第三章 蛋白质
第一节 概述
第二节 氨基酸
第三节 蛋白质的一级结构
第四节 蛋白质的空间结构与功能
第五节 蛋白质的重要理化性质
第六节 蛋白质相对分子量的测定
本本本 课课课 件件件 由由由 西西西 华华华 大大大 学学学 生生生 物物物 工工工 程程程 学学学 院院院 车车车 振振振 明明明 制制制 作作作
第一节 概述
一,蛋白质的概念
二,蛋白质的研究简史
三,蛋白质的化学组成
四,蛋白质的分类
五,蛋白质的分布
六,蛋白质的生物学功能
蛋白质的概念,蛋白质是一切生物体
中普遍存在的,由天然氨基酸通过
肽键连接而成的生物大分子 ；其种
类繁多，各具有 —定的相对分子质
量、复杂的分子结构和特定的生物
功能，是表达生物遗传性状的一类
主要物质。
?1838年 Muller研究了血清、蛋清、
蚕丝等物质的元素组成后,发现它们
均可以用 C40H62N10O12 来表示,命名
为, Protein”,并发展成, 基团, 学
说 。
?19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了 13种氨基酸,基团学说销声匿迹。
?1902年 Fischer,Hofmeister同时
提出肽键理论 。
?1924年 Svedberg 发明超离心机 。
?1930年代 Bergmann合成出只含 L型
氨基酸的多肽。
?1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位,α -螺旋和 β -折叠 。
?1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构 。
?1958年 Perutz & Kendrew用 X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构
6 年 Anfinsen证明蛋白质的一级
结构决定其立体结构。
?1980年代 蛋白质工程的兴起。
1 97年 提出蛋白组学研究的概念。
?1999年 蛋白质芯片技术出现。
对蛋白质化学有突出贡献的 Nobel奖
获得者,
?1902年 H.E.Fischer (德，化 ) 肽键理
论，多肽合成。
?1910年 A.Kossel (德，医 ) 组氨酸、
组蛋白的发现，碱基的发现。
?1915年 W.H.Bragg/W.L.Bragg (德，
物 ) 用 X射线测定晶体物质结构。
?1926年 T.Svedberg (瑞，化 ) 用超离
心手段决定蛋白质的分子量。
?1946年 J.B.Summer (美，化 ) 蛋白质
酶的结晶，证明酶的本质为 Pr。
?1948年 A.W.K.Tiselius (瑞, 化 ) 电泳
装臵的开发, 血清蛋白的研究 。
?1952年 A.J.P.Martin/R.L.M.Synge (英,
化 )分配层析发明, 氨基酸的分离 。
?1954年 L.Pauling (美, 化 ) 蛋白质二
级结构, 抗原抗体反应理论 。
?1958年 F.Sanger (英, 化 ) 胰岛素一级
结构的测定 。
?1962年 M.F.Perutz/J.C.Kendrew (英，
化 ) X射线确定蛋白质的立体结构 。
?1972年 G.M.Edelman/R.R.Porter (美，
医 )抗体的化学构造与功能的解明。
?1972年 W.H.Stein/S.More (美，化 )
RNase的一级结构和活性中心的解明。
?1972年 C.B.Anfinsen (美，化 ) 蛋白
质的一级结构决定其立体结构。
?1998年 S.B.Prusiner (美，医 ) Prion:蛋
白立体机构的变化导致疾病 。
蛋白质的化学组成
蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有
碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某
些蛋白质还含有其他一些元素，主要是
磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素
在蛋白质中的组成百分比约为,
碳 50％
氢 7％
氧 23％
氮 16%
硫 0—3％
其他 微 量
N的含量平均为 16%——凯氏（ Kjadehl）
定氮法 的理论基础。
蛋白质含量的测定,凯氏定氮法
(测定氮的经典方法 )
优点：对原料无选择性，仪器简单,
方法也简单；
缺点：易将无机氮 (如核酸中的氮 )
都归入蛋白质中,不精确。
一般，样品含氮量平均在 16%，取其倒
数 100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其
含义是样品中每存在 1g元素氮，就说明含有
6.25g 蛋白质）；故,※ 蛋白质含量 =氮
的量× 100/16× 6.25
蛋白质的分类
1.按照分子组成分类
单纯蛋白质,水解产物只有氨基酸。
结合蛋白质,水解产物中除了氨基
酸外，还有金属离子和其它物质（辅
基）。结合蛋白根据其辅基的不同有
好多种。
一种单纯蛋白质只能与特定的一种
或几种辅基结合。
2.按照分子形状分类
球状蛋白,分子近似球形或卵圆形，
易溶解，能结晶。
纤维状蛋白,分子纤维状，不对称。
大多数不溶于水。
3.按照生物功能分类
活性蛋白质,参与代谢反应的蛋白
质。
非活性蛋白质,对生物体起保护和
支持作用的蛋白质。
活性蛋白质分类
1,酶类（ 占细胞内蛋白质种类的绝大部分） ;
2,运输蛋白 ;
3,收缩运动蛋白 ;
4,激素蛋白 ;
5,细胞激动素 ;
6,受体蛋白 ;
7,毒素蛋白 ;
8,营养贮藏蛋白 ;
9,防御蛋白等。
蛋白质占干重 人体中（中年人）
人体 45% 水 55%
细菌 50%~80% 蛋白质 19%
真菌 14%~52% 脂肪 19%
酵母菌 14%~50% 糖类＜ 1%
白地菌 50% 无机盐 7%
植物：主要在种子中含量较高。
蛋白质的分布 人体各组织器官中蛋白质含量 （蛋白质 g / 100g干组织）
器官或组织 蛋白质含量 器官或组织 蛋白质含量
体液 85 心 60
脾 84 肝 57
肺 82 胰 47
横纹肌 80 脑神经 45
肾 72 骨骼 28
消化道 63 脂肪组织 14
我国一些谷物主要成分含量
粮食种类 蛋白质 /％ 脂肪 /％ 糖类 /％
大豆 36.3 17.5 26
豌豆 22.78 1.35 54.7
绿豆 22.25 1.08 56.02
花生仁 26.20 39.2 22.0
油菜籽 26.34 40.35 17.59
大米 6.55 1.05 77.50
小麦 9.42 1.47 68.74
玉米 5.22 6.13 72.4
蛋白质的生物学功能
1.生物体的组成成分
2,催化
3,运输
4,运动
5,抗体
6,干扰素
7,遗传信息的控制
8,细胞膜的通透性
9,高等动物的记忆、识别机构
酶蛋白
结构蛋白
免疫球蛋白
第二节 氨基酸
一,氨基酸的结构特点
二,20种基本氨基酸的分类
三,氨基酸的重要理化性质
四,氨基酸的分离制备和分析鉴定
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氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。 氨
基酸是具有氨基（ -NH3+） 或亚氨基
和羧基（ -COOH） 的有机分子。氨基
酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密
码的氨基酸只有 20种，其通式为,
不带电形式
H2N— C— H
COOH
R
+H3N— C— H
COO-
R
两性离子形式
氨基酸的结构特点,
(1),与羧基相邻的 α -碳原子上都有一
个氨基，因而称为 α -氨基酸
(2),除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子
中的 α -碳原子都为不对称碳原子,所
以,A.氨基酸都具有旋光性。 B.每一
种氨基酸都具有 D-型和 L-型两种立体
异构体。目前已知的天然蛋白质中氨
基酸都为 L-型。
注意,
氨基酸的构型是以距羧基最近的手性
C原子为标准（ 除 Gly外 ），而糖的构
型是以距羧基最远的手性 C原子为标
准。
氨基酸的分类
中性 AA
（ 1） 按 R基团的酸碱性分 酸性 AA
碱性 AA
（ 2） 按 R基团的 疏水性 R基团 AA
电性质分 不带电荷极性 R基团的 AA
带电荷 R基团的 AA
脂肪族 A
（ 3） 按 R基团的化学结构分 芳香族 AA
杂环族 AA
+
H
3
N
C O O
-
H
+
H
2
N
C O O
-
H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
3
+
H
3
N
C O O
-
H
C H ( C H
3
)
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H ( C H
3
)
C H ( C H
3
)
2
C H
2
C H
3
G l y c i n e ( G l y ) A l a n i n e ( A l a ) V a l i n e ( V a l )
L e u c i n e ( L e u ) I s o l e u c i n e ( I l e ) P r o l i n e ( P r o )
甘 氨 酸 丙 氨 酸 缬 氨 酸
亮 氨 酸 异 亮 氨 酸 脯 氨 酸
1, N o n p o l a r,a l i p h a l i c R g r o u p s ( 6 )
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
P h e n y l a l a n i n e ( P h e ) T y r o s i n e ( T y r ) T r y p t o p h a n ( T r y )
苯 丙 氨 酸 酪 氨 酸 色 氨 酸
2, A r o m a t i c R g r o u p s ( 3 )
N
H
O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
S H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
S C H
3
C O N H
2
S e r i n e ( S e r ) T h r e o n i n e ( T h r ) C y s t e i n e ( C y s )
M e t h i o n i n e ( M e t ) A s p a r a g i n e ( A s n ) G l u t a m i n e ( G l n )
丝 氨 酸 苏 氨 酸 半 胱 氨 酸
甲 硫 氨 酸 （ 蛋 氨 酸 ） 门 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺
3, P o l a r,u n c h a r g e d R g r o u p s ( 6 )
C H
3
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C O N H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C O O
-
A s p a r t a t e ( A s p ) G l u t a m a t e ( G l u )
门 冬 氨 酸 谷 氨 酸
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C O O
-
4, N e g a t i v e l y c h a r g e d R g r o u p s ( 2 )+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
L y s i n e ( L y s ) A r g i n i n e ( A r g )
赖 氨 酸 精 氨 酸
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C H
2
5, P o s i t i v e l y c h a r g e d R g r o u p s ( 3 )
C H
2
C H
2
N H
3
+
N H
C
N H
2
N H
2
+
+
H
3
N
C O O
-
H
H
2
C
H N
N H
g u a n i d i n o
i m i d a z o l e
H i s t i d i n e
组 氨 酸
人体必需氨基酸有八种,
Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr
―假 设 来 写 一 两 本 书,
(一 )氨基酸的一般物理性质
常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构
型而异
(1)溶解性,各种氨基酸在水中的溶解
度差别很大，并能溶解于稀酸或稀
碱中，但不能溶解于有机溶剂。通
常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀
析出。
(2) 熔点,氨基酸的熔点极高，一般在
200℃ 以上。
(3) 味感,其味随不同氨基酸有所不同，有
的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的
单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。
(4)旋光性,除甘氨酸外，氨基酸都具有旋
光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，
左旋者通常用（ -）表示，右旋者用（ +）
表示。
(5)光吸收,构成蛋白质的 20种氨基酸
在可见光区都没有光吸收，但在远
紫外区 (<220nm)均有光吸收。在近
紫外区 (220-300nm)只有酪氨酸、苯
丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。
Tyr,Trp,Phe在近紫外光区的最大
吸收峰（ λ max） 和摩尔消光系数 ε
?酪氨酸的 ?max
＝ 275nm，
?275=1.4x103 ;
?苯丙氨酸的
?max＝ 257nm，
?257=2.0x102;
?色氨酸的 ?max
＝ 280nm，
?280=5.6x103;
氨基酸在结晶形态或在水溶液中，
并不是以游离的羧基或氨基形式存在，
而是离解成两性离子。在两性离子中，
氨基是以质子化 (-NH3+)形式存在，羧
基是以离解状态 (-COO-)存在。
在不同的 pH条件下，两性离子的
状态也随之发生变化。
（二）氨基酸的离解性质
R C C O O H
N H 3 +
H
I I
1
OH-
H+
K1
R C C O O -
N H 3 +
H
I
1 1+
O H -
H +
K 2
R C C O O -
N H 2
H
I I I
1
L o w p H H i g h p H
如果在某一 pH 值下, 氨基酸所带正电荷的数
目与负电荷的数目正好相等, 即 净电荷为零,
则称该 pH 值为该氨基酸的 等电点 (pI)。
各种氨基酸都有其特定的等电点。
中性氨基酸的 pI在微酸性；碱性氨基
酸的 pI在碱性 pH范围；酸性氨基酸
的 pI在酸性 pH范围。
氨基酸在等电点时溶解度最小，
易发生沉淀。工业上利用这一性质提
取氨基酸。
pH < pI,样品带 正电荷,样品点向 阴 极移动
pH > pI,样品带 负电荷,样品点向 阳 极移动
pH = pI,样品 不带电荷,样品点 不移动
氨基酸等电点的确定
（ 1） 中性氨基酸
等电点（ pI） 的高低与氨基酸分子两性解
离基团的解离平衡常数有一定关系。用 K’1、
K’2分别表示 α -COOH和 α -NH3+表观解离
平衡常数时，它们的负对数分别用 pK’1、
pK’2表示，则中性氨基酸的等电点在数值
上等于两个 pK’值之和的二分之一。即,
pI = (pK1 + pK2) / 2
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2.酸、碱性氨基酸
在溶液中氨基酸随 pH升高而逐级解
离时，总是 pK＇ 值小的基团先解离，
pK＇ 值大者后解离。因此，对于具有
三个解离基团的氨基酸，只有靠近等
电离子的两个 pK＇ 值影响等电离子的
浓度。所以，只要正确写出解离反应
式，皆可根据等电离子两边的 pK＇ 计
算其 pI值。
酸性氨基酸,
pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2
硷性氨基酸,
pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2
（三）氨基酸的重要化学反应
1.与亚硝酸反应
反应特点,
?（ 1）脯氨酸不发生该反应；
?（ 2）只有 α –氨基氮可发生此
反应,R上的氮几乎不参与反应。
?（ 3）通过测定 N2 的体积（摩尔
数），可测定游离氨基氮。
2.与甲醛反应
反应特点,
反应放出 H+, 可用标准 NaOH溶液
滴定，是常用的测定氨基酸的反应。
3.脱羧反应
反应特点,
在专一性酶的催化下进行，放出
CO2,工业上通过呼吸仪测定 CO2的
量来测定 AA。
4.成盐反应
氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。
5.成肽反应
一个氨基酸的 α –氨基和另一个氨基
酸 α –羧基脱水缩合，生成的酰胺叫
做肽，这种酰胺键叫做 肽键 。 H 2 N C C O H
H
R 1
O
N
H
C C O O H
H
R 2
H H 2 N C C
H
R 1
O
H N C C O O H
H
R 2
p e p t i d e b o n d
H 2 O
肽键的平面特征
肽结构
6.茚三酮反应（鉴别反应）
O
O
O H
O H
R C C O O
-
N H 3
+
H
O
O
N
O
-
O
+
N i n h y d r i n ? - a m i n o a c i d P u r p l e p r o d u c t ( o r y e l l o w f o r P r o )
在 450nm处有最大吸收
率，在 0.5－ 50μ g / ml
范围内，氨基酸含量与
光密度成正比。
7.羰氨反应,
氨基酸的氨基与糖类的羰基易发
生反应，生成羰氨化合物，进而缩合
成更复杂的棕色到黑色化合物, 类黑
色素, 。食品加工中将这种反应称为
褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的
色、香、昧。但生成的黑色素则不能
被细胞利用，也不能被发酵，不仅影
响原料利用率，而且有毒副作用。
8.个别 R基团的反应（略）
从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或
者分离分析氨基酸组成，需要分辩力
很强的分离技术。 层析 法是近代生化
中非常有效的常用分离方法。对于氨
基酸混合样品，或者其他各种性质相
近，一般化学方法难以分离的混合样
品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生
素、抗生素、激素。等等，都能使用
层析法达到分离分析的目的。
层析分离是利用混合物中各组分的
物理化学性质（分子形状和大小、
分子极性、吸附力、分子亲和力、
分配系数等）的不同，使各组分以
不同程度分布在两相中，其中一个
是固定相，另一个是流动相，当流
动相流过固定相时，各组分以不同
的速度移动，而达到分离的方法。
层析技术的三个基本构成条件
?水不溶性惰性支持物。
?流动相（能携带溶质沿支持物流动）。
?固定相（附着在支持物上，能对各种
溶质的流动产生不同的阻滞作用）。
层析技术的分类
?按流动相的状态分,液相层析（液
相色谱）、气相层析（气相色谱）。
?按固定相的使用形式分类,柱层析、
纸层析、薄层层析、薄膜层析。
?按分离过程依据的理化性质分类,
吸附层析、分配层析、离子交换层析、
分子筛过滤层析、亲和层析。
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层析技术的应用
对于分子大小不等的化台物，例如含多
种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分
离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的
化食物，常用吸附层析法分离；对于既
溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用
分配层析分离；电解质混合物则宜用离
交层析分离。
分配层析技术
分配层析是利用各组分的分配系数不
同而予以分离的方法 。包括纸上层析、
薄层层析、气相层析。
分配系数是指一种溶质在两种互不相
溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质
在两相溶剂的浓度比值。 在层析条件
确定后，分配系数是一个常数。以 K表
示。
流动相中溶质的浓度
固定相中溶质的浓度
?K
分配层析的基本原理
分配层析中，通常采用一种多孔性固
体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、
淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为
固定相,这种溶剂在层析过程中始终
固定在多孔支持物上。
另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂
可以沿固定 相流动,即流动相。溶质
在流动相的带动下流经固定相时，溶
质在两相之间连续动态分配。由于不
同溶质的分配系数不同而分离。
纸上层析
纸上层析是以滤纸为支持物的一
种分配层析。滤纸能吸收 22％－ 25％
的水，其中 6％－ 7％的水以氢键与滤
纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所
以 纸上层析是以滤纸纤维的结合水为
固定相，以有机溶剂为流动相的层析
技术 。由于各物质的分配系数不同，
移动的速率也就不同，从而达到分离
的目的。
纸层析的 Rf值
溶质在滤纸上移动的速率用 Rf值表示,Rf值决定于被分离物质在两相间的分
配系数以及两相间的体积比，在同一
实验条件下，两相的体积比是一个常
数。所以 Rf值决定于分配系数。不同
物质的分配系数不同,Rf值也不同，
由此可以根据 Rf值的大小对物质进行
定性分析。
纸层析的操作
1.样品处理
2.点样
3.平衡
4.展开
5.显色
6.定性分析
7.定量分析
尽可能纯化，调节 pH,浓度 。
将样品溶液用微量注射器点在原点。
在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将
滤纸饱和。 将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤
纸移动。 为了看清斑点，用显色剂显色。
计算 Rf值，进行定性。 剪洗比色、直接比色、面积测量。
离子交换柱层析
离子交换柱层析是用 离子交换剂作
为水不溶性支持物兼固定相,装成层
析柱，用 不同 pH和不同离子强度的
缓冲液作流动相 (洗脱液 )构成的柱层
析技术。这是目前应用非常普遍的
分离技术，无论实验室还是生产领
域都有广泛的实用性。
离子交换剂 是含有若干活性基团的不
溶性高分子物质。即在不溶性母体上
引入若干可解离基团。
不溶性母体,苯乙烯树脂、酚醛树脂、
纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。
引入的活性基团，可以是酸性基团，
也可以是碱性基团。
在不溶性母体上引入酸性基团，如磺
酸基（ -SO3 H）,磷酸基（ -
PO3H2）,亚磷酸基（ - PO2H）、
羧基（ -COOH） 等时，可解离出 H+,
与其它阳离子交换，这种离子交换树
脂属于阳离子交换树脂。
在不溶性母体上引入碱性基团，如季
胺? -N+（ CH3） 3?,叔胺? -N
（ CH3） 2?,仲胺? -NHCH3?,伯
胺? -NH2? 等含氨基的基团，可与
OH-结合后，与其它阴离子交换，属
于阴离子交换树脂。
分配系数（平衡常数）
在一定条件下，离子交换剂所吸附离
子浓度和在溶液中的离子浓度达到平
衡时，两者浓度之比叫做 分配系数
（也叫 平衡常数 ）即,
K值的大小决定样品离子在柱内的保
留时间。如果样品中各离子的 K值差
别足够大，这些离子通过离子交换层
析就可以得到分离。
阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴
离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和
力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的
难吸附，易洗脱。
氨基酸的离子交换层析分离
当使用阳离子交换树脂柱时，在
pH2—3的条件下，各种氨基酸都带
正电荷，都能交换，上柱。与树脂的
静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸
（ A2+）＞ 中性氨基酸 (A+)＞ 酸性氨基
酸 (A± )。
当用缓冲液洗脱时，随 pH由低到高，
氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性
氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，
最后是碱性氨基酸。 同种性质的氨基
酸,R基团与树脂间亲和力小者先流出，
大者后流出。
离子交换层析技术的自动化
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蛋白质的一级结构
蛋白质分子是蛋出质的具有完整生
物功能的最小结构单位。
1952年丹麦人 Linderstrom-Lang最早
提出蛋白质的结构可以分成四个层次,
? 一级结构,氨基酸序列
? 二 级结构,α -螺旋,β -折叠
? 三 级结构,所有原子空间位臵
? 四 级结构,蛋白质多聚体
一级结构又叫初级结构、基本化
学结构或共价结构。 1969年国际纯
粹与应用化学联合会 (IUPAC)定义为：
一级结构即肽链中的氨基酸顺序。
一级结构是高级结构的化学基础，
也是认识蛋白质分子生物功能、结构
与生物进化的关系、结构变异与分子
病的关系等许多复杂问题的重要基础。
研究一级结构需要阐明的内容包括,
?（ 1）蛋白质分子的多肽链数目。
?（ 2）每条肽链的末端残基种类。
?（ 3）每条肽链的氨基酸顺序。
?（ 4）链内或链间二硫键的配臵等。
多肽链
氨基酸通过肽键 连接起来的链状
物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽
和蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可
以等同使用。
研究蛋白质的 一级结构,就是要
将氨基酸的排列顺序搞清楚。
四十年代起，许多人不遗余力
从事蛋白质的一级结构研究。
一级结构研究史上的两个第一
?1954年英国生化学家 Sanger报道了
胰岛素的一级结构，是世界上第一例
确定一级结构的蛋白质。 Sanger由此
1958年获 Nobel 化学奖。
?1965年我国科学家完成了结晶牛胰
岛素的合成，是世界上第一例人工合
成蛋白质。
多肽链的结构
一级结构中的二硫键
分析一级结构的一般程序
一级结构的分析是一项非常细致
而又复杂的技术上作，基本工作程序
是,
（ 1）将蛋白质纯化，测定末端组成。 （ 2）拆分蛋白质分于并将多肽分离
纯化。
（ 3）用酶法或化学方法进行专一性
切割，得到系列长短不一的肽段。
（ 4）将肽段分离，通过末端分析方
