第十七章 基因治疗
1990.9.14 美国国立卫生研究院（ NIH）的
布雷斯和安德森 首例基因治疗
4岁 女孩 严重免疫缺陷症 (SCID)
缺乏腺苷酸脱氨酶 (ADA) 2--脱氧腺苷含
量升高 毒性 严重破坏免疫功能
ADA基因 LN逆转录病毒载体
靶细胞为病人淋巴细胞
第一节 概 述
一、基因治疗的概念
基因治疗（ gene therapy） —— 就是向有
功能缺陷的靶细胞补充相应功能基因，
以纠正或补偿其基因缺陷，或采用特定
的方式关闭、抑制异常表达的基因，从
而达到治疗的目的。
对象,体细胞 生殖细胞
二、基因治疗的必要条件
1,发病机制在 DNA水平上已经清楚
2,要转移的基因已经克隆分离，其表达
产物有详尽的了解
理想的基因治疗还必须,
1,外源基因可有效导入靶细胞
2,外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
3,导入基因能适量表达
4,导入基因的方法及载体对宿主细胞安
全无害
三、基因治疗的主要内容或策略
㈠ 基因标记
㈡基因置换（基因矫正）
㈢基因添加（基因增补）
(四 )基因干预
㈠ 基因标记 (gene labeling)
– 基因标记实验验证两个问题,
① 外源基因能否安全地转移到患者体内
②能否在患者体内的细胞中检测到外源基因的
存在
neo基因 (新霉素磷酸转移酶 II,NPI II)，
逆转录病毒载体
肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)
黑色素瘤
㈡ 基因置换（基因矫正）
定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列
必要条件,
①了解要导入的基因及其产物
②外源基因能有效地导入靶细胞
③外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
④导入基因能适量表达
⑤导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害
㈢ 基因添加（基因增补）
导入外源基因使靶细胞表达其本
身
不表达的基因。
类型,
1.导入正常的基因补偿缺陷基因的功
能
2.导入新的基因，利用表达产物治疗
(四 )基因干预 (gene interference)
指采用特定的方式抑制某个基因的表达,
或者通过破坏某个基因而使之不表达，以
达到治疗疾病的目的。
导入寡核苷酸抑制内源基因表达的方法,
1,反义核酸 封闭基因表达
2,核酶 裂解特异的靶 mRNA
第二节
基因转移技术和靶细胞
1.体内直接转基因
体内法 ( in vivo)
2.体细胞介导的基因治疗
回体法 ( ex vivo)
基因治疗的基本方式,
基因转移的方法,
1.生物学方法
逆转录病毒载体，腺病毒载体，
腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病
毒载体
2.非生物学方法
脂质体，直接注射，受体介导基
因转移技术
一、基因转移的生物学方法
㈠ 逆转录病毒载体,
1,逆转录病毒载体的结构
将前病毒 DNA经适当改造并插入质粒后构建
而成
5′LTR/ 3′LTR
包装信号（ ψ序列）
Neo基因 / Ampr
酶切位点（多克隆位点）
2.包装细胞 (packaging cell)
将缺失了包装信号及相关序列的缺
陷型逆转录病毒导入哺乳动物细胞,
这种细胞携带有逆转录病毒基因组,
从而能产生大量病毒包装蛋白。
逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转
录出的 RNA(病毒基因组的部分序列、
标记基因、外源基因 )被包装成病毒颗粒。
缺陷型的逆转录病毒颗粒 (假病毒颗粒 )
一次性感染
3.逆转录病毒载体的特点,
假病毒感染细胞,
RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整
合
到宿主细胞的染色体上，可稳定表达
只能感染处于增殖期的细胞
4.安全性问题
逆转录病毒感染的可能性
污染的可能性
逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
① 逆转录病毒感染的可能性
患者已受到逆转录病毒的感染
包装信号序列和不含包装信号序列的假病
