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第十一章 核酸的体外扩增
聚合酶链式反应
连接酶链反应
RNA的体外扩增
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第一节 聚合酶链式反应
polymerase chain reaction
PCR
第十一章
3
PCR的发明,
发明人,Kary Mullis。 1983年,Mullis着手解决用简单
的方法鉴定某一段 DNA的技术问题,有一天晚上他驱
车在北部加州 101号高速公路上,灵机一动想到了一个
实际上可以无限扩增某段 DNA的简单方法,即 PCR。
1985年的一次学术会议上,此方法首次被介绍,在分
子生物科学家中引起了巨大的反响。大家很快地纷纷
采用这个方法,很多人还很奇怪自己怎么没有首先想
到这么做。随后 Cetus给了 Mullis一万美元的奖金,然
后把这项技术的专利以三亿美元的价格转让给另一家
生物技术公司。 1993年,Mullis因此获得诺贝尔化学奖。
第十一章
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Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一
文中写到,,这种简单得令人惊奇,可以无限
量地拷贝 DNA片段的方法是在不可想象的情况
下,即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公
路上时想出来的”。
在短短的几年内,PCR迅速成为分子生物学的
一项常规手段,被许多科学家视为近十年来
分子生物学领域最重要的一项突破。此技术
能够特异地扩增任何所希望的目的基因或
DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古
等方面有重要的应用价值,并对分子生物学
技术的发展给予巨大的推动。
第十一章
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一, PCR的基本原理
类似于 DNA的体内复制。首先待扩增
DNA 模板加热 变性 解链,随之将反应混
合物冷却至某一温度,这一温度可使引
物与待扩增 DNA发生 退火,再将温度升
高使退火引物在 DNA聚合酶作用下得以
延伸 。 这种变性 -复性 -延伸的过程就是
一个 PCR循环,PCR就是在合适条件下的
这种循环的不断重复 。
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?flash
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㈠ DNA模板变性
双链 DNA是通过 95℃ 左右的高温使其发生变性,
形成单链 DNA。
㈡ 模板与引物退火
45~ 55℃, 两个寡核苷酸引物分别与待扩增 DNA两
端的序列互补。
㈢ 引物延伸 72℃ 左右
在 4种 dNTP底物及 Mg2+存在条件下, DNA聚合酶
将单核苷酸从引物 3′端掺入, 沿模板延伸合成新股
DNA,每一循环的产物可作为下一循环的模板 。
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以上所述的变性, 退火, 延伸
,三步曲, 被确定为 PCR的一轮循
环, 整个 PCR过程一般需进行 25-30
轮的循环 。
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PCR flash
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二,PCR引物的设计
引物
引物是指与待扩增靶 DNA两端序列
互补的寡核苷酸,两段引物分别与
相应的一条 DNA链 3’端及 5’端互补。
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引物的设计一般遵循下列原则,
1,上游引物与目的 DNA5’端序列完全相同;
下游引物与目的 DNA3’端序列互补
2,引物长度以 15-30个碱基为益;
G+C含量为 45-55%
3,引物内、引物间不应有互补序列
4, 碱基分布随机
5,引物与非特异扩增区的同源性不超过 70%
6,3′端必须互补,5′端可游离
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三、模板的制备
DNA
1.从细胞中提取 DNA,血细胞、绒毛、尿样、
毛发、精斑、口腔上皮细胞
2.固定和包埋的组织标本:脱蜡、蛋白酶 K消

RNA
新鲜组织或细胞
所用器皿和试剂必需经高温灭菌或 DEPC处

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四,PCR的基本反应
(一)、以 DNA为模板的反应,
10× 缓冲液 10 ?l
4种 dNTP混合物 各 200 ?mol/L
引物 各 10~ 100 pmol
模板 DNA 0.1~ 2 ?g
Taq DNA聚合酶 2.5 u
Mg2+ 1.5 mmol/L
加双蒸水至 100 ?l
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PCR反应五要素, 引物,酶, dNTP、
模板和 Mg2+
Taq DNA聚合酶
来自水生栖热菌 Thermusaquaticus
良好的耐热性
Mg2+依赖性
无校正功能
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( 二)以 mRNA为模板的反应
mRNA 5 ?l
5× Buffer 4 ?l
dNTP 2 ?l(10mmol/L)