法测定各肽段的氨基酸顺序。
（ 5）根据二肽段的顺序重叠关系确
定各个肽段的衔接顺序。排出完整
多肽链的氨基酸顺序。
（ 6）确定二硫键的位臵。
Sanger试剂 (FDNB)标记 N末端
ABCDE
↓
*ABCDE
↓
*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE
↓
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E
↓
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1 2 3 4 5 结论, A B C D E
一级结构与蛋白质功能的关系
一级结构中，有的部位保守性很强，
既不能缺失，也不能更换，否则就
会丧失活性；有的部位则可以改变，
切除或更换别的残基都不影响生物
活件；还有的部位必须切除之后，
蛋白质分子才显活性。不同部位的
残基对功能的影响，实质是影响了
蛋白质分子特定的空间构象的形成。
许多先天性疾病是由于某一重要的
蛋白质的一级结构发生了差错引起
的。如血红蛋白 β 亚基 6 位 Glu被
Val代替（基因突变），即表现为
镰刀状贫血，为世上最常见的血红
蛋白病。
比较不同生物细胞色素 C的一级结
构可以帮助了解物种间的进化关
系，物种间越接近，则细胞色素 C
的一级结构越相似
牛胰岛素分子的激活,
天然活性肽
除了蛋白质水解可以产生长短不
等的肽段之外，生物体内还有很多游
离存在的小分子活性肽，各具有一定
的生物功能。有些活性肽属于激素类，
如催产素、加压素等都是九肽。
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蛋白质的空间结构
所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的 构
象 而言。构象与构型都是立体化学结构概
念，但含义不同。 构型是由于化合物分子
中某一不对称碳原子上四种不同的取代基
团（或原子）的空间排列所形成的一种光
学活性立体结构。 一个不对称碳原子只能
形成两种不同的构型。分子从一种构型变
为另一种构型，例如从 D-丙氨酸变为 L-丙
氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另
生成）。
构象是分子内所有原子或原子团的空间排
布所形成的 —种立体结构。 这类立体结构
不需要共价键断开，只要分产中发生 C－ C
单键的转动就能从一种构象变为另 —种构
象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象
了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分
子都有与其生物活性相关的一种或少数几
种特定的构象，这种天然构象相当稳
定。 —定条件下，将蛋白质分子从细胞中
分离出来，仍能保持其天然构象和生物活
性。
维系蛋白质分子构象的化学键
蛋白质的二级结构
二级结构,多肽链中各原子在局部空
间或一段肽链的氨基酸残基的空间排
布方式。 为主链构象，不涉及侧链构
象。包括 α -螺旋,β -折叠以及 β -转角，
这些主链基本构象都是以酰胺平面
（或称肽键平面、肽单元）为基本结
构单位，有规则的盘曲而成的。也存
在部分无规则卷曲。
肽键平面
肽键平面
肽链中的肽键平面
两个肽平面以
一个 Cα 为中心
发生旋转
蛋白质 -α 螺旋结构
?右手螺旋 (顺时针 )。
?肽链的主链形成紧密的螺旋,侧链伸
向外侧，每一圈包含 3.6个氨基酸残基,
每个残基跨距为 0.15nm,螺旋上升一
圈的距离 (螺距 )为 3.6× 0.15=0.54nm，
环内原子数 13。
?螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽
键的 NH和第四个肽键的 CO形成氢键,
第 n个肽键的 NH和第 n+3个肽键的 CO
形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。
α -螺旋结构形成的限制因素
?凡是有 Pro存在的地方,不能形成。因 Pro
形成的肽键 N原子上没有 H,不能形成氢键。
?静电斥力。若一段肽链有多个 Glu或 Asp
相邻,则因 pH=7.0时都带负电荷,防碍 α 螺
旋的形成 ;同样多个碱性氨基酸残基在一段
肽段内,正电荷相斥,也防碍 α 螺旋的形成。
?位阻。如 Asn,Leu侧链很大，防碍 α 螺
旋的形成。
蛋白质 β—折叠 结构
β -折迭又叫 β -折迭片或 β -片层结构，
也是蛋白质分子中常见的主链构象之
一。所谓 β -折迭是两条或两条以上充
分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向
聚集，按肽链的长轴方向平行并列，
形成的折扇状构象。 β -折迭构象靠相
邻肽链主链亚氨基（ NH） 和羰基氧原
子之间形成有规律的氢键联结维系。
平行式
N端
N端
平行式与反平行式
蛋白质的 β -转角结构
又叫 U型回折,β -转弯或发夹结构。
是近年来在球状蛋白质分子中发现的
一种主链构象。球状蛋白质分子主链
在盘曲折迭运行中往往发生 180°的急
转弯，这种回折部位的构象即所谓 β -
转角。 β -转角是由 4个连续的残基组
成的，第一个残基的羰基与第四个残
基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构
象。
二级结构的多元性
球状蛋白质分子的二级结构一般都不
是单一构象。主链的不同段落构象不
同，多种构象单元交替连接组成整条
肽链的二级构象。
蛋白质的三级结构
蛋白质分子在一、二级结构基础
上，再进行三维空间的多向性盘曲折
迭。形成特定的近似球状的构象，称
为步白质分子的三级结构。根据 l 969
年 IUPAC的定义，三级结构包括蛋白
质分子主链和侧链所有原子或原子团
的空间排布关系。
蛋白质三级结构的构象特点
（ 1）三级结构构象近似球形。
（ 2）分子中的亲水基团相对集中在球形
分子的表面，疏水基团相对集中在分子内
部，形成所谓, 亲水表面，疏水核, 。
（ 3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水
相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚
的水化膜和双电层，对蛋出质分子构象起
很好的保护作用。
（ 4）三级结构形成之后，蛋白质分子的
生物活性部位就形成了。
结构域
有些较大的球状蛋白质分子或亚
基，常常先由几个二级结构单元组合
在一起形成超二级结构，以此作为形
成三级结构的实体，这些超二级结构
实体称为结构域，又叫辖区。结构域
进一步缔合则形成近似球形的三级结
构。
蛋白质的四级结构
有些球状蛋白质分子是由两个或两个
以上的三级结构单位缔合而织成的，
通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中
的每个三级结构单位称为一个亚基
（或亚单位）。 所谓蛋白质分子的四
级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基
与亚基间的立体排布及相互作用关系，
亚基的数目和类型也属四级结构研究
的内容，但不涉及亚基本身的构象。
两个亚基的结构
血红蛋白
寡聚蛋白质分子的亚基组成
据统计，已经研究过的寡聚蛋白
质分子达 700多种。它们的亚基数目
差别很大，少则几个，多则十几个，
数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数
亚基组成的。其中，两个或四个亚基
者最多。奇数亚基的分子很少见。
亚基类别组成有两种类型。一种是
由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，如过
氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四
聚体，每个亚基的一、二、三级结构都
相同，功能也相同。另一种是由结构不
同的亚基组成的非均 —寡聚蛋白，如血
红蛋白（ α 2β 2）。
维持四级结构稳定的因素为各亚基
之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。
含有四级结构的蛋白质，单独的亚
基一般没有生物学功能，只有完整的四
级结构才有生物学功能。
蛋白质的一、二、三、四级结构
蛋白质分子构象与功能的关系
蛋白质分子的构象并不是固定不变的。
许多蛋白质在表现其生物学功能时，
构象发生变化，从而改变了整个分子
的性质，这种现象称为 变构现象 。血
红蛋白在表现其输氧功能时的变构现
象就是一个典型的例子。
1.血红蛋白的结构与功能的关系
血红蛋白是由两个 α -亚基和两个
β -亚基组合而成的四聚体。血红蛋白
的亚基中分子各有一个血红素，能结
合一分子 O2 。 血红蛋白的亚基之间
相互作用形成了稳定的四级结构，使
其中的血红素与 O2的亲和力变得很弱。
当血红蛋白分子中一个亚基的血红素
与 O2结合，立即引起该亚基的构象发
生改变，这种构象变化随即通过亚基
间的次级键引起另外 3个亚基的构象相
继改变，结果改变了整个分子的构象，
使所有尚未与 O2结合的亚基都变成适
宜于与 O2结合的构象，从而使血红蛋
白的氧合速度大大加快。
O2
Hb
Hb- O2
O2
血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线
活动肌肉毛细血
管中的 PO2
0 20 40 60 80 100
肺泡中的 PO2
Myoglobin
Hemoglobin
2.核糖核酸酶 S的空间结构与功能的关系
核糖核酸酶 S三维结构的形成与维系也
有赖于多肽链内部的 4个二硫键,60年
代初，有人在含有巯基乙醇的 8mol／ L
尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶
S变性失活，然后透析除去尿素和巯基
乙醇。
在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，
变性的核糖核酸酶 S结构由伸展的肽链
自动折叠，重新形成的二硫键配对完全
正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。
这个实验充分证明了蛋白质的功能取决
于其特定的天然构象，而规定其构象所
需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。
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蛋白质的重要理化性质
因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，
氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋
白质上。如两性解离和等电点、成酯
反应、成盐反应、一些显色反应、光
吸收性质等在蛋白质上都有所表现。
不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质
大分子已经发生了质的变化，所以，
蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多
性质。
1.蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子，相对分子质量
一般都在 1－ 100万之间，其颗粒大小属于
胶体粒子的范围。 蛋白质水溶液是一种比
较稳定的亲水胶体,这是因为蛋白质颗粒
表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，
疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形
成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒
在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白
质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。
蛋白质胶体性质的应用
透析法,利用蛋白质不能透过半透膜的
的性质，将含有小分子杂质的蛋白质
溶液放入透析袋再臵于流水中，小分
子杂质被透析出，大分子蛋白质留在
袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这
种方法称为透析（ dialysis）。
膜分离与超滤技术, 透析是一种膜过滤
技术，曾为生物大分子的分离纯化起过
重要作用。 70年代以来．随着合成滤
膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，
超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯
化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤
技术，它是利用具有选择透过性的微孔
滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无
机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内
侧，从而达到分离纯化的目的。
2.蛋白质的两性解离和等电点
蛋白质等电点的应用
等电沉淀技术,在等电点 pH条件下，
蛋白质为电中性，比较稳定。其物理
性质如导电性、溶解度、粘度、渗透
压等都表现为最低值，易发生絮结沉
淀。因此，等电点性质常被用于蛋白
质的分离制备，被称为等电沉淀技术。
电泳技术, 在溶液 pH值不等于等电
点的条件下，蛋白质分子显电性，在
直流电场中向其所带电荷相反的电极
泳动。根据这一原理建立了将带电性