毒发生重组。
② 污染的可能性
③ 逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
破坏细胞正常生长的必须基因
破坏抑癌基因
LTR激活原癌基因
染色体重排激活原癌基因
二、基因转移的非生物学方法
㈠ 脂质体
㈡直接注射
㈢受体介导基因转移技术
㈣其它方法
㈠ 脂质体 ( liposome )
1,脂质体是磷脂在一定条件下在水中
形成的由脂质双分子层组成的内部
为水相的闭合囊泡。
2,其结构和性质与细胞膜极为相似，
二者易于融合,DNA由于细胞的内
吞作用进入细胞。
3.脂质体介导基因转移的方法
1.脂质体－ DNA复合物的制备
用 250μl DMEM培养基稀释 1 μg外源基因，再
用 250μl DMEM培养基稀释 9μl脂质体，在 5分钟
内和外源基因溶液混合,25℃ 孵育 20分钟促使
DNA-脂质体混合物的形成。
2.脂质体介导外源基因转染
混合物与细胞共培养
4,DNA-脂质体混合物与细胞膜的作用方式
膜相互融合
5.人工脂质体膜的特点,
1.与体细胞相容，无毒性和免疫原性
2.可生物降解，不会在体内堆积
3.可制成球状 (0.03~50 ?m)，包容大小不
同的生物活性分子
4.可带有不同的电荷
5.具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温
度敏感性，能适应不同的生理要求
㈡ 直接注射
方法：注射，包埋
注入外源基因的量与其表达量成正比
溶液类型对基因表达有影响,
① TE 损伤肌纤维
② 生理盐水或 PBS
③ 5%~30%的蔗糖溶液中
㈢ 受体介导基因转移技术
受体介导的细胞内吞作用
特点,
1,具有细胞、组织或器官专一性，配
体只能被一些特异的细胞吞噬
2,配体进入细胞的转移效率较高
核酸运载工具,
配体 +多聚赖氨酸（ PL）
配体 — PL— 核酸
脱唾液酸血清类粘蛋白（ ASGP） 配体
肝细胞 受体
方法,
配体 (蛋白质 ) +多聚赖氨酸（ PL）
配体 - PL复合物
中性条件下加入核酸
配体 - PL-核酸复合物
细胞内吞
例,
肝细胞表面有：脱唾液酸血清类粘蛋白
（ ASGP）的受体
配体,ASGP-PL -质粒
受体
肝细胞
㈣ 其它方法
显微注射法
基因枪法 ……
三、基因转移的靶细胞
靶细胞的选择须考虑,
1,最好为组织特异性细胞
2,细胞较易获得，且生命周期较长
3,离体细胞较易受外源基因转化
4,离体细胞一定经转染和时间培养后再植回
体内，仍较易成活
目前常用的靶细胞有,
1,造血干细胞
2,皮肤成纤维细胞
3,肝细胞
4,血管内皮细胞
5,淋巴细胞
6,肌肉细胞
7,肿瘤细胞
8,脂肪干细胞
第三节 反义 RNA、核酶、三链
DNA,RNAi在基因治疗中的作用
一、反义 RNA
1.反义 RNA(anti sense RNA)是指
与 mRNA互补的 RNA分子 。
2.反义 RNA与特异的 mRNA结合而调
控其翻译。
利用反义 RNA进行基因治疗的方法,
1,体外合成反义 RNA，注射细胞
2,构建转录反义 RNA的重组质粒，转入
细胞
问题,
1.降解
2.非专一性
㈠ 反义 RNA在基因治疗中的意义及需解决
的问题
㈡ 受体介导反义 RNA转移技术
ASGP— PL— 反义 RNA
二、核 酶
具有催化活性的 RNA。
?核酶的二级结构对于催化活性很重要。
,锤头” 结构。
?三个螺旋区； 13（或 11）个保守核苷酸
序列。
核酶的作用机制,
见课本 P16
三、三链 DNA
㈠ 三链 DNA在基因治疗中的意义
寡聚脱氧核苷酸（ ODN）以 DNA双螺旋分子
的专一性序列为靶子，通过与该序列形成
三螺旋 DNA来阻止转录
㈡ 作用机制
合成脱氧寡核苷酸（ ODN）（同聚嘌
呤或同聚嘧啶）
DNA分子中同聚嘌呤 · 同聚嘧啶
ODN也被称为 TFO(triplex-forming oligo)
㈢ 技术关键
TFO 的设计与合成
1,专一性
2,稳定性
3,摄取与分布
四,RNA干扰
RNA 干扰 (RNA interference,RNA i)
将与 mRNA编码区某段序列相对
应的正义 RNA 和反义 RNA 组成的
双链 RNA (double-stranded RNA,
dsRNA)导入细胞，使 mRNA发生特
异性的降解，被称为 RNAi。