RNasin 1 ?l(20u)
逆转录酶 1 ?l(10u)
Oligo(dT)12-18(或下游引物 ) 1 ?l
ddH2O 6?l /20 ?l
42℃ 水浴 1小时,95 ℃ 水浴 10分钟灭活
逆转录酶。向上述反应体系中添加如
下试剂,
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10× Buffer 5 ?l
25mmol/L Mg2+ 3?l
Taq酶 0.5 ?l( 2.5u)
上游引物 1?l
ddH2O 20.5?l /50 ?l
按 PCR循环参数进行
RT--PCR
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(三 ) PCR产物的积累规律
– DNA扩增过程遵循酶促动力学原理。
– 反应初期,目的 DNA片段呈指数形式
( 2n),随着目的 DNA的积累,在引
物 — 模板与 DNA聚合酶达到一定比例
时,酶的催化反应趋于饱和 — 平台期 。
( 30个循环),平台效应”出现的迟
早主要取决于起始模板的拷贝数、所
用的 DNA聚合酶的性能及底物 dNTP
的浓度等多种因素。
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(四) PCR反应的自动化
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五,PCR反应条件的控制
(一) PCR反应的缓冲溶液
提供合适的酸碱度和某些离子
10~ 50mmol/L Tris-HCl缓冲液
50mmol/L KCl
BSA或明胶
(二)镁离子浓度
TaqDNA聚合酶活性需要 Mg2+,
Mg2+浓度过高导致非特异扩增。
一般常用 1.5mmol/L
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(三)底物浓度
dNTP浓度在 20~ 200 ?mol/L
四种 dNTP必须浓度相等
(四) Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在 70~ 80℃ 具有最高聚合活

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(五)引物
引物浓度一般为 0.1~ 0.5?mol/L
( 六)反应温度和循环次数
1,变性温度和时间 95℃ / 30 ~ 60s
2,退火温度和时间 45~ 55℃ /30 ~ 60s
3,延伸温度和时间 72℃ 1min 3min
4,循环次数 25~ 30 不超过 35
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六,PCR中应注意的事项
PCR反应中可能出现的问题,
? 假阴性,不出现扩增条带
? 假阳性 出现非特异扩增带
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(一)防止污染
试剂小量分装
吸头及 EP管一次性使用
器皿及工作区域要分开,无菌操作
( 二)设立对照,
阳性对照,阳性模板
阴性对照,阴性模板
试剂对照,除模板外的所有组分
注意的事项,
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七,PCR反应的特点
1.特异性强,
2.灵敏度高, PCR产物的生成量是以指数方式增
加的,能将皮克 (pg=10-12g)量级的起始待测
模板扩增到微克 (?g=10-6g)水平
3.简便、快速, PCR反应一般在 2~ 4 小时完成
扩增反应。扩增产物一般用电泳分析 。
4.对标本的纯度要求低,
不需要分离病毒或细菌及培养细胞,
DNA 粗制品及总 RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、
洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA扩增检测。
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八,PCR技术的主要类型
㈠不对称 PCR ㈥ 差异显示 PCR
㈡ RT-PCR ㈦ 单链构象多态性 PCR
㈢ 锚定 PCR ㈧ 俘获 PCR
㈣ 反向 PCR
㈤ RAPD
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一, 不对称 PCR(asymmetric PCR)
1.原理:二种不同浓度的引物 (50:1),25
个循环, 低浓度的引物耗尽, 高浓度的
引物介导 PCR反应, 结果产生大量单链
DNA。
2.用途:快速大量地制备单链 DNA(杂交
探针 ) 。
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二, 逆转录 PCR (reverse transcription
PCR,RT-PCR)
1.原理,RT-PCR先在逆转录酶的作用
下以 mRNA为模板合成 cDNA,再以
cDNA为模板加入 dNTP和两种特异引
物及 Taq酶进行 PCR反应, 这样低浓度
的 mRNA被扩增放大易于检测 。
RT-PCR中的关键步骤是 RNA的逆
转录, 要求 RNA模板必须是完整的,
且不含 DNA,蛋白质等杂质 。
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三、锚定 PCR(anchored PCR,A-
PCR)
原理:在基因未知序列端添加同聚物
尾,人为赋予未知基因末端序列信
息,再用人工合成的与多聚尾互补
的引物作为锚定引物,在与基因配
对互补结合后进行 PCR扩增。