质不同的蛋白质混合物，在直流电场
中进行电泳分离的技术，称力蛋白电
泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离
制备、分析鉴定中常用的一种实验手
段。
3.蛋白质的变性作用
在某些物理化学因素作用下，蛋白质
分子内部的次级键断裂，二、三级空
间结构被破坏，分子的紧密构象变成
了松散的无序状态。天然构象破坏，
从而引起理化性质改变，生物活性丧
失。叫做蛋白质的变性作用。
注意,蛋白质变性后一级结构没有发
生变化。只是空间构象发生变化。
造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、
尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外
线,X线等。
变性
复性
注意,并不是所有变性蛋白都可以复
性的！
变性蛋白质的性质
?理化性质发生了变化，旋光性改变，
粘度增加，光吸收性质增，强失去了
结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、
沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应
增强。
?生化性质发生了变化，变性蛋白质
比天然蛋白质易被蛋白酶水解。
?生物活性丧失，这是蛋白质变性的
最重要的明显标志之一。
4.蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条
件的、相对的。假若改变环境条件，
破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲
水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀
现象。这即所谓蛋白质 沉淀作用 。
本本本 课课课 件件件 由由由 西西西 华华华 大大大 学学学 生生生 物物物 工工工 程程程 学学学 院院院 车车车 振振振 明明明 制制制 作作作
蛋白质的沉淀性质的应用
盐溶与盐析,
在蛋白质溶液中加入中性盐（如
NaCl、（ NH4） 2SO4等）时，可产生
以下两种现象：在盐浓度很稀的范围
内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解
度亦随之增加，这种现象称 盐溶 。盐
溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷
吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水
的亲和力，促进蛋白质的溶解。
与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提
高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度
逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成
沉淀析出，这种现象称为 盐析 。
盐析作用的发生机理很复杂，一
般认为中性盐与水的亲和力大，又是
强电解质，当一定高浓度的中性盐加
到蛋白质溶液中时，一方面结合大量
自由水，降低水分活度；一方面又夺
取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质
分子之间互相作用的机会，促其聚集
絮结成沉淀析出。
利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质
沉淀的方法叫做 盐析沉淀法 。
不同蛋白质表面电荷量不同，水
化膜的厚度不一样，盐析所需要的中
性盐浓度也不一样，一般而言，相对
分子质量大的容易盐析，相对分子质
量越小，所需盐浓度越高。根据这种
性质，同一溶液中不同相对分子质量
的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的
方法逐一沉淀分离出来，这种方法称
为分级盐析。
等电点盐析沉淀,盐析与等电点结合
沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶
液的 pH调至目的蛋白质的等电点。然
后再加固体 (NH4)2SO4或其饱和溶液，
使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀
析出。
有机溶剂沉淀,
水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，
具有介电常数比较小，与水的亲和力
大，能以任何比例与水相溶等特点。
当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶
剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水
化膜，同时，还能降低水的介电常数，
增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，
导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。
与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的
浓度也与蛋白质相对分子质量有关，
相对分子质量大的要求浓度低，相对
分子质量小的要求浓度高。不同相对
分子质量的混合溶液，可以通过调节
有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。
等电点有机溶剂沉淀,
有机密剂沉淀法若与等电点结合，
沉淀更易发生，而且彻底。先将提取
液 pH调至目的蛋白质的等电点、再加
有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会
很快沉淀析出。
注意,在对蛋白质的影响方面，与盐
析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋
白质会引起变性，因此，用这种方法
进行操作时需要注意：（ 1）低温操作。
（ 2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能
过长，在沉淀完全的前提下，时间越
短越好。
失活沉淀,
重金属盐沉淀,当溶液 pH大于等
电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与
重金属离子（ Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+
等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析
出。误服重金属盐的病人，大量口服
牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是因
为这些食物中的蛋白质与重金属离子
形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体
外。达到解毒的目的。
生物碱试剂沉淀,当溶液的 pH低于等
电点时，蛋白质分产是阳离子形式存
在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣
酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）
作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发
生蛋白质分子变性。实验室中常用这
些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。
在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类
物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以
澄清，防止成品啤酒混浊。
热凝固沉淀,蛋白质受热变性后，将
pH调至等电点，则很容易发生凝固沉
淀。其原因是：由于变性蛋白质的空间
结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，
同时由于等电点破坏了带电状态等而发
生絮结沉淀。我国传统的做豆腐工艺是
将豆浆煮沸，点入少量盐卤（含 MgCl2）
或石膏（含 CaSO4）,或者点入酸浆或
葡萄糖酸内酯将 pH调至等电点，热变
性的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤
成型则成豆腐。
5.蛋白质的颜色反应
（ 1） 双缩脲反应 双缩脲是由两分子
尿素缩合而成的化合物。将尿素加热
到 180℃,则两分子尿素缩合成一分
子双缩脲，并放出一分子氨气。
双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应
产生红紫色络合物，该反应称为 双缩
脲反应 。蛋白质分子中含有许多和双
缩脲结构相似的肽键，因此也能起双
缩腺反应，形成红紫色络合物。通常
可用此反应定性蛋白质，也可根据反
应产生的颜色在 540nm处比色，定量
测定蛋白质。
（ 2） Millon（ 米伦）, 反应米伦试剂
为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸
的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试
剂后立即产生白色沉淀，再加热后，
沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，
酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋
白质都有此反应。
（ 3）黄色反应,这是含有酪氨酸和
色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。
蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉
淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加
碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝
酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生
了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指
甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。
（ 4）乙醛酸反应,在含有蛋白质的
溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢
注人浓硫酸，在两液层之间会出现紫
色环，凡含有吲哚基的化合物都有这
一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白
质有此反应，但不含色氨酸的白明胶
就无此反应。
（ 5）茚三酮反应,蛋白质和氨基酸
一样，也能与水合前三酮反应，生成
蓝紫色化合物。实践中常利用这一反
应来检测蛋白质的存在。但不能区别
蛋白质与氨基酸。
（ 6） Folin（ 福林） -酚试剂反应,蛋
白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸
中的酚基能将福林 -酚试剂中的磷钼酸
及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝
和钨蓝的混合物）。这一反应常用来
定量测定蛋白质的含量。
（ 7）坂口反应, 蛋白质分子中的精
氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次溴
酸钠及 a-萘酚在氢氧化钠溶液中产生
红色物质。此反应用以测定精氨酸或
含有精氨酸的蛋白质。
6.蛋白质的紫外吸收
一般蛋白质在 280nm波长处都都最大
的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨
酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。
通常利用这些特异性的吸收，可以测
定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质
存在的话，可用来测定浓度为 0.1一
0.5mg／ ml的蛋白质溶液。
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蛋白质相对分子量的测定
小分子化合物相对分子质量的测定方法
冰点降低法、沸点升高法或蒸汽压减小法
蛋白质是大分子胶体物质，这些方法不适用。
常用方法有,
化学分析方法
超离心沉降速度法 凝胶过滤层析法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
超离心沉降速度法
对蛋白质溶液进行 5－ 6万 r/min的高
速离心，蛋白质分子会向离心池底部
方向移动，离心池上面为清液，清液
与下面的溶液之间出现一个界面。用
光学方法测定界面移动的速度，即为
蛋白质的 离心沉降速度 。根据下面的
公式可求出溶质的 沉降系数 。
xdt
dx
S
2
1
?
??
?x－－ 界面移动距离
?t－－ 离心时间
?ω －－ 角速度
?S－－ 沉降系数
由沉降系数 S可根据斯维得贝格
（ Sved berg） 方程计算相对分子质量。
)1( ??
?
?
?
D
R TS
M
都可以通过实验求出。、、、
））的密度（－溶剂（一般用缓冲液
－扩散系数
比容约为
