备孔容大，能承受压力，粒度小，又分布均匀，外形规则（球形）的多孔载体，让其尽可能紧密装填以提高分离能力。柱效的高低，常采用理论塔板数N和分离度R来作定性的描述。测定N的方法可以用小分子物质作出色谱图，从图上求得流出体积Ve和峰宽W，以下式计算N值：N＝（4Ve／W）2，N值越大，意味着柱子的效率越高。“l”、“2”代表分子量不同的两种标准样品，Ve,1、Ve,2、W1，W2为其淋出体积和峰宽，分离度R的计算为，若R≥1，则完全分离。  上面阐述的SEC分离机理只有在流速很低，溶剂粘度很小，没有吸附，扩散处于平衡的特殊条件下成立，否则会得出不合理的结果。 实验测定聚合物SEC谱图，所得各个级份的分子量测定，有直接法和间接法。直接法是指SEC仪和粘度计或光散射仪联用；而最常用的间接法则用一系列分子量已知的单分散的（分子量比较均一）标准样品，求得其各自的淋出体积Ve，作出logM对Ve校正曲线（图4-1）。 logM＝A－BVe -----------------------------------------（1） 当logM＞logMa时，曲线与纵轴平行，表明此时的流出体积（V0）和样品的分子是无关，V0即为柱中填料的粒间体积，Ma就是这种填料的渗透极限。当logM＜logMa时，Ve对M的依赖变得非常迟钝，没有实用价值。在logMa和logMd点之间为一直线，即式（1）表达的校正曲线。式中A、B为常数，与仪器参数、填料和实验温度、流速、溶剂等操作条件有关，B是曲线斜率，是柱子性能的重要参数，B数值越小，柱子的分辨率越高。 上述订定的校准曲线只能用于与标准物质化学结构相同的高聚物，若待分析样品的结构不同于标准物质，需用普适校准线。SEC法是按分子尺寸大小分离的，即淋出体积与分子线团体积有关，利用Flory的粘度公式：   R为分子线团等效球体半径。[η]M是体积量纲，称为流体力学体积。众多的实验中得出[η]M的对数与Ve有线性关系。这种关系对绝大多数的高聚物具有普适性。普适校准曲线为  --------------------------------- （2） 因为在相同的淋洗体积时，有 [η]1M1＝[η]2M2 ------------------------------------- （3） 式中下标1和2分别代表标样和试样。它们的Mark－Houwink方程分别为   因此可得  ------------------------------ （4） 或  ------------------- （5） 将（5）式代入，即得待测试样的标准曲线方程  K1、K2、α1、α2可以从手册查到，从而由第一种聚合物的M-Ve校正曲线，换算成第二种聚合物的M-Ve曲线，即从聚苯乙稀标样作出的M-Ve校正曲线，可以换算成各种聚合物的校正曲线。 三、仪器与样品 Waters―510液相色谱仪、聚苯乙烯样品、四氢呋喃溶剂。 四、实验步骤 1．流动相的准备：重蒸四氢呋喃，经5＃砂芯漏斗过滤后备用。 2．溶液配制：分别配制5ml的聚苯乙烯标样及待测样品的溶液（浓度为0.05-0.3％），溶解后，经5＃砂芯漏斗过滤备用。 Waters-500型液相色谱仪的启动： （1）将经过脱气的四氢呋喃倒人色谱仪的溶剂瓶，色谱仪出口接上回收瓶。 （2）打开泵（Waters-510），从小到大调节流量，最后流速稳定在1.0ml/min。 （3）打开示差折光检测器（Waters-410）,同时按下示差检测器面板上的“2ND FUNC”和“PURGE”键，使淋洗液回流通过参比池；进样前再按下“CLEAR”键，使流路切换回原位。 （4）打开计算机，联机记录。 4．进样：待记录的基线稳定后，将进样器把手扳到“LOAD”位（动作要迅速），用进样注射器吸取样品50μl，并注入进样器（注意排除气泡）。这时将进样器把手扳到“INJECT”位（动作要迅速），即进样完成，同时应作进样记录。一样品测试完成（不再出峰时），可按前面步骤再进其他样品。 试验结束，应清洗进样器，再依次关机。 五 记录及数据处理 1．GPC谱图的归一化处理 如果仪器和测试条件不变，那么实验得到的谱图可作为试样之间分子量分布的一种直观比较。一般地，应将原始谱图进行“归一化”后再比较。所谓“归一化”，就是把原始谱图的纵坐标转换为重量分数，以便于比较不同的实验结果和简化计算。具体作法：确定色谱图的基线后，把色谱峰下的淋出体积等分为20个计算点。记下这些计算点处的总坐标高度Hi（它正比于被测试样的重量浓度）。把所有的Hi加和后得到ΣHi（它正比于被测试样的总浓度）。那么，Hi/ΣHi就等于各计算点处的组分点总试样的重量分数，以Hi/ΣH对Ve（或logM）作图就得归一化的GPC图。 2．计算、、及分散度d 令Wi＝Hi/ΣHi 按定义有：；；； 计算所需的Mi值可由校正曲线上查得。 思考题： 1．色谱柱是如何将高聚物分级的？影响柱效的因素有哪些？ 2．本实验中校准曲线的线性关系，在色谱柱重装，或换了柱时能否再使用？ 3．SEC法的溶剂选择有什么要求？ 4．同样分子量样品支化的和线性的分子那个先流出色谱柱？ 参考文献： [1] 施良和编，凝胶色谱法，北京，科学出版社，1980 [2] 虞志光编，高聚物分子量及其分布的测定，上海，上海科技出版社，1984