RNA干扰是由双链 RNA诱导的。在细胞内，双
链 RNA(dsRNA)前体由核酸酶 III(RNase III)
－ Dicer处理为 21一 23个碱基的小 RNA，才能
诱发 RNA干扰。因此，称这类小 RNA为小干扰
RNA (small interfering RNA,siRNA)。小
干扰 RNA是由 21-23个碱基配对形成的双链，
并在其 3’ 末端有两个游离未配对的核苷酸。
它与解螺旋酶、核酸酶等结合形成 RNA诱导
的沉默复合物 (RNA-inducing－ silencing
complex,RISC)后，能引导 RISC与互补 mRNA
结合，将 mRNA降解。
* dsRNA 的核酸酶
属于 RNase III 核酸酶家族成员，称为 Dicer，
是一种 ATP依赖性核酸内切酶。它包括 2 个催化
区,1个解旋酶区及 dsRNA 结合区域，在进化过
程中高度保守。该酶将 dsRNA切割成长 21-23 nt,
此片段的 3`端有 2nt的突出尾。
* RNA诱导的沉默复合物
称为 RNA-induced silencing complex
(RISC)，复合物由 21-23 nt dsRNA、核酸酶和
mRNA。当 RISC 复合物形成，核酸酶降解
mRNA。
(一 )ＲＮＡ干扰的历史
1995：矮牵牛花的故事
1995：线虫中的基因沉默现象
1998,RNA干扰（ RNA interference,RNAi）
的首次命名
2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现
2001：被, 科学, 评为当年十大科技突破之一
2002,被, 科学, 评为当年十大科技突破之首
2003：动物体内观察到ＲＮＡ干扰作用
2004：在恒河猴上的ＳＡＲＳ病毒
20世纪 90年代,Arizona大学的 Rich
Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花
的紫色，就将一个强启动子控制下的色素
基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不
是紫色而是杂色，甚至是白色。转基因的
植株不仅没有新基因的表达，反而使原有
的色素基因表达也受到了抑制, Rich称这种
现象为共抑制（ cosuppression），即转入
的外源基因和其本身的同源基因都被抑制 --
出现基因沉默（ gene silencing）, -------矮牵牛花的故事
(二 )RNAi 现象的发现
1995年，美国康乃尔大学的 Su Guo博
士 和 Kemphues试图利用反义 RNA技术阻断
秀丽新小杆线虫（ C.elegans）中的 par-1基
因，但却得到了一个意想不到的结果。在
对照实验中给线虫注射正义 RNA（ sense
RNA）以期观察到基因表达的增强。但得
到的结果是二者都同样地切断了 par-1基因
的表达途径。这是与传统上对反义 RNA技
术的解释正好相反的。当时 Guo等没能给出
合理的解释,
-----线虫中的基因沉默现象
线虫（ C,elegans)
(Guo & Kemphues,1995)
Antisense RNA
or Sense RNA
+
Par-1 Gene Expression
Down
-----线虫中的基因沉默现象
直到 1998年华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fir
和马萨诸塞大学医学院的 Craig Mello等首次揭开这
个悬疑之谜。他们证实,Guo等遇到的正义 RNA抑
制基因表达的现象，以及过去的反义 RNA技术对基
因表达的阻断，都是由于 RNA中污染了微量双链
RNA而引起。当他们将单链 RNA纯化后注射线虫时
发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双
链 RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的
表达，他们将这一现象称为 RNA干扰（ RNA
interference，简称 RNAi）。
----- RNA干扰（ RNA interference,RNAi）的首次命名
(Fire,1998)
线虫（ C,elegans)
Sense RNA
+