质溶于水的偏微分溶液体积的增量，蛋白体积的溶剂中时，即一克溶质加到一个大－分子偏微分比体积，
－绝对温度
）－气体常数（
－
－
??
?
?
??
DS
D
KT
KJR
D
R T S
M
3
3
g / c m
.g/cm74.0
)(
m ol/314.8
)1(
?
?
?
?
沉降系数 S的意义与应用
沉降系数 S是文献中经常使用的物理量。
其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中
的沉降速度，量纲为秒。一个 S单位是
l× 10-13s,相对分子质量越大,S越大。
蛋白质的沉降系数大都在 1—200S之间。
当一种新发现的大分子，其结构、性质
和功能都处在研究过程中时，其名称未
定，为了描述方便，常用其沉降系数 S来
表示。
凝胶过滤法
葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子
质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有
三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小
一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗
粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大
分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱
液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来
穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱
体积大。
若用多种已知相对分子质量的标准蛋
白质准确测得各自的洗脱体积（ Ve），
以 Ve对相对分子质量对数作图，得标
准曲线，再用同样条件测定未知样品
洗脱体积（ Ve）,从标准曲线上可查
出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶
过滤法可测定（ 1—80）万范围内的
相对分子质量，误差为± 5％。但对
变性蛋白和线性分子不适用。
化学分析方法
此法是测定特征性化学成分，计
算最低相对分子质量。 首先利用化学
分析方法则定蛋白质中某一持殊成分
（某种元素或某种氨基酸）的百分含
量。然后，假定蛋白质分子中该元素
共有一个原子（或一分子某种氨基
酸），据其百分含量可计算出最低相
对分子质量。
例如，测得细胞色素 c的铁元素含
量为 0.43％，已知铁相对原子质量为
55.8，则最小相对分子质量（ M） 为,
M＝ 55.3× 100/0.43≈13000
因为细胞色素 c分子只有一个铁卟
啉辅基，所以，计算结果与其他方法
测得的真实相对分子质最相当。
如果蛋白质分子中所含已知成分不是
一个单位，则真实相对分子质量等于
最小相对分子质量的倍数。例如，血
红蛋白分了中含铁 0.335％，计算出其
最低相对分子质量为 1.67万。只相当
于其他方法所得血红蛋白相对分子质
量的 1/4。可见，血红蛋白分子中实际
含有 4个铁原子，其真实相对分子质量
为最小相对分子质量的四倍。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷
质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸钠
（ SDS） 溶液中于 100℃ 热处理，并加巯基
化合物将二硫键打开。则蛋白质变性，伸
展成棒状并与 SDS结合而带上大量的负电荷，
这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就
相对地不重要了。所结合的大量 SDS负电荷
决定着分子的带电性质。蛋白质分子大，
结合 SDS多；分子小，结合 SDS少。因此，
不管分子大小，荷质比是相同的。
在上述情况下，荷质比对不同分子量
的 SDS-蛋白质的电泳迁移率的影响不
会有什么差别了。凝胶的分子筛效应
对长短不同的棒形分子会产生不同的
阻力，这是影响迁移率的主要因素。
同一电泳条件下，分子小，受阻小，
泳动快，迁移率大。相对分子质量大
者，迁移率小。
进行 SDS-蛋白电泳时，用一种染料
（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。
电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距
离和原点到前沿距离的比值,
原点到前沿的距离
蛋白质分子移动的距离?
?
S D S
R?
μ R与相对分子质量的对数成一定比
例关系，测定几种已知标准相对分子
质量的 μ R,并对相对分子质量对数作
图，得一直线。根据未知相对分 子质
量的 μ R可从图上查得相对分子质量。
这种 方法速度快，样品用量 少，缺
点是误差大，误 差来源于迁移距离的
测量。
重点复习,
1.氨基酸种类、结构特征、性质；
2.蛋白质结构、结构与功能的关系；
3.等电点理论及其应用；
4.蛋白质变性理论及其应用；
5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基
本原理。
6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。
Hi
下课了！
第一节 概述
第二节 氨基酸
第三节 蛋白质的一级结构
第四节 蛋白质的空间结构与功能
第五节 蛋白质的重要理化性质
第六节 蛋白质相对分子量的测定
本本本 课课课 件件件 由由由 西西西 华华华 大大大 学学学 生生生 物物物 工工工 程程程 学学学 院院院 车车车 振振振 明明明 制制制 作作作
第一节 概述
一,蛋白质的概念
二,蛋白质的研究简史
三,蛋白质的化学组成
四,蛋白质的分类
五,蛋白质的分布
六,蛋白质的生物学功能
蛋白质的概念,蛋白质是一切生物体
中普遍存在的,由天然氨基酸通过
肽键连接而成的生物大分子 ；其种
类繁多，各具有 —定的相对分子质
量、复杂的分子结构和特定的生物
功能，是表达生物遗传性状的一类
主要物质。
?1838年 Muller研究了血清、蛋清、
蚕丝等物质的元素组成后,发现它们
均可以用 C40H62N10O12 来表示,命名
为, Protein”,并发展成, 基团, 学
说 。
?19世纪末 从蛋白质水解产物分离得到了 13种氨基酸,基团学说销声匿迹。
?1902年 Fischer,Hofmeister同时
提出肽键理论 。
?1924年 Svedberg 发明超离心机 。
?1930年代 Bergmann合成出只含 L型
氨基酸的多肽。
?1950年 Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位,α -螺旋和 β -折叠 。
?1953年 Sanger确定了牛胰岛素的一级结构 。
?1958年 Perutz & Kendrew用 X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构
6 年 Anfinsen证明蛋白质的一级
结构决定其立体结构。
?1980年代 蛋白质工程的兴起。
1 97年 提出蛋白组学研究的概念。
?1999年 蛋白质芯片技术出现。
对蛋白质化学有突出贡献的 Nobel奖
获得者,
?1902年 H.E.Fischer (德，化 ) 肽键理
论，多肽合成。
?1910年 A.Kossel (德，医 ) 组氨酸、
组蛋白的发现，碱基的发现。
?1915年 W.H.Bragg/W.L.Bragg (德，
物 ) 用 X射线测定晶体物质结构。
?1926年 T.Svedberg (瑞，化 ) 用超离
心手段决定蛋白质的分子量。
?1946年 J.B.Summer (美，化 ) 蛋白质
酶的结晶，证明酶的本质为 Pr。
?1948年 A.W.K.Tiselius (瑞, 化 ) 电泳
装臵的开发, 血清蛋白的研究 。
?1952年 A.J.P.Martin/R.L.M.Synge (英,
化 )分配层析发明, 氨基酸的分离 。
?1954年 L.Pauling (美, 化 ) 蛋白质二
级结构, 抗原抗体反应理论 。
?1958年 F.Sanger (英, 化 ) 胰岛素一级
结构的测定 。
?1962年 M.F.Perutz/J.C.Kendrew (英，
化 ) X射线确定蛋白质的立体结构 。
?1972年 G.M.Edelman/R.R.Porter (美，
医 )抗体的化学构造与功能的解明。
?1972年 W.H.Stein/S.More (美，化 )
RNase的一级结构和活性中心的解明。
?1972年 C.B.Anfinsen (美，化 ) 蛋白
质的一级结构决定其立体结构。
?1998年 S.B.Prusiner (美，医 ) Prion:蛋
白立体机构的变化导致疾病 。
蛋白质的化学组成
蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有
碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某
些蛋白质还含有其他一些元素，主要是
磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素
在蛋白质中的组成百分比约为,
碳 50％
氢 7％
氧 23％
氮 16%
硫 0—3％
其他 微 量
N的含量平均为 16%——凯氏（ Kjadehl）
定氮法 的理论基础。
蛋白质含量的测定,凯氏定氮法
(测定氮的经典方法 )
优点：对原料无选择性，仪器简单,
方法也简单；
缺点：易将无机氮 (如核酸中的氮 )
都归入蛋白质中,不精确。
一般，样品含氮量平均在 16%，取其倒
数 100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其
含义是样品中每存在 1g元素氮，就说明含有
6.25g 蛋白质）；故,※ 蛋白质含量 =氮
的量× 100/16× 6.25
蛋白质的分类
1.按照分子组成分类
单纯蛋白质,水解产物只有氨基酸。
结合蛋白质,水解产物中除了氨基
酸外，还有金属离子和其它物质（辅
基）。结合蛋白根据其辅基的不同有
好多种。
一种单纯蛋白质只能与特定的一种
或几种辅基结合。
2.按照分子形状分类
球状蛋白,分子近似球形或卵圆形，
易溶解，能结晶。
纤维状蛋白,分子纤维状，不对称。
大多数不溶于水。
3.按照生物功能分类
活性蛋白质,参与代谢反应的蛋白
质。
非活性蛋白质,对生物体起保护和
支持作用的蛋白质。
活性蛋白质分类
1,酶类（ 占细胞内蛋白质种类的绝大部分） ;
2,运输蛋白 ;
3,收缩运动蛋白 ;
4,激素蛋白 ;
5,细胞激动素 ;
6,受体蛋白 ;
7,毒素蛋白 ;
8,营养贮藏蛋白 ;
9,防御蛋白等。
蛋白质占干重 人体中（中年人）
人体 45% 水 55%
细菌 50%~80% 蛋白质 19%
真菌 14%~52% 脂肪 19%
酵母菌 14%~50% 糖类＜ 1%
白地菌 50% 无机盐 7%
植物：主要在种子中含量较高。
蛋白质的分布 人体各组织器官中蛋白质含量 （蛋白质 g / 100g干组织）
器官或组织 蛋白质含量 器官或组织 蛋白质含量
体液 85 心 60
脾 84 肝 57
肺 82 胰 47
横纹肌 80 脑神经 45
肾 72 骨骼 28
消化道 63 脂肪组织 14
我国一些谷物主要成分含量
粮食种类 蛋白质 /％ 脂肪 /％ 糖类 /％
大豆 36.3 17.5 26
豌豆 22.78 1.35 54.7
绿豆 22.25 1.08 56.02
花生仁 26.20 39.2 22.0
油菜籽 26.34 40.35 17.59
大米 6.55 1.05 77.50
小麦 9.42 1.47 68.74
玉米 5.22 6.13 72.4
蛋白质的生物学功能
1.生物体的组成成分
2,催化
3,运输
4,运动
5,抗体
6,干扰素
7,遗传信息的控制
8,细胞膜的通透性
9,高等动物的记忆、识别机构
酶蛋白
结构蛋白
免疫球蛋白
第二节 氨基酸
一,氨基酸的结构特点
二,20种基本氨基酸的分类
三,氨基酸的重要理化性质
四,氨基酸的分离制备和分析鉴定
本本本 课课课 件件件 由由由 西西西 华华华 大大大 学学学 生生生 物物物 工工工 程程程 学学学 院院院 车车车 振振振 明明明 制制制 作作作
氨基酸 是蛋白质的基本组成单位。 氨
基酸是具有氨基（ -NH3+） 或亚氨基
和羧基（ -COOH） 的有机分子。氨基
酸种类多，但构成蛋白质具有遗传密
码的氨基酸只有 20种，其通式为,
不带电形式
H2N— C— H
COOH
R
+H3N— C— H
COO-
R
两性离子形式
氨基酸的结构特点,
(1),与羧基相邻的 α -碳原子上都有一
个氨基，因而称为 α -氨基酸
(2),除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子
中的 α -碳原子都为不对称碳原子,所
以,A.氨基酸都具有旋光性。 B.每一
种氨基酸都具有 D-型和 L-型两种立体
异构体。目前已知的天然蛋白质中氨
基酸都为 L-型。
注意,
氨基酸的构型是以距羧基最近的手性
C原子为标准（ 除 Gly外 ），而糖的构
型是以距羧基最远的手性 C原子为标
准。
氨基酸的分类
中性 AA
（ 1） 按 R基团的酸碱性分 酸性 AA
碱性 AA
（ 2） 按 R基团的 疏水性 R基团 AA
电性质分 不带电荷极性 R基团的 AA
带电荷 R基团的 AA
脂肪族 A
（ 3） 按 R基团的化学结构分 芳香族 AA
杂环族 AA
+
H
3
N
C O O
-
H
+
H
2
N
C O O
-
H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
3
+
H
3
N
C O O
-
H
C H ( C H
3
)
