第十六章 基因诊断
Gene Diagnosis
基因诊断 — 以 DNA或 RNA为诊断材
料，通过检查基因的存在、缺陷或
表达异常，对人体状态和疾病作出
诊断的方法和过程。
原理,
第一节 基因诊断的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生
物学方法
㈠ 核酸分子杂交
㈡ PCR
㈢ SSCP（ PCR-SSCP）
㈣ 限制酶酶谱分析
㈤ DNA序列测定
㈥ DNA芯片技术
㈠ 核酸分子杂交
制
备
样
品
制
备
探
针
杂
交
检
测
获得满意的高特异性杂交的关键是
控制好杂交条件和杂交后冲洗条件
㈡ PCR
一般与其它技术合用
㈢ 单链构象多态性（ SSCP）检测
PCR- SSCP
检测点突变
㈣ 限制酶酶谱分析
基因突变导致酶切位点的丢失或相对位
置发生改变
㈤ DNA序列测定
㈥ DNA芯片技术
二、基因诊断的基本方法
基因变异致病的类型,
1,内源基因的变异
基因结构的突变
点突变、插入、缺失、重排、异位
基因表达异常
mRNA剪接异常
2,外源基因的插入
㈠ 基因突变的诊断
1,点突变的诊断
①诊断已知的点突变 （ PCR/ASO）
一对探针
突变碱基置探针中央
控制杂交条件
结果分析,
反向杂交技术
基因芯片技术：可检测出新的突变类型
② 诊断未知的突变
PCR/SSCP/测序
DNA芯片技术
2,少数核苷酸缺失或插入的诊断
3,大片段丢失或插入的诊断
PCR/多重 PCR
4,基因重排（染色体易位）的诊断
5,基因扩增的诊断
㈡ 多态性连锁分析
DNA多态性 —— 在同种生物不同个体的
基因组中，常存在一些不影响基因功
能的 DNA顺序变异，称为 DNA多态性
（ polymorphism）
1.限制性片段长度多态性（ RFLP）
2,DNA重复序列多态性
1.限制性片段长度多态性（ RFLP）
概念：用限制酶切割基因组时，所产
生的限制性片段的数目和每个片段
的长度不同。
① RFLP直接分析法
② RFLP间接分析法
① RFLP直接分析法,
DNA→ 酶切 → Southern杂交分析
DNA→PCR → 酶切 → 电泳分析
② RFLP间接分析法,
在某一特定的家庭中，如果某一致病
基因与特异的多态性片段紧密连锁，
就可用这一种“遗传标记”来判断家
庭成员或胎儿的基因组中是否携带有
致病基因
2,DNA重复序列多态性
由于重复单位的数目不同而成多态性
㈢ 基因表达异常的诊断
1,mRNA的相对定量分析
斑点杂交或狭缝杂交
RT— PCR
2,mRNA的绝对定量分析
RT— PCR/竞争性 PCR
3,mRNA长度分析
Northern杂交 / RT— PCR产物电泳
㈣ 外源 DNA检测
核酸分子杂交
PCR技术
第二节 遗传病的基因诊断
一、遗传性疾病基因
诊断的策略
1,直接诊断
点突变
2,间接诊断
多态性连锁分析
二、血红蛋白病的基因诊断
血红蛋白病：异常血红蛋白病
地中海贫血
(一 )异常血红蛋白病的基因诊断
1.DNA检测与分析
① Hb D Punjab β珠蛋白基因第 121位
GAA CAA EcoR I
PCR/限制酶酶谱分析
②镰刀形红细胞性贫血症 GAA GUA
2.RNA检测与分析
(二 ) α-地贫的基因诊断
α-地贫的致病原因,
α珠蛋白基因的缺失或突变使 α珠蛋白链
的合成减少或完全不能合成。
1.DNA检测与分析,RFLP,PCR
2.RNA检测与分析,RT-PCR
(三 )β-地贫的基因诊断
β-地贫的致病原因,
β珠蛋白基因的点突变、移码突变、表达障
碍，导致珠蛋白量的减少或完全没有
1.DNA检测与分析
(1)PCR/ASO探针法
(2) PCR/RFLP连锁分析法
2.RNA检测与分析,RT-PCR
三、杜氏营养不良症 (DMD)、贝克型
进行性肌营养不良 (BMD)的基因诊断
DMD是由抗肌萎缩蛋白基因决定，该
基因长约 2.4Mb,79个外显子。
1.DNA检测与分析,RFLP,cDNA探
针法、多重 PCR
2.RNA检测与分析,RT-PCR
四、甲型血友病的基因诊断
第三节 感染性疾病的
基因诊断
一、感染性疾病基因诊断的策略
1,针对病原体特异的核酸序列设计探针
进行杂交
2,应用 PCR技术扩增病原体基因保守序
列
3,核酸杂交技术与 PCR技术联合应用
二、病毒性肝炎的基因诊断
1.PCR法
(1)引物设计,
(2)选择方法,
(3)产物分析,
2.分子杂交法
三、细菌性疾病的基因诊断
第四节 肿瘤的基因诊断
一、肿瘤基因诊断的策略