Par-1 Gene
Expression
Down
线虫（ C,elegans)
Antisense RNA
+
Par-1 Gene
Disruption Expression
Down
线虫（ C,elegans)
(Fire,1998)
+
Par-1 Gene Expression
Down Double Strand RNA
线 虫,果 蝇
微生物,植 物
(三 )RNAi作用的原理,
1.启动阶段,dsRNA被 Dicer酶以一
种 ATP依赖的方式逐步切割成 siRNA；
这种双链 siRNA包括约 20个碱基对，
且每条链的 3’末端都悬垂着 2个未配
对碱基。
Dicer
siRNA
5’
3’ 5’
3’
2,效应阶段,
首先 siRNA聚集到一种包含着核酸
内切酶,外切酶和解旋酶的复合物上,
形成诱导沉默复合物（ RISC），然后
siRNA经历解双链的过程激活 RISC。随
后，在 siRNA反义链的指导下,RISC与
靶基因的 mRNA互补结合，并特异性切
割靶 mRNA,mRNA断裂的部位大约在
siRNA互补结合的中部。此后 mRNA进一
步降解，导致不能进行翻译过程。
dsRNA
Dicer cleavage of dsRNA
siRNA
RNAi 机制分解演示
siRNA associated
With RISC complex
Cell Membrane
5’P OH3’ Target mRNA
Exonuclease
Homology search activity Endonuclease
Helicase 5’ 3’
Target mRNA OH3’
5’P
动画演示
http://www.ebiotrade.com/adf/nrg0201_11
0a_a1.swf
http://www.nature.com/focus/rnai/animati
ons/animation/animation.htm
5’P OH3’
3’ OH P5’ 21nts 短链 dsRNA
抑制靶基因表达
RNAi 现象
RISC 结合
哺乳动物细胞中的 RNAi 现象（二）
(short interfering RNA,siRNA）
Vectors expressing siRNAs
U6
Sense
sequence
Anti-sense
sequence
Hair-pin
loop
Sense sequence
Anti-sense sequence
(四 )RNAi的应用,
* 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互
作用的基因网络调控的结构，传统技术
诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑
制或逆转肿瘤的生长，而 RNAi可以利用
同一基因家族的多个基因具有一段同源
性很高的保守序列这一特性，设计针对
这一序列的 dsRNA分子，只导入一种
dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。
RNAi的优势
● 高效率, 能在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使目标
基因表达降到极低水平甚至完全, 剔除,,从而产生缺失
突变体表型
●高特异性, 其能够非常特异地只降解与之序列相对应的单
个内源基因的 mRNA.治疗针对性强,副作用小。
●高稳定性, 以 3’端悬垂 TT 碱基的 dsRNA 尤为稳定，无需象
反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期
●能同时抑制多个基因,与传统的同源重组基因剔除技术以及
RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因转变都只能一次改变
一个基因相比，利用 RNAi 可以产生多个基因同时剔除的
表型。
●可遗传性,RNA干扰效应甚至可以通过生殖系统传递到后
代中去,
小 结
1.掌握基因治疗、基因标记、基因置换、
基因添加、基因干预、反义 RNA、核
酶等基本概念；
2.掌握反义 RNA、核酶、三链 DNA、
RNAi在基因治疗中基本原理 ;
3.掌握逆转录病毒载体、脂质体在基因
治疗中的应用
谢谢 !