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H ( C H
3
)
C H ( C H
3
)
2
C H
2
C H
3
G l y c i n e ( G l y ) A l a n i n e ( A l a ) V a l i n e ( V a l )
L e u c i n e ( L e u ) I s o l e u c i n e ( I l e ) P r o l i n e ( P r o )
甘 氨 酸 丙 氨 酸 缬 氨 酸
亮 氨 酸 异 亮 氨 酸 脯 氨 酸
1, N o n p o l a r,a l i p h a l i c R g r o u p s ( 6 )
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
P h e n y l a l a n i n e ( P h e ) T y r o s i n e ( T y r ) T r y p t o p h a n ( T r y )
苯 丙 氨 酸 酪 氨 酸 色 氨 酸
2, A r o m a t i c R g r o u p s ( 3 )
N
H
O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H O H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
S H
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
S C H
3
C O N H
2
S e r i n e ( S e r ) T h r e o n i n e ( T h r ) C y s t e i n e ( C y s )
M e t h i o n i n e ( M e t ) A s p a r a g i n e ( A s n ) G l u t a m i n e ( G l n )
丝 氨 酸 苏 氨 酸 半 胱 氨 酸
甲 硫 氨 酸 （ 蛋 氨 酸 ） 门 冬 酰 胺 谷 氨 酰 胺
3, P o l a r,u n c h a r g e d R g r o u p s ( 6 )
C H
3
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C O N H
2
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C O O
-
A s p a r t a t e ( A s p ) G l u t a m a t e ( G l u )
门 冬 氨 酸 谷 氨 酸
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C O O
-
4, N e g a t i v e l y c h a r g e d R g r o u p s ( 2 )+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
L y s i n e ( L y s ) A r g i n i n e ( A r g )
赖 氨 酸 精 氨 酸
+
H
3
N
C O O
-
H
C H
2
C H
2
C H
2
5, P o s i t i v e l y c h a r g e d R g r o u p s ( 3 )
C H
2
C H
2
N H
3
+
N H
C
N H
2
N H
2
+
+
H
3
N
C O O
-
H
H
2
C
H N
N H
g u a n i d i n o
i m i d a z o l e
H i s t i d i n e
组 氨 酸
人体必需氨基酸有八种,
Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr
―假 设 来 写 一 两 本 书,
(一 )氨基酸的一般物理性质
常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构
型而异
(1)溶解性,各种氨基酸在水中的溶解
度差别很大，并能溶解于稀酸或稀
碱中，但不能溶解于有机溶剂。通
常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀
析出。
(2) 熔点,氨基酸的熔点极高，一般在
200℃ 以上。
(3) 味感,其味随不同氨基酸有所不同，有
的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的
单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。
(4)旋光性,除甘氨酸外，氨基酸都具有旋
光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，
左旋者通常用（ -）表示，右旋者用（ +）
表示。
(5)光吸收,构成蛋白质的 20种氨基酸
在可见光区都没有光吸收，但在远
紫外区 (<220nm)均有光吸收。在近
紫外区 (220-300nm)只有酪氨酸、苯
丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。
Tyr,Trp,Phe在近紫外光区的最大
吸收峰（ λ max） 和摩尔消光系数 ε
?酪氨酸的 ?max
＝ 275nm，
?275=1.4x103 ;
?苯丙氨酸的
?max＝ 257nm，
?257=2.0x102;
?色氨酸的 ?max
＝ 280nm，
?280=5.6x103;
氨基酸在结晶形态或在水溶液中，
并不是以游离的羧基或氨基形式存在，
而是离解成两性离子。在两性离子中，
氨基是以质子化 (-NH3+)形式存在，羧
基是以离解状态 (-COO-)存在。
在不同的 pH条件下，两性离子的
状态也随之发生变化。
（二）氨基酸的离解性质
R C C O O H
N H 3 +
H
I I
1
OH-
H+
K1
R C C O O -
N H 3 +
H
I
1 1+
O H -
H +
K 2
R C C O O -
N H 2
H
I I I
1
L o w p H H i g h p H
如果在某一 pH 值下, 氨基酸所带正电荷的数
目与负电荷的数目正好相等, 即 净电荷为零,
则称该 pH 值为该氨基酸的 等电点 (pI)。
各种氨基酸都有其特定的等电点。
中性氨基酸的 pI在微酸性；碱性氨基
酸的 pI在碱性 pH范围；酸性氨基酸
的 pI在酸性 pH范围。
氨基酸在等电点时溶解度最小，
易发生沉淀。工业上利用这一性质提
取氨基酸。
pH < pI,样品带 正电荷,样品点向 阴 极移动
pH > pI,样品带 负电荷,样品点向 阳 极移动
pH = pI,样品 不带电荷,样品点 不移动
氨基酸等电点的确定
（ 1） 中性氨基酸
等电点（ pI） 的高低与氨基酸分子两性解
离基团的解离平衡常数有一定关系。用 K’1、
K’2分别表示 α -COOH和 α -NH3+表观解离
平衡常数时，它们的负对数分别用 pK’1、
pK’2表示，则中性氨基酸的等电点在数值
上等于两个 pK’值之和的二分之一。即,
pI = (pK1 + pK2) / 2
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2.酸、碱性氨基酸
在溶液中氨基酸随 pH升高而逐级解
离时，总是 pK＇ 值小的基团先解离，
pK＇ 值大者后解离。因此，对于具有
三个解离基团的氨基酸，只有靠近等
电离子的两个 pK＇ 值影响等电离子的
浓度。所以，只要正确写出解离反应
式，皆可根据等电离子两边的 pK＇ 计
算其 pI值。
酸性氨基酸,
pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2
硷性氨基酸,
pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2
（三）氨基酸的重要化学反应
1.与亚硝酸反应
反应特点,
?（ 1）脯氨酸不发生该反应；
?（ 2）只有 α –氨基氮可发生此
反应,R上的氮几乎不参与反应。
?（ 3）通过测定 N2 的体积（摩尔
数），可测定游离氨基氮。
2.与甲醛反应
反应特点,
反应放出 H+, 可用标准 NaOH溶液
滴定，是常用的测定氨基酸的反应。
3.脱羧反应
反应特点,
在专一性酶的催化下进行，放出
CO2,工业上通过呼吸仪测定 CO2的
量来测定 AA。
4.成盐反应
氨基和羧基分别可与酸和碱成盐。
5.成肽反应
一个氨基酸的 α –氨基和另一个氨基
酸 α –羧基脱水缩合，生成的酰胺叫
做肽，这种酰胺键叫做 肽键 。 H 2 N C C O H
H
R 1
O
N
H
C C O O H
H
R 2
H H 2 N C C
H
R 1
O
H N C C O O H
H
R 2
p e p t i d e b o n d
H 2 O
肽键的平面特征
肽结构
6.茚三酮反应（鉴别反应）
O
O
O H
O H
R C C O O
-
N H 3
+
H
O
O
N
O
-
O
+
N i n h y d r i n ? - a m i n o a c i d P u r p l e p r o d u c t ( o r y e l l o w f o r P r o )
在 450nm处有最大吸收
率，在 0.5－ 50μ g / ml
范围内，氨基酸含量与
光密度成正比。
7.羰氨反应,
氨基酸的氨基与糖类的羰基易发
生反应，生成羰氨化合物，进而缩合
成更复杂的棕色到黑色化合物, 类黑
色素, 。食品加工中将这种反应称为
褐变。轻度的褐变可赋予食品一定的
色、香、昧。但生成的黑色素则不能
被细胞利用，也不能被发酵，不仅影
响原料利用率，而且有毒副作用。
8.个别 R基团的反应（略）
从蛋白质水解液中分离制备氨基酸或
者分离分析氨基酸组成，需要分辩力
很强的分离技术。 层析 法是近代生化
中非常有效的常用分离方法。对于氨
基酸混合样品，或者其他各种性质相
近，一般化学方法难以分离的混合样
品，如核苷酸、糖类、蛋白质、维生
素、抗生素、激素。等等，都能使用
层析法达到分离分析的目的。
层析分离是利用混合物中各组分的
物理化学性质（分子形状和大小、
分子极性、吸附力、分子亲和力、
分配系数等）的不同，使各组分以
不同程度分布在两相中，其中一个
是固定相，另一个是流动相，当流
动相流过固定相时，各组分以不同
的速度移动，而达到分离的方法。
层析技术的三个基本构成条件
?水不溶性惰性支持物。
?流动相（能携带溶质沿支持物流动）。
?固定相（附着在支持物上，能对各种
溶质的流动产生不同的阻滞作用）。
层析技术的分类
?按流动相的状态分,液相层析（液
相色谱）、气相层析（气相色谱）。
?按固定相的使用形式分类,柱层析、
纸层析、薄层层析、薄膜层析。
?按分离过程依据的理化性质分类,
吸附层析、分配层析、离子交换层析、
分子筛过滤层析、亲和层析。
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层析技术的应用
对于分子大小不等的化台物，例如含多
种蛋白质的混合液，宜用分子筛过滤分
离；对于能溶于有机溶剂，难溶于水的
化食物，常用吸附层析法分离；对于既
溶于水也溶于有机溶剂的化合物，宜用
分配层析分离；电解质混合物则宜用离
交层析分离。
分配层析技术
分配层析是利用各组分的分配系数不
同而予以分离的方法 。包括纸上层析、
薄层层析、气相层析。
分配系数是指一种溶质在两种互不相
溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质
在两相溶剂的浓度比值。 在层析条件
确定后，分配系数是一个常数。以 K表
示。
流动相中溶质的浓度
固定相中溶质的浓度
?K
分配层析的基本原理
分配层析中，通常采用一种多孔性固
体支持物（如滤纸、硅胶、纤维素粉、
淀粉、硅藻等）吸附着一种溶剂作为
固定相,这种溶剂在层析过程中始终
固定在多孔支持物上。
另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂
可以沿固定 相流动,即流动相。溶质
在流动相的带动下流经固定相时，溶
质在两相之间连续动态分配。由于不
同溶质的分配系数不同而分离。
纸上层析
纸上层析是以滤纸为支持物的一
种分配层析。滤纸能吸收 22％－ 25％
的水，其中 6％－ 7％的水以氢键与滤
纸纤维上的羟基结合，难以脱去。所
以 纸上层析是以滤纸纤维的结合水为
固定相，以有机溶剂为流动相的层析
技术 。由于各物质的分配系数不同，
移动的速率也就不同，从而达到分离
的目的。
纸层析的 Rf值
溶质在滤纸上移动的速率用 Rf值表示,Rf值决定于被分离物质在两相间的分
配系数以及两相间的体积比，在同一
实验条件下，两相的体积比是一个常
数。所以 Rf值决定于分配系数。不同
物质的分配系数不同,Rf值也不同，
由此可以根据 Rf值的大小对物质进行
定性分析。
纸层析的操作
1.样品处理
2.点样
3.平衡
4.展开
5.显色
6.定性分析
7.定量分析
尽可能纯化，调节 pH,浓度 。
将样品溶液用微量注射器点在原点。
在密闭层析缸内用溶液系统的蒸汽将
滤纸饱和。 将滤纸的一端浸入溶剂中，让其沿滤
纸移动。 为了看清斑点，用显色剂显色。
计算 Rf值，进行定性。 剪洗比色、直接比色、面积测量。
离子交换柱层析
离子交换柱层析是用 离子交换剂作
为水不溶性支持物兼固定相,装成层
析柱，用 不同 pH和不同离子强度的
缓冲液作流动相 (洗脱液 )构成的柱层
析技术。这是目前应用非常普遍的
分离技术，无论实验室还是生产领
域都有广泛的实用性。
离子交换剂 是含有若干活性基团的不
溶性高分子物质。即在不溶性母体上
引入若干可解离基团。
不溶性母体,苯乙烯树脂、酚醛树脂、
纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。
引入的活性基团，可以是酸性基团，
也可以是碱性基团。
