反式作用因子特点,
① 三个功能结构域,DNA识别结合域；
转录活性域；
结合其他蛋白的结合域
②能识别并结合顺式作用元件
③正调控与负调控
结 构 基 因
G C G C C A A T T A T A
内 含 子外 显 子 外 显 子
转 录 起 始
C A A T 盒
G C 盒
增 强 子
顺 式 作 用 元 件
T A T A 盒 ( H o g n e s s b o x )
第十章 核酸分子杂交技术
? 核酸分子杂交的基本原理
? 核酸分子杂交的基本方法
? 探针的标记
第一节 核酸分子杂交的基本原理
? 核酸分子杂交的基本原理：具有
互补序列的两条核酸单链在一定
条件下，按碱基配对原则形成双
链的过程。
? 探针
Hybridization of Nucleic Acids
RNA
DNA1 DNA2
DNA
Southern
hybridization
Northern
hybridization
Juang RH (2004) BCbasics
探针
一,DNA变性与复性
1.DNA变性
①定义：氢键断裂，单链
②方法,热变性, 90~100℃ 熔解温度 (Tm)
酸碱变性,常采用碱变性
化学试剂变性 ;尿素、甲醛等
2.DNA复性 (退火 )
DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA
二、影响杂交的因素
1.核酸分子的浓度、长度和复杂性
2.离子强度
3.温度
4.杂交促进剂：硫酸葡聚糖等
5.非特异性杂交反应
–预杂交：用鲑鱼精子 DNA封闭非特异
性杂交位点
第二节 分子杂交的基本方法
? Southern 印迹法
? Northern 印迹法
? 斑点印迹杂交
? 原位杂交
? Western 印迹法
? 液相杂交
固相杂交
一,Southern blotting
? 1975年，英国 Edwen Southern创建
? 检测 DNA杂交方法，即将 DNA电泳、转
印到固相支持物上，用探针进行检测的
方法。
? 应用：基因组 DNA的定性和定量分析
基因诊断、分子克隆、法医学等
Southern bloting的主要步骤
1.待测 DNA样品的制备、酶切
2.待测 DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳
3.凝胶中 DNA的变性：碱变性
4.Southern转膜 (印迹 ),
毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法
5.Southern杂交 (预杂交、杂交、洗膜 )
6.杂交结果的检测
? 步骤
1.待测 DNA样品的制备、酶切
? DNA的提取原理：裂解细胞，使 DNA释
放，用 TE液溶解，交替使用酚、氯仿两
种蛋白质变性剂，有效去除蛋白质
? 标准程序：酚 —— 酚 -氯仿 —— 氯仿。
2.待测 DNA 样品的电泳分离,
琼脂糖凝胶电泳
bp
—1534
— 994
— 695
— 515
— 377
— 237
A B C M 琼脂糖凝胶电泳
3.凝胶中 DNA的变性：碱变性
4.Southern转膜,
–硝酸纤维素 (NC)膜、尼龙膜
–毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空
转移法
电转印法
5.Southern杂交 (预杂交、杂交、洗膜 )
6.杂交结果的检测
Souhtern blotting
二,Northern 印迹杂交 (Northern bloting)
? 检测 RNA（主要是 mRNA）的方法
? 与 Southern杂交的不同
–靶核酸,RNA，不需用限制酶消化
– RNA电泳
–转膜：电泳结束后不需变性
? 应用：检测外源基因在宿主中能否转录
RNA提取
1.样品细胞的有效破碎；
2.使核蛋白复合体变性；
3.对内源 RNA酶的有效抑制；
4.有效地将 RNA从 DNA和蛋白混合物中分
离；
? Northern blotting
三、斑点印迹杂交 (dot bloting)
? 将 RNA或 DNA变性后直接点样于 NC
膜或尼龙膜上
? 优点：简单、快速、可同时检测多
个样品
? 应用：确定 DNA样品之间的同源性
四、核酸原位杂交 (in situ hybridization)
1.定义：将标记的探针与细胞或组织切片
中的核酸进行杂交检测的方法。
2.特点,
–能在成分复杂的组织中进行单一细胞
的研究
–不需从组织或细胞中提取核酸
–能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态
核酸原位杂交的基本步骤
1.细胞或组织的固定：载玻片
2.组织细胞杂交前的预处理
– 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质
3.探针的选择和标记
4.杂交
5.杂交结果检测
1.荧光染色体原位杂交 (Fluorescence in situ
Hybridization； FISH)
基本原理是将 DNA探针用荧光染料标记，
然后将标记的探针直接原位杂交到染色体上，
来检测 DNA序列在染色体上的定位。
2.多色荧光染色体原位杂交 (multicolor FISH;
mFISH )
3.比较基因组原位杂交 (Comparative Genomic
Hybridization； CGH )
由原位杂交发展起的一些新技术
3.比较基因组原位杂交 (Comparative Genomic
Hybridization； CGH )
利用 两种 不同的 荧 光分別 标记两种 不同細胞的
Genomic DNA,再同 时与 正常的染色 体进 行
hybridization，染色 体 上不同 荧 光 间 的 强 弱
比值，由 此 比 较 而 观察 基因 组 中特定基因的
拷 贝数变化 。
CGH主要用于检测肿瘤组织 DNA拷贝数变化
（缺失、复制、扩增），并能将这些异常在
染色体上定位。该方法通过同一次实验即可
扫描整个肿瘤基因组 DNA序列的增加或丢失。
五,Western 印迹法 (Western bloting)
? 检测蛋白质，即将电泳分离的蛋白质转
移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋
白质进行鉴定及定量的方法
? 主要步骤,
– 蛋白质样品的制备
– SDS-聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳
– 蛋白质的电转移,
– 靶蛋白的免疫学检测
? 靶蛋白于第一抗体（一抗）反应
? 与标记的第二抗体（酶标二抗）反应
? 显色反应：酶促反应
六、液相杂交
? 待测核酸分子与探针在杂交液中进行反应，
分离杂交双链和单链 RNA，再进行检测。
? RNA酶保护分析法
? 核酸酶 S1保护分析法
第三节 探针的标记
一、探针的种类
二、标记物
三、探针标记方法
四、探针的纯化
一、探针的种类
–cDNA 探针、基因组 DNA探针、寡
核苷酸探针,RNA探针
二、标记物
–核素标记物（同位素标记）,32P、
35S,3H等
–非核素标记物（非同位素标记）：
生物素、地高辛、荧光素等
G
G
A
T
C
C
A
T C
C C
C T G C T
C A
G G
A G G C A A G A
G
G
C
A
T
G G
G G A C G
A G
T C
C T
C C
G T T C T
P
32
Target gene DNA
denaturation
Single colony
Lysed
Hybridization
Probe is labeled with radioactive 32P
Juang RH (2004) BCbasics
三、探针标记方法
1.缺口平移法 (nick translation)
2.随机引物法 (random primer),
3.PCR标记法
4.末端标记法
四、探针的纯化
1.乙醇沉淀法
2.Sephadex G-50 柱层析法
3.微柱离心法
小结
1.掌握,Southern blotting的原理、过程及应
用； 探针标记的方法。
2.熟悉：原位杂交和液相杂交的基本原理及
应用；
3.了解：探针的纯化方法。