1990.9.14 美国国立卫生研究院（ NIH）的
布雷斯和安德森 首例基因治疗
4岁 女孩 严重免疫缺陷症 (SCID)
缺乏腺苷酸脱氨酶 (ADA) 2--脱氧腺苷含
量升高 毒性 严重破坏免疫功能
ADA基因 LN逆转录病毒载体
靶细胞为病人淋巴细胞
第一节 概 述
一、基因治疗的概念
基因治疗（ gene therapy） —— 就是向有
功能缺陷的靶细胞补充相应功能基因，
以纠正或补偿其基因缺陷，或采用特定
的方式关闭、抑制异常表达的基因，从
而达到治疗的目的。
对象,体细胞 生殖细胞
二、基因治疗的必要条件
1,发病机制在 DNA水平上已经清楚
2,要转移的基因已经克隆分离，其表达
产物有详尽的了解
理想的基因治疗还必须,
1,外源基因可有效导入靶细胞
2,外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
3,导入基因能适量表达
4,导入基因的方法及载体对宿主细胞安
全无害
三、基因治疗的主要内容或策略
㈠ 基因标记
㈡基因置换（基因矫正）
㈢基因添加（基因增补）
(四 )基因干预
㈠ 基因标记 (gene labeling)
– 基因标记实验验证两个问题,
① 外源基因能否安全地转移到患者体内
②能否在患者体内的细胞中检测到外源基因的
存在
neo基因 (新霉素磷酸转移酶 II,NPI II)，
逆转录病毒载体
肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL)
黑色素瘤
㈡ 基因置换（基因矫正）
定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列
必要条件,
①了解要导入的基因及其产物
②外源基因能有效地导入靶细胞
③外源基因能在靶细胞中长期稳定存留
④导入基因能适量表达
⑤导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害
㈢ 基因添加（基因增补）
导入外源基因使靶细胞表达其本
身
不表达的基因。
类型,
1.导入正常的基因补偿缺陷基因的功
能
2.导入新的基因，利用表达产物治疗
(四 )基因干预 (gene interference)
指采用特定的方式抑制某个基因的表达,
或者通过破坏某个基因而使之不表达，以
达到治疗疾病的目的。
导入寡核苷酸抑制内源基因表达的方法,
1,反义核酸 封闭基因表达
2,核酶 裂解特异的靶 mRNA
第二节
基因转移技术和靶细胞
1.体内直接转基因
体内法 ( in vivo)
2.体细胞介导的基因治疗
回体法 ( ex vivo)
基因治疗的基本方式,
基因转移的方法,
1.生物学方法
逆转录病毒载体，腺病毒载体，
腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病
毒载体
2.非生物学方法
脂质体，直接注射，受体介导基
因转移技术
一、基因转移的生物学方法
㈠ 逆转录病毒载体,
1,逆转录病毒载体的结构
将前病毒 DNA经适当改造并插入质粒后构建
而成
5′LTR/ 3′LTR
包装信号（ ψ序列）
Neo基因 / Ampr
酶切位点（多克隆位点）
2.包装细胞 (packaging cell)
将缺失了包装信号及相关序列的缺
陷型逆转录病毒导入哺乳动物细胞,
这种细胞携带有逆转录病毒基因组,
从而能产生大量病毒包装蛋白。
逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转
录出的 RNA(病毒基因组的部分序列、
标记基因、外源基因 )被包装成病毒颗粒。
缺陷型的逆转录病毒颗粒 (假病毒颗粒 )
一次性感染
3.逆转录病毒载体的特点,
假病毒感染细胞,
RNA进入靶细胞后，变成前病毒并整
合
到宿主细胞的染色体上，可稳定表达
只能感染处于增殖期的细胞
4.安全性问题
逆转录病毒感染的可能性
污染的可能性
逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
① 逆转录病毒感染的可能性
患者已受到逆转录病毒的感染