在不溶性母体上引入酸性基团，如磺
酸基（ -SO3 H）,磷酸基（ -
PO3H2）,亚磷酸基（ - PO2H）、
羧基（ -COOH） 等时，可解离出 H+,
与其它阳离子交换，这种离子交换树
脂属于阳离子交换树脂。
在不溶性母体上引入碱性基团，如季
胺? -N+（ CH3） 3?,叔胺? -N
（ CH3） 2?,仲胺? -NHCH3?,伯
胺? -NH2? 等含氨基的基团，可与
OH-结合后，与其它阴离子交换，属
于阴离子交换树脂。
分配系数（平衡常数）
在一定条件下，离子交换剂所吸附离
子浓度和在溶液中的离子浓度达到平
衡时，两者浓度之比叫做 分配系数
（也叫 平衡常数 ）即,
K值的大小决定样品离子在柱内的保
留时间。如果样品中各离子的 K值差
别足够大，这些离子通过离子交换层
析就可以得到分离。
阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阴
离子只能被阴离子交换剂吸附；亲和
力大的易吸附，难洗脱；亲和力小的
难吸附，易洗脱。
氨基酸的离子交换层析分离
当使用阳离子交换树脂柱时，在
pH2—3的条件下，各种氨基酸都带
正电荷，都能交换，上柱。与树脂的
静电亲和力大小依次为：碱性氨基酸
（ A2+）＞ 中性氨基酸 (A+)＞ 酸性氨基
酸 (A± )。
当用缓冲液洗脱时，随 pH由低到高，
氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性
氨基酸先流出，其次是中性氨基酸，
最后是碱性氨基酸。 同种性质的氨基
酸,R基团与树脂间亲和力小者先流出，
大者后流出。
离子交换层析技术的自动化
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蛋白质的一级结构
蛋白质分子是蛋出质的具有完整生
物功能的最小结构单位。
1952年丹麦人 Linderstrom-Lang最早
提出蛋白质的结构可以分成四个层次,
? 一级结构,氨基酸序列
? 二 级结构,α -螺旋,β -折叠
? 三 级结构,所有原子空间位臵
? 四 级结构,蛋白质多聚体
一级结构又叫初级结构、基本化
学结构或共价结构。 1969年国际纯
粹与应用化学联合会 (IUPAC)定义为：
一级结构即肽链中的氨基酸顺序。
一级结构是高级结构的化学基础，
也是认识蛋白质分子生物功能、结构
与生物进化的关系、结构变异与分子
病的关系等许多复杂问题的重要基础。
研究一级结构需要阐明的内容包括,
?（ 1）蛋白质分子的多肽链数目。
?（ 2）每条肽链的末端残基种类。
?（ 3）每条肽链的氨基酸顺序。
?（ 4）链内或链间二硫键的配臵等。
多肽链
氨基酸通过肽键 连接起来的链状
物根据其长短称为寡肽、短肽、多肽
和蛋白质，很多场合多肽和蛋白质可
以等同使用。
研究蛋白质的 一级结构,就是要
将氨基酸的排列顺序搞清楚。
四十年代起，许多人不遗余力
从事蛋白质的一级结构研究。
一级结构研究史上的两个第一
?1954年英国生化学家 Sanger报道了
胰岛素的一级结构，是世界上第一例
确定一级结构的蛋白质。 Sanger由此
1958年获 Nobel 化学奖。
?1965年我国科学家完成了结晶牛胰
岛素的合成，是世界上第一例人工合
成蛋白质。
多肽链的结构
一级结构中的二硫键
分析一级结构的一般程序
一级结构的分析是一项非常细致
而又复杂的技术上作，基本工作程序
是,
（ 1）将蛋白质纯化，测定末端组成。 （ 2）拆分蛋白质分于并将多肽分离
纯化。
（ 3）用酶法或化学方法进行专一性
切割，得到系列长短不一的肽段。
（ 4）将肽段分离，通过末端分析方
法测定各肽段的氨基酸顺序。
（ 5）根据二肽段的顺序重叠关系确
定各个肽段的衔接顺序。排出完整
多肽链的氨基酸顺序。
（ 6）确定二硫键的位臵。
Sanger试剂 (FDNB)标记 N末端
ABCDE
↓
*ABCDE
↓
*A,*AB,*ABC,*ABCD,*ABCDE
↓
*A,*A+B,… … *A+B+C+D+E
↓
*A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E
1 2 3 4 5 结论, A B C D E
一级结构与蛋白质功能的关系
一级结构中，有的部位保守性很强，
既不能缺失，也不能更换，否则就
会丧失活性；有的部位则可以改变，
切除或更换别的残基都不影响生物
活件；还有的部位必须切除之后，
蛋白质分子才显活性。不同部位的
残基对功能的影响，实质是影响了
蛋白质分子特定的空间构象的形成。
许多先天性疾病是由于某一重要的
蛋白质的一级结构发生了差错引起
的。如血红蛋白 β 亚基 6 位 Glu被
Val代替（基因突变），即表现为
镰刀状贫血，为世上最常见的血红
蛋白病。
比较不同生物细胞色素 C的一级结
构可以帮助了解物种间的进化关
系，物种间越接近，则细胞色素 C
的一级结构越相似
牛胰岛素分子的激活,
天然活性肽
除了蛋白质水解可以产生长短不
等的肽段之外，生物体内还有很多游
离存在的小分子活性肽，各具有一定
的生物功能。有些活性肽属于激素类，
如催产素、加压素等都是九肽。
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蛋白质的空间结构
所谓蛋白质分子的空间结构是指分子的 构
象 而言。构象与构型都是立体化学结构概
念，但含义不同。 构型是由于化合物分子
中某一不对称碳原子上四种不同的取代基
团（或原子）的空间排列所形成的一种光
学活性立体结构。 一个不对称碳原子只能
形成两种不同的构型。分子从一种构型变
为另一种构型，例如从 D-丙氨酸变为 L-丙
氨酸，必须发生共价键的变化（断裂和另
生成）。
构象是分子内所有原子或原子团的空间排
布所形成的 —种立体结构。 这类立体结构
不需要共价键断开，只要分产中发生 C－ C
单键的转动就能从一种构象变为另 —种构
象。如此说来，蛋白质分子该有无数构象
了，其实不然。研究证明，天然蛋白质分
子都有与其生物活性相关的一种或少数几
种特定的构象，这种天然构象相当稳
定。 —定条件下，将蛋白质分子从细胞中
分离出来，仍能保持其天然构象和生物活
性。
维系蛋白质分子构象的化学键
蛋白质的二级结构
二级结构,多肽链中各原子在局部空
间或一段肽链的氨基酸残基的空间排
布方式。 为主链构象，不涉及侧链构
象。包括 α -螺旋,β -折叠以及 β -转角，
这些主链基本构象都是以酰胺平面
（或称肽键平面、肽单元）为基本结
构单位，有规则的盘曲而成的。也存
在部分无规则卷曲。
肽键平面
肽键平面
肽链中的肽键平面
两个肽平面以
一个 Cα 为中心
发生旋转
蛋白质 -α 螺旋结构
?右手螺旋 (顺时针 )。
?肽链的主链形成紧密的螺旋,侧链伸
向外侧，每一圈包含 3.6个氨基酸残基,
每个残基跨距为 0.15nm,螺旋上升一
圈的距离 (螺距 )为 3.6× 0.15=0.54nm，
环内原子数 13。
?螺旋通过氢键维持稳定。第一个肽
键的 NH和第四个肽键的 CO形成氢键,
第 n个肽键的 NH和第 n+3个肽键的 CO
形成氢键。氢键取向与主轴基本平行。
α -螺旋结构形成的限制因素
?凡是有 Pro存在的地方,不能形成。因 Pro
形成的肽键 N原子上没有 H,不能形成氢键。
?静电斥力。若一段肽链有多个 Glu或 Asp
相邻,则因 pH=7.0时都带负电荷,防碍 α 螺
旋的形成 ;同样多个碱性氨基酸残基在一段
肽段内,正电荷相斥,也防碍 α 螺旋的形成。
?位阻。如 Asn,Leu侧链很大，防碍 α 螺
旋的形成。
蛋白质 β—折叠 结构
β -折迭又叫 β -折迭片或 β -片层结构，
也是蛋白质分子中常见的主链构象之
一。所谓 β -折迭是两条或两条以上充
分伸展成锯齿状折迭构象的肤链侧向
聚集，按肽链的长轴方向平行并列，
形成的折扇状构象。 β -折迭构象靠相
邻肽链主链亚氨基（ NH） 和羰基氧原
子之间形成有规律的氢键联结维系。
平行式
N端
N端
平行式与反平行式
蛋白质的 β -转角结构
又叫 U型回折,β -转弯或发夹结构。
是近年来在球状蛋白质分子中发现的
一种主链构象。球状蛋白质分子主链
在盘曲折迭运行中往往发生 180°的急
转弯，这种回折部位的构象即所谓 β -
转角。 β -转角是由 4个连续的残基组
成的，第一个残基的羰基与第四个残
基的亚氨基间形成氢键联结，稳定构
象。
二级结构的多元性
球状蛋白质分子的二级结构一般都不
是单一构象。主链的不同段落构象不
同，多种构象单元交替连接组成整条
肽链的二级构象。
蛋白质的三级结构
蛋白质分子在一、二级结构基础
上，再进行三维空间的多向性盘曲折
迭。形成特定的近似球状的构象，称
为步白质分子的三级结构。根据 l 969
年 IUPAC的定义，三级结构包括蛋白
质分子主链和侧链所有原子或原子团
的空间排布关系。
蛋白质三级结构的构象特点
（ 1）三级结构构象近似球形。
（ 2）分子中的亲水基团相对集中在球形
分子的表面，疏水基团相对集中在分子内
部，形成所谓, 亲水表面，疏水核, 。
（ 3）三级结构构象的稳定性主要靠疏水
相互作用维系。亲水表面能吸附形成厚厚
的水化膜和双电层，对蛋出质分子构象起
很好的保护作用。
（ 4）三级结构形成之后，蛋白质分子的
生物活性部位就形成了。
结构域
有些较大的球状蛋白质分子或亚
基，常常先由几个二级结构单元组合
在一起形成超二级结构，以此作为形
成三级结构的实体，这些超二级结构
实体称为结构域，又叫辖区。结构域
进一步缔合则形成近似球形的三级结
构。
蛋白质的四级结构
有些球状蛋白质分子是由两个或两个
以上的三级结构单位缔合而织成的，
通常称为寡聚蛋白。寡聚蛋白分子中
的每个三级结构单位称为一个亚基
（或亚单位）。 所谓蛋白质分子的四
级结构就是指寡聚蛋白质分子中亚基
与亚基间的立体排布及相互作用关系，
亚基的数目和类型也属四级结构研究
的内容，但不涉及亚基本身的构象。
两个亚基的结构
血红蛋白
寡聚蛋白质分子的亚基组成
据统计，已经研究过的寡聚蛋白
质分子达 700多种。它们的亚基数目
差别很大，少则几个，多则十几个，
数十个。大多数寡聚蛋白质是由偶数
亚基组成的。其中，两个或四个亚基
者最多。奇数亚基的分子很少见。
亚基类别组成有两种类型。一种是
由相同亚基组成的均一寡聚蛋白，如过
氧化氢酶，是由四个相同亚其组成的四
聚体，每个亚基的一、二、三级结构都
相同，功能也相同。另一种是由结构不
同的亚基组成的非均 —寡聚蛋白，如血
红蛋白（ α 2β 2）。
维持四级结构稳定的因素为各亚基
之间的作用力如氢键、离子键、疏水键。
含有四级结构的蛋白质，单独的亚
基一般没有生物学功能，只有完整的四
级结构才有生物学功能。
蛋白质的一、二、三、四级结构
蛋白质分子构象与功能的关系
蛋白质分子的构象并不是固定不变的。
许多蛋白质在表现其生物学功能时，
构象发生变化，从而改变了整个分子
的性质，这种现象称为 变构现象 。血
红蛋白在表现其输氧功能时的变构现
象就是一个典型的例子。
1.血红蛋白的结构与功能的关系
血红蛋白是由两个 α -亚基和两个
β -亚基组合而成的四聚体。血红蛋白
的亚基中分子各有一个血红素，能结
合一分子 O2 。 血红蛋白的亚基之间
相互作用形成了稳定的四级结构，使
其中的血红素与 O2的亲和力变得很弱。
当血红蛋白分子中一个亚基的血红素
与 O2结合，立即引起该亚基的构象发
生改变，这种构象变化随即通过亚基
间的次级键引起另外 3个亚基的构象相
继改变，结果改变了整个分子的构象，
使所有尚未与 O2结合的亚基都变成适
宜于与 O2结合的构象，从而使血红蛋
白的氧合速度大大加快。
O2
Hb
Hb- O2
O2
血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线
活动肌肉毛细血
管中的 PO2
0 20 40 60 80 100
肺泡中的 PO2
Myoglobin
Hemoglobin
2.核糖核酸酶 S的空间结构与功能的关系
核糖核酸酶 S三维结构的形成与维系也
有赖于多肽链内部的 4个二硫键,60年
代初，有人在含有巯基乙醇的 8mol／ L
尿素溶液中还原二硫键，使核糖核酸酶
S变性失活，然后透析除去尿素和巯基
乙醇。
在含有氧和痕量巯基乙醇的水溶液中，
变性的核糖核酸酶 S结构由伸展的肽链
自动折叠，重新形成的二硫键配对完全
正确，酶活性几乎恢复到原有的水平。
这个实验充分证明了蛋白质的功能取决
于其特定的天然构象，而规定其构象所
需要的信息包含在它的氨基酸序列之中。
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蛋白质的重要理化性质
因为蛋白质是氨基酸组成的，所以，
氨基酸的许多理化性质必然反映到蛋
白质上。如两性解离和等电点、成酯
反应、成盐反应、一些显色反应、光
吸收性质等在蛋白质上都有所表现。
不仅如此，从氨基酸小分子到蛋白质
大分子已经发生了质的变化，所以，
蛋白质又具有氨基酸所不具备的许多
性质。
1.蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子，相对分子质量
一般都在 1－ 100万之间，其颗粒大小属于
胶体粒子的范围。 蛋白质水溶液是一种比
较稳定的亲水胶体,这是因为蛋白质颗粒
表面带有很多极性基团（亲水基团向外翻，
疏水基团向内钻），在蛋白质颗粒外面形
成一层水膜（水化层）；另外蛋白质颗粒
在非等电点状态时带的相同电荷，使蛋白
质颗粒间相互排斥，不致相互凝聚沉淀。
蛋白质胶体性质的应用
透析法,利用蛋白质不能透过半透膜的
的性质，将含有小分子杂质的蛋白质
溶液放入透析袋再臵于流水中，小分
子杂质被透析出，大分子蛋白质留在
袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这
种方法称为透析（ dialysis）。
膜分离与超滤技术, 透析是一种膜过滤
技术，曾为生物大分子的分离纯化起过
重要作用。 70年代以来．随着合成滤
膜的发展，膜过滤技术发展很快，其中，
超滤技术已经于蛋白质溶液的浓缩、纯
化及分级分离。超滤是一种加压膜过滤
技术，它是利用具有选择透过性的微孔
滤膜，在液压作用下迫使小分子水和无
机盐等透过膜，大分则被阻留在膜的内