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四, 反向 PCR (inverse PCR,
IPCR)
IPCR是扩增已知 DNA序列两侧的
未知序列 。 其原理是:用限制性内
切酶消化 DNA,然后环化切割的产
物, 再用切割后已知序列上两端相
反方向的引物序列进行 PCR,也可
将环化 DNA线性化后再进行 PCR。
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第十一章
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五, 随机引物 PCR (AP-PCR,RAPD)
1.原理,RAPD是利用一系列不同的随
机排列的寡核苷酸链为引物 (随机引物 ),
对所研究基因组 DNA进行 PCR扩增,扩
增产物通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电
泳分离,检测扩增 DNA片段多态性。
2.用途:用于进行基因组指纹图谱的构
建,并利用指纹图谱进行品种鉴定和对
物种进行亲缘关系和系统进化的研究。
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六, 差异显示 PCR(differential
display,DDRT-PCR)
原理:见图
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七, 单链构象多态性 PCR (SSCP-PCR)
原理:单链 DNA分子因单一核苷酸不
同, 其二级结构有所差异, PCR产物
常表现在非变性凝胶电泳中电泳迁移率
不同 。 通过比较 DNA的电泳类型, 即
可测出突变 。 其优点是所需样品 DNA
量极少, 灵敏度高, 可检测出点突变,
以及插入, 缺失突变, 能一次筛选多个
样品 。
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八, 多重 PCR (multiplex PCR)
1.原理:多对引物同时扩增几个不同的
DNA片段;如果被测基因某一区段缺失,
则相应的电泳图谱上此区段 PCR扩增产
物长度减少或消失, 从而发现基因异常 。
2.应用:检测单拷贝基因缺失, 重排, 插入等
异常改变 。
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如:杜氏营养不良症 (DMD),
X染色体短臂 Xp21区抗肌萎缩
蛋白基因的突变或部分缺失
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第二节 连接酶链反应
Ligase chain reaction
LCR
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一,LCR的基本原理
LCR是以 DNA连接酶将某一 DNA链的 5′磷
酸与另一相邻链的 3′羟基连接为基础的
循环反应。
第十一章
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第十一章
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二,LCR产物的检测
?标记引物,
– 放射性标记
– 荧光素标记
– 地高辛标记
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三、影响 LCR的重要因素
㈠ 引物
基因的突变位点
长度足够
㈡ LCR的反应条件
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第三节 RNA的体外扩增
RNA— PCR
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1,转录依赖的扩增系统 (transcript-based
amplification system,TAS)
2,自主维持序列扩增或再生式序列复制
( self-sustained sequence
replication,3SR)
3,核酸序列的扩增 ( nucleic acid
sequence-based amplification,
NASBA)
第十一章
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一、基本原理
以 RNA为模板在体外大量扩增 RNA
非循环相
逆转录
转录
循环相
聚合酶链式反应
反应体系温度均一
RNA产物以 10的指数方式增加
第十一章
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第十一章
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酶,
逆转录酶,RNase H,T7RNA聚合酶
引物,
引物 A— 与 RNA3′端互补,5 ′端含启动子
引物 B— 与 cDNA第一条链 3′端互补
底物, dNTP,NTP
模板,
缓冲液,
RNA— PCR反应体系的组成
第十一章
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二, 产物的检测,分子杂交
三,RNA— PCR技术的特点及应用
特点,
扩增效率极高
特异性强
应用,
检测 RNA,RNA测序,临床诊断
第十一章
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小 结
1.掌握 PCR,RT-PCR、连接酶链反应
( LCR),RNA-PCR的基本原理,
PCR引物设计的基本原则。
2.了解 PCR技术的其它类型;