包装信号序列和不含包装信号序列的假病
毒发生重组。
② 污染的可能性
③ 逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合
破坏细胞正常生长的必须基因
破坏抑癌基因
LTR激活原癌基因
染色体重排激活原癌基因
二、基因转移的非生物学方法
㈠ 脂质体
㈡直接注射
㈢受体介导基因转移技术
㈣其它方法
㈠ 脂质体 ( liposome )
1,脂质体是磷脂在一定条件下在水中
形成的由脂质双分子层组成的内部
为水相的闭合囊泡。
2,其结构和性质与细胞膜极为相似，
二者易于融合,DNA由于细胞的内
吞作用进入细胞。
3.脂质体介导基因转移的方法
1.脂质体－ DNA复合物的制备
用 250μl DMEM培养基稀释 1 μg外源基因，再
用 250μl DMEM培养基稀释 9μl脂质体，在 5分钟
内和外源基因溶液混合,25℃ 孵育 20分钟促使
DNA-脂质体混合物的形成。
2.脂质体介导外源基因转染
混合物与细胞共培养
4,DNA-脂质体混合物与细胞膜的作用方式
膜相互融合
5.人工脂质体膜的特点,
1.与体细胞相容，无毒性和免疫原性
2.可生物降解，不会在体内堆积
3.可制成球状 (0.03~50 ?m)，包容大小不
同的生物活性分子
4.可带有不同的电荷
5.具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温
度敏感性，能适应不同的生理要求
㈡ 直接注射
方法：注射，包埋
注入外源基因的量与其表达量成正比
溶液类型对基因表达有影响,
① TE 损伤肌纤维
② 生理盐水或 PBS
③ 5%~30%的蔗糖溶液中
㈢ 受体介导基因转移技术
受体介导的细胞内吞作用
特点,
1,具有细胞、组织或器官专一性，配
体只能被一些特异的细胞吞噬
2,配体进入细胞的转移效率较高
核酸运载工具,
配体 +多聚赖氨酸（ PL）
配体 — PL— 核酸
脱唾液酸血清类粘蛋白（ ASGP） 配体
肝细胞 受体
方法,
配体 (蛋白质 ) +多聚赖氨酸（ PL）
配体 - PL复合物
中性条件下加入核酸
配体 - PL-核酸复合物
细胞内吞
例,
肝细胞表面有：脱唾液酸血清类粘蛋白
（ ASGP）的受体
配体,ASGP-PL -质粒
受体
肝细胞
㈣ 其它方法
显微注射法
基因枪法 ……
三、基因转移的靶细胞
靶细胞的选择须考虑,
1,最好为组织特异性细胞
2,细胞较易获得，且生命周期较长
3,离体细胞较易受外源基因转化
4,离体细胞一定经转染和时间培养后再植回
体内，仍较易成活
目前常用的靶细胞有,
1,造血干细胞
2,皮肤成纤维细胞
3,肝细胞
4,血管内皮细胞
5,淋巴细胞
6,肌肉细胞
7,肿瘤细胞
8,脂肪干细胞
第三节 反义 RNA、核酶、三链
DNA,RNAi在基因治疗中的作用
一、反义 RNA
1.反义 RNA(anti sense RNA)是指
与 mRNA互补的 RNA分子 。
2.反义 RNA与特异的 mRNA结合而调
控其翻译。
利用反义 RNA进行基因治疗的方法,
1,体外合成反义 RNA，注射细胞
2,构建转录反义 RNA的重组质粒，转入
细胞
问题,
1.降解
2.非专一性
㈠ 反义 RNA在基因治疗中的意义及需解决
的问题
㈡ 受体介导反义 RNA转移技术
ASGP— PL— 反义 RNA
二、核 酶
具有催化活性的 RNA。
?核酶的二级结构对于催化活性很重要。
,锤头” 结构。
?三个螺旋区； 13（或 11）个保守核苷酸
序列。
核酶的作用机制,
见课本 P16
三、三链 DNA
㈠ 三链 DNA在基因治疗中的意义
寡聚脱氧核苷酸（ ODN）以 DNA双螺旋分子
的专一性序列为靶子，通过与该序列形成
三螺旋 DNA来阻止转录
㈡ 作用机制
合成脱氧寡核苷酸（ ODN）（同聚嘌
呤或同聚嘧啶）
DNA分子中同聚嘌呤 · 同聚嘧啶
ODN也被称为 TFO(triplex-forming oligo)
㈢ 技术关键
TFO 的设计与合成
1,专一性
2,稳定性
3,摄取与分布
四,RNA干扰
RNA 干扰 (RNA interference,RNA i)
将与 mRNA编码区某段序列相对