侧，从而达到分离纯化的目的。
2.蛋白质的两性解离和等电点
蛋白质等电点的应用
等电沉淀技术,在等电点 pH条件下，
蛋白质为电中性，比较稳定。其物理
性质如导电性、溶解度、粘度、渗透
压等都表现为最低值，易发生絮结沉
淀。因此，等电点性质常被用于蛋白
质的分离制备，被称为等电沉淀技术。
电泳技术, 在溶液 pH值不等于等电
点的条件下，蛋白质分子显电性，在
直流电场中向其所带电荷相反的电极
泳动。根据这一原理建立了将带电性
质不同的蛋白质混合物，在直流电场
中进行电泳分离的技术，称力蛋白电
泳。蛋白质电泳技术也是蛋白质分离
制备、分析鉴定中常用的一种实验手
段。
3.蛋白质的变性作用
在某些物理化学因素作用下，蛋白质
分子内部的次级键断裂，二、三级空
间结构被破坏，分子的紧密构象变成
了松散的无序状态。天然构象破坏，
从而引起理化性质改变，生物活性丧
失。叫做蛋白质的变性作用。
注意,蛋白质变性后一级结构没有发
生变化。只是空间构象发生变化。
造成蛋白质变性的因素：强酸、强碱、
尿素、重金属盐、乙醇、加热、紫外
线,X线等。
变性
复性
注意,并不是所有变性蛋白都可以复
性的！
变性蛋白质的性质
?理化性质发生了变化，旋光性改变，
粘度增加，光吸收性质增，强失去了
结晶能力，溶解度降低，易发生凝集、
沉淀。由于侧链基团外露，颜色反应
增强。
?生化性质发生了变化，变性蛋白质
比天然蛋白质易被蛋白酶水解。
?生物活性丧失，这是蛋白质变性的
最重要的明显标志之一。
4.蛋白质的沉淀作用
蛋白质胶体溶液的稳定性是有条
件的、相对的。假若改变环境条件，
破坏其水化膜和表面电荷，蛋白质亲
水胶体使失去稳定性，发生絮结沉淀
现象。这即所谓蛋白质 沉淀作用 。
本本本 课课课 件件件 由由由 西西西 华华华 大大大 学学学 生生生 物物物 工工工 程程程 学学学 院院院 车车车 振振振 明明明 制制制 作作作
蛋白质的沉淀性质的应用
盐溶与盐析,
在蛋白质溶液中加入中性盐（如
NaCl、（ NH4） 2SO4等）时，可产生
以下两种现象：在盐浓度很稀的范围
内，随着盐浓度增加，蛋白质的溶解
度亦随之增加，这种现象称 盐溶 。盐
溶作用的发生是由于蛋白质表面电荷
吸附盐离子之后，增强了蛋白质和水
的亲和力，促进蛋白质的溶解。
与盐溶作用相反，当溶液中盐浓度提
高到一定的饱和度时，蛋白质溶解度
逐渐降低，蛋白质分子发生絮结，成
沉淀析出，这种现象称为 盐析 。
盐析作用的发生机理很复杂，一
般认为中性盐与水的亲和力大，又是
强电解质，当一定高浓度的中性盐加
到蛋白质溶液中时，一方面结合大量
自由水，降低水分活度；一方面又夺
取蛋白质表面的水化膜，增强蛋白质
分子之间互相作用的机会，促其聚集
絮结成沉淀析出。
利用盐析的原理，加中性盐使蛋白质
沉淀的方法叫做 盐析沉淀法 。
不同蛋白质表面电荷量不同，水
化膜的厚度不一样，盐析所需要的中
性盐浓度也不一样，一般而言，相对
分子质量大的容易盐析，相对分子质
量越小，所需盐浓度越高。根据这种
性质，同一溶液中不同相对分子质量
的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的
方法逐一沉淀分离出来，这种方法称
为分级盐析。
等电点盐析沉淀,盐析与等电点结合
沉淀效果更好。一般是先将蛋白质溶
液的 pH调至目的蛋白质的等电点。然
后再加固体 (NH4)2SO4或其饱和溶液，
使达到一定浓度后，蛋白质即可沉淀
析出。
有机溶剂沉淀,
水溶性有机溶剂如丙酮、乙醇等，
具有介电常数比较小，与水的亲和力
大，能以任何比例与水相溶等特点。
当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶
剂时，它能夺取蛋白质颗粒表面的水
化膜，同时，还能降低水的介电常数，
增加蛋白质颗粒间的静电相互作用，
导致蛋白质分子聚集絮结沉淀。
与盐析法类似，沉淀所需有机溶剂的
浓度也与蛋白质相对分子质量有关，
相对分子质量大的要求浓度低，相对
分子质量小的要求浓度高。不同相对
分子质量的混合溶液，可以通过调节
有机溶剂的浓度达到分级沉淀的目的。
等电点有机溶剂沉淀,
有机密剂沉淀法若与等电点结合，
沉淀更易发生，而且彻底。先将提取
液 pH调至目的蛋白质的等电点、再加
有机溶剂到所得要的浓度，蛋白质会
很快沉淀析出。
注意,在对蛋白质的影响方面，与盐
析法不同。有机溶剂长时间作用于蛋
白质会引起变性，因此，用这种方法
进行操作时需要注意：（ 1）低温操作。
（ 2）有机溶剂与蛋日质接触时间不能
过长，在沉淀完全的前提下，时间越
短越好。
失活沉淀,
重金属盐沉淀,当溶液 pH大于等
电点时，蛋白质颗粒带负电荷，易与
重金属离子（ Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+
等）结合，生成不溶性盐类，沉淀析
出。误服重金属盐的病人，大量口服
牛奶、豆浆或蛋清能够解毒，就是因
为这些食物中的蛋白质与重金属离子
形成不溶性盐，经催吐剂呕吐排出体
外。达到解毒的目的。
生物碱试剂沉淀,当溶液的 pH低于等
电点时，蛋白质分产是阳离子形式存
在。易与生物碱试剂（如苦味酸、鞣
酸、磷钨酸、磷钼酸及三氯醋酸等）
作用。生成不溶性盐沉淀，并伴随发
生蛋白质分子变性。实验室中常用这
些试剂定性检验蛋白质或去除蛋白。
在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类
物质与蛋白质成盐沉淀，使麦汁得以
澄清，防止成品啤酒混浊。
热凝固沉淀,蛋白质受热变性后，将
pH调至等电点，则很容易发生凝固沉
淀。其原因是：由于变性蛋白质的空间
结构解体，疏水基团外露，水化膜破坏，
同时由于等电点破坏了带电状态等而发
生絮结沉淀。我国传统的做豆腐工艺是
将豆浆煮沸，点入少量盐卤（含 MgCl2）
或石膏（含 CaSO4）,或者点入酸浆或
葡萄糖酸内酯将 pH调至等电点，热变
性的大豆蛋白使很快絮结凝固，经过滤
成型则成豆腐。
5.蛋白质的颜色反应
（ 1） 双缩脲反应 双缩脲是由两分子
尿素缩合而成的化合物。将尿素加热
到 180℃,则两分子尿素缩合成一分
子双缩脲，并放出一分子氨气。
双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应
产生红紫色络合物，该反应称为 双缩
脲反应 。蛋白质分子中含有许多和双
缩脲结构相似的肽键，因此也能起双
缩腺反应，形成红紫色络合物。通常
可用此反应定性蛋白质，也可根据反
应产生的颜色在 540nm处比色，定量
测定蛋白质。
（ 2） Millon（ 米伦）, 反应米伦试剂
为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸
的混合液。蛋白质溶液中加入米伦试
剂后立即产生白色沉淀，再加热后，
沉淀变成红色。酚类化合物有此反应，
酪氨酸含有酚基，故含有酪氨酸的蛋
白质都有此反应。
（ 3）黄色反应,这是含有酪氨酸和
色氨酸等芳香族氨基酸所特有的反应。
蛋白质溶液遇硝酸后，先产生白色沉
淀，加热则白色沉淀变成黄色，再加
碱，颜色加深成桔黄色。这是因为硝
酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生
了黄色硝基苯衍生物。例如皮肤、指
甲和毛发等遇浓硝酸会变成黄色。
（ 4）乙醛酸反应,在含有蛋白质的
溶液中加人乙醛酸，并沿试管壁慢慢
注人浓硫酸，在两液层之间会出现紫
色环，凡含有吲哚基的化合物都有这
一反应。色氨酸及含有色氨酸的蛋白
质有此反应，但不含色氨酸的白明胶
就无此反应。
（ 5）茚三酮反应,蛋白质和氨基酸
一样，也能与水合前三酮反应，生成
蓝紫色化合物。实践中常利用这一反
应来检测蛋白质的存在。但不能区别
蛋白质与氨基酸。
（ 6） Folin（ 福林） -酚试剂反应,蛋
白质分子一般都含有酪氨酸，酪氨酸
中的酚基能将福林 -酚试剂中的磷钼酸
及磷钨酸还原成蓝色化合物（即钼蓝
和钨蓝的混合物）。这一反应常用来
定量测定蛋白质的含量。
（ 7）坂口反应, 蛋白质分子中的精
氨酸含有胍基，能与次氯酸钠或次溴
酸钠及 a-萘酚在氢氧化钠溶液中产生
红色物质。此反应用以测定精氨酸或
含有精氨酸的蛋白质。
6.蛋白质的紫外吸收
一般蛋白质在 280nm波长处都都最大
的吸收率，这是由于蛋白质中有酪氨
酸、色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故。
通常利用这些特异性的吸收，可以测
定蛋白质的浓度，如果没有干扰物质
存在的话，可用来测定浓度为 0.1一
0.5mg／ ml的蛋白质溶液。
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蛋白质相对分子量的测定
小分子化合物相对分子质量的测定方法
冰点降低法、沸点升高法或蒸汽压减小法
蛋白质是大分子胶体物质，这些方法不适用。
常用方法有,
化学分析方法
超离心沉降速度法 凝胶过滤层析法
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
超离心沉降速度法
对蛋白质溶液进行 5－ 6万 r/min的高
速离心，蛋白质分子会向离心池底部
方向移动，离心池上面为清液，清液
与下面的溶液之间出现一个界面。用
光学方法测定界面移动的速度，即为
蛋白质的 离心沉降速度 。根据下面的
公式可求出溶质的 沉降系数 。
xdt
dx
S
2
1
?
??
?x－－ 界面移动距离
?t－－ 离心时间
?ω －－ 角速度
?S－－ 沉降系数
由沉降系数 S可根据斯维得贝格
（ Sved berg） 方程计算相对分子质量。
)1( ??
?
?
?
D
R TS
M
都可以通过实验求出。、、、
））的密度（－溶剂（一般用缓冲液
－扩散系数
比容约为
质溶于水的偏微分溶液体积的增量，蛋白体积的溶剂中时，即一克溶质加到一个大－分子偏微分比体积，
－绝对温度
）－气体常数（
－
－
??
?
?
??
DS
D
KT
KJR
D
R T S
M
3
3
g / c m
.g/cm74.0
)(
m ol/314.8
)1(
?
?
?
?
沉降系数 S的意义与应用
沉降系数 S是文献中经常使用的物理量。
其物理意义是溶质颗粒在单位离心场中
的沉降速度，量纲为秒。一个 S单位是
l× 10-13s,相对分子质量越大,S越大。
蛋白质的沉降系数大都在 1—200S之间。
当一种新发现的大分子，其结构、性质
和功能都处在研究过程中时，其名称未
定，为了描述方便，常用其沉降系数 S来
表示。
凝胶过滤法
葡聚糖凝胶过滤法是测定蛋白质相对分子
质量常用的方法之一，葡聚糖凝胶颗粒有
三维网状结构，一定型号的凝胶网孔大小
一定。只允许相应大小的分子进入凝胶颗
粒内部，大分子则被排阻在外。洗脱时大
分了随洗脱液从颗粒间隙先流下来，洗脱
液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来
穿去，历程长，迟后洗脱下来，所以洗脱
体积大。
若用多种已知相对分子质量的标准蛋
白质准确测得各自的洗脱体积（ Ve），
以 Ve对相对分子质量对数作图，得标
准曲线，再用同样条件测定未知样品
洗脱体积（ Ve）,从标准曲线上可查
出样品蛋白质的相对分子质量。凝胶
过滤法可测定（ 1—80）万范围内的
相对分子质量，误差为± 5％。但对
变性蛋白和线性分子不适用。
化学分析方法
此法是测定特征性化学成分，计
算最低相对分子质量。 首先利用化学
分析方法则定蛋白质中某一持殊成分
（某种元素或某种氨基酸）的百分含
量。然后，假定蛋白质分子中该元素
共有一个原子（或一分子某种氨基
酸），据其百分含量可计算出最低相
对分子质量。
例如，测得细胞色素 c的铁元素含
量为 0.43％，已知铁相对原子质量为
55.8，则最小相对分子质量（ M） 为,
M＝ 55.3× 100/0.43≈13000
因为细胞色素 c分子只有一个铁卟
啉辅基，所以，计算结果与其他方法
测得的真实相对分子质最相当。
如果蛋白质分子中所含已知成分不是
一个单位，则真实相对分子质量等于
最小相对分子质量的倍数。例如，血
红蛋白分了中含铁 0.335％，计算出其
最低相对分子质量为 1.67万。只相当
于其他方法所得血红蛋白相对分子质
量的 1/4。可见，血红蛋白分子中实际
含有 4个铁原子，其真实相对分子质量
为最小相对分子质量的四倍。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
普通蛋白质电泳的泳动速率取决予荷
质比。若将蛋白质在烷基十二酯硫酸钠
（ SDS） 溶液中于 100℃ 热处理，并加巯基
化合物将二硫键打开。则蛋白质变性，伸
展成棒状并与 SDS结合而带上大量的负电荷，
这样一来，蛋白质分子本身的原有电荷就
相对地不重要了。所结合的大量 SDS负电荷
决定着分子的带电性质。蛋白质分子大，
结合 SDS多；分子小，结合 SDS少。因此，
不管分子大小，荷质比是相同的。
在上述情况下，荷质比对不同分子量
的 SDS-蛋白质的电泳迁移率的影响不
会有什么差别了。凝胶的分子筛效应
对长短不同的棒形分子会产生不同的
阻力，这是影响迁移率的主要因素。
同一电泳条件下，分子小，受阻小，
泳动快，迁移率大。相对分子质量大
者，迁移率小。
进行 SDS-蛋白电泳时，用一种染料
（如溴酚蓝或甲基绿）作为前沿标志。
电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距
离和原点到前沿距离的比值,
原点到前沿的距离
蛋白质分子移动的距离?
?
S D S
R?
μ R与相对分子质量的对数成一定比
例关系，测定几种已知标准相对分子
质量的 μ R,并对相对分子质量对数作
图，得一直线。根据未知相对分 子质
量的 μ R可从图上查得相对分子质量。
这种 方法速度快，样品用量 少，缺
点是误差大，误 差来源于迁移距离的
测量。
重点复习,
1.氨基酸种类、结构特征、性质；
2.蛋白质结构、结构与功能的关系；
3.等电点理论及其应用；
4.蛋白质变性理论及其应用；
5.氨基酸、蛋白质分离纯化技术的基
本原理。
6.氨基酸、蛋白质的主要鉴别反应。
Hi
下课了！