应的正义 RNA 和反义 RNA 组成的
双链 RNA (double-stranded RNA,
dsRNA)导入细胞，使 mRNA发生特
异性的降解，被称为 RNAi。
RNA干扰是由双链 RNA诱导的。在细胞内，双
链 RNA(dsRNA)前体由核酸酶 III(RNase III)
－ Dicer处理为 21一 23个碱基的小 RNA，才能
诱发 RNA干扰。因此，称这类小 RNA为小干扰
RNA (small interfering RNA,siRNA)。小
干扰 RNA是由 21-23个碱基配对形成的双链，
并在其 3’ 末端有两个游离未配对的核苷酸。
它与解螺旋酶、核酸酶等结合形成 RNA诱导
的沉默复合物 (RNA-inducing－ silencing
complex,RISC)后，能引导 RISC与互补 mRNA
结合，将 mRNA降解。
* dsRNA 的核酸酶
属于 RNase III 核酸酶家族成员，称为 Dicer，
是一种 ATP依赖性核酸内切酶。它包括 2 个催化
区,1个解旋酶区及 dsRNA 结合区域，在进化过
程中高度保守。该酶将 dsRNA切割成长 21-23 nt,
此片段的 3`端有 2nt的突出尾。
* RNA诱导的沉默复合物
称为 RNA-induced silencing complex
(RISC)，复合物由 21-23 nt dsRNA、核酸酶和
mRNA。当 RISC 复合物形成，核酸酶降解
mRNA。
(一 )ＲＮＡ干扰的历史
1995：矮牵牛花的故事
1995：线虫中的基因沉默现象
1998,RNA干扰（ RNA interference,RNAi）
的首次命名
2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现
2001：被, 科学, 评为当年十大科技突破之一
2002,被, 科学, 评为当年十大科技突破之首
2003：动物体内观察到ＲＮＡ干扰作用
2004：在恒河猴上的ＳＡＲＳ病毒
20世纪 90年代,Arizona大学的 Rich
Jorgensen和他的同事们试图加深矮牵牛花
的紫色，就将一个强启动子控制下的色素
基因转入，但结果非常惊奇，许多花并不
是紫色而是杂色，甚至是白色。转基因的
植株不仅没有新基因的表达，反而使原有
的色素基因表达也受到了抑制, Rich称这种
现象为共抑制（ cosuppression），即转入
的外源基因和其本身的同源基因都被抑制 --
出现基因沉默（ gene silencing）, -------矮牵牛花的故事
(二 )RNAi 现象的发现
1995年，美国康乃尔大学的 Su Guo博
士 和 Kemphues试图利用反义 RNA技术阻断
秀丽新小杆线虫（ C.elegans）中的 par-1基
因，但却得到了一个意想不到的结果。在
对照实验中给线虫注射正义 RNA（ sense
RNA）以期观察到基因表达的增强。但得
到的结果是二者都同样地切断了 par-1基因
的表达途径。这是与传统上对反义 RNA技
术的解释正好相反的。当时 Guo等没能给出
合理的解释,
-----线虫中的基因沉默现象
线虫（ C,elegans)
(Guo & Kemphues,1995)
Antisense RNA
or Sense RNA
+
Par-1 Gene Expression
Down
-----线虫中的基因沉默现象
直到 1998年华盛顿卡耐基研究院的 Andrew Fir
和马萨诸塞大学医学院的 Craig Mello等首次揭开这
个悬疑之谜。他们证实,Guo等遇到的正义 RNA抑
制基因表达的现象，以及过去的反义 RNA技术对基
因表达的阻断，都是由于 RNA中污染了微量双链
RNA而引起。当他们将单链 RNA纯化后注射线虫时
发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双
链 RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的
表达，他们将这一现象称为 RNA干扰（ RNA
interference，简称 RNAi）。
----- RNA干扰（ RNA interference,RNAi）的首次命名
(Fire,1998)
线虫（ C,elegans)
Sense RNA
+
Par-1 Gene
Expression
Down
线虫（ C,elegans)
Antisense RNA
+
Par-1 Gene
Disruption Expression
Down
线虫（ C,elegans)
(Fire,1998)
+
Par-1 Gene Expression
Down Double Strand RNA
线 虫,果 蝇
微生物,植 物
(三 )RNAi作用的原理,
1.启动阶段,dsRNA被 Dicer酶以一
种 ATP依赖的方式逐步切割成 siRNA；
这种双链 siRNA包括约 20个碱基对，
且每条链的 3’末端都悬垂着 2个未配
对碱基。
Dicer
siRNA
5’
3’ 5’
3’
2,效应阶段,
首先 siRNA聚集到一种包含着核酸
内切酶,外切酶和解旋酶的复合物上,
形成诱导沉默复合物（ RISC），然后
siRNA经历解双链的过程激活 RISC。随
后，在 siRNA反义链的指导下,RISC与
靶基因的 mRNA互补结合，并特异性切
割靶 mRNA,mRNA断裂的部位大约在
siRNA互补结合的中部。此后 mRNA进一
步降解，导致不能进行翻译过程。
dsRNA
Dicer cleavage of dsRNA
siRNA
RNAi 机制分解演示
siRNA associated
With RISC complex
Cell Membrane
5’P OH3’ Target mRNA
Exonuclease
Homology search activity Endonuclease
Helicase 5’ 3’
Target mRNA OH3’
5’P
动画演示
http://www.ebiotrade.com/adf/nrg0201_11
0a_a1.swf
http://www.nature.com/focus/rnai/animati
ons/animation/animation.htm
5’P OH3’
3’ OH P5’ 21nts 短链 dsRNA
抑制靶基因表达
RNAi 现象
RISC 结合
哺乳动物细胞中的 RNAi 现象（二）
(short interfering RNA,siRNA）
Vectors expressing siRNAs
U6
Sense
sequence
Anti-sense
sequence
Hair-pin
loop
Sense sequence
Anti-sense sequence
(四 )RNAi的应用,
* 肿瘤的基因治疗：肿瘤是多个基因相互
作用的基因网络调控的结构，传统技术
诱发的单个癌基因的阻断不可能完全抑
制或逆转肿瘤的生长，而 RNAi可以利用
同一基因家族的多个基因具有一段同源
性很高的保守序列这一特性，设计针对
这一序列的 dsRNA分子，只导入一种
dsRNA 既可以产生多个基因同时沉默。
RNAi的优势
● 高效率, 能在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使目标
基因表达降到极低水平甚至完全, 剔除,,从而产生缺失
突变体表型
●高特异性, 其能够非常特异地只降解与之序列相对应的单
个内源基因的 mRNA.治疗针对性强,副作用小。
●高稳定性, 以 3’端悬垂 TT 碱基的 dsRNA 尤为稳定，无需象
反义核酸那样进行广泛的化学修饰以提高半衰期
●能同时抑制多个基因,与传统的同源重组基因剔除技术以及
RNA/DNA嵌合分子介导的高效基因转变都只能一次改变
一个基因相比，利用 RNAi 可以产生多个基因同时剔除的
表型。
●可遗传性,RNA干扰效应甚至可以通过生殖系统传递到后
代中去,
小 结
1.掌握基因治疗、基因标记、基因置换、
基因添加、基因干预、反义 RNA、核
酶等基本概念；
2.掌握反义 RNA、核酶、三链 DNA、
RNAi在基因治疗中基本原理 ;
3.掌握逆转录病毒载体、脂质体在基因
治疗中的应用
谢谢 !