1,检测肿瘤相关基因
癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因
2,检测肿瘤相关病毒的基因
鼻咽癌 — EB，宫颈癌 — HPV
3,检测肿瘤标志物基因或 mRNA
肝癌 — 甲胎蛋白（ AFP）
结肠癌 — 癌胚抗原（ CEA）
二、肿瘤相关基因的检测
㈠ ras癌基因的检测
ras基因中最常见的点突变是第 12,13或 61密
码子突变
检测方法,
1,PCR/ASO
2,PCR-SSCP
㈡ p53的检测
p53基因突变主要为点突变，最常见的突
变区域位于密码子 130~290
检测方法,
1,PCR— SSCP
2,PCR— 测序
3,PCR— RFLP
㈢ 其它基因的检测
PCR结合其它技术
第五节 基因诊断在法医学
上的应用
一,DNA指纹 (DNA fingerprint)
DNA指纹：是指限制性酶消化产物在电泳
图谱或 southern杂交中产生的一系列带
纹, 不同带纹代表了在染色体不同位置
上的不同长度的 DNA序列。
DNA指纹在亲子鉴定中的应用
亲子鉴定的原理,
孟德尔遗传的分离律 。
亲权指数 (PI),
假设父提供生父基因成为孩子生父的可能性和
随机男人提供生父基因成为孩子生父的可能
性的比值叫作亲权指数（ paternity index,PI）。
假设某案例中母亲是 PLA2A-12/14型，孩子为
12/15型，从比较中可确定生父基因是 PLA2A-
15。此案中假设父为 14/15型。
前一种可能性假设为 X;后一种可能性假设为 Y。
上例中的假设父基因型为 14/15杂合子，他提
供生父基因 PLA2A-15的可能性为 1/2，即
X=1/2。随机男人提供生父基因 PLA2A-15的
机会为该基因的频率，即 Y=0.1187。因此，
此例的 PI值为 0.5/0.1187=4.2。
例如某亲子鉴定案检测结果如下,
PAL2A CSF1PO D3S1358 D13S317 D5S818 D1S1656
假
设
父
14/14 11/11 16/16 11/12 10/12 12/16
孩
子
14/16 11/12 16/16 11/12 10/11 16/16
PI 2.546 1.536 3.4471 2.7480 1.0391 2.3332
父子关系相对机会（ relative chance of
paternity,RCP）,
PI值是一个绝对值，为使鉴定结果能
够以概率形式表达父子关系的相对机会，
PI值须转换成一种相对值 RCP。
RCP=[PI/（ PI+1） ]× 100%。按照国内外
亲子鉴定的惯例，当 RCP值大于 99.73%
时，则可以认为假设父与孩子具有亲生
关系。 如果 RCP值达不到 99.73%时，则
可以认为假设父与孩子不具有亲生关系。
小 结
1.掌握：掌握基因诊断的基本概念、原理；
基因诊断中常用的分子生物学技术；血
红蛋白病、杜氏营养不良症的基因诊断
方法。
2.熟悉感染性、肿瘤疾病的基因诊断策略
及诊断方法；
1.Southern blotting的原理、过程
及应用。
2.PCR,RT-PCR,LCR,RNA-
PCR的基本原理。
通过检索 Genebank(美国基因 \蛋白数据
库 ),EMBL(欧洲分子生物学实验室数据
库 )和 DDBJ(日本国家遗传研究所基因数
据库 )DNA序列数据库
Gene Diagnosis
基因诊断 — 以 DNA或 RNA为诊断材
料，通过检查基因的存在、缺陷或
表达异常，对人体状态和疾病作出
诊断的方法和过程。
原理,
第一节 基因诊断的技术方法
一、基因诊断中常用的分子生
物学方法
㈠ 核酸分子杂交
㈡ PCR
㈢ SSCP（ PCR-SSCP）
㈣ 限制酶酶谱分析
㈤ DNA序列测定
㈥ DNA芯片技术
㈠ 核酸分子杂交
制
备
样
品
制
备
探
针
杂
交
检
测
获得满意的高特异性杂交的关键是
控制好杂交条件和杂交后冲洗条件
㈡ PCR
一般与其它技术合用
㈢ 单链构象多态性（ SSCP）检测
PCR- SSCP
检测点突变
㈣ 限制酶酶谱分析
基因突变导致酶切位点的丢失或相对位
置发生改变
㈤ DNA序列测定
㈥ DNA芯片技术
二、基因诊断的基本方法
基因变异致病的类型,
1,内源基因的变异
基因结构的突变
点突变、插入、缺失、重排、异位
基因表达异常
mRNA剪接异常
2,外源基因的插入
㈠ 基因突变的诊断
1,点突变的诊断
①诊断已知的点突变 （ PCR/ASO）
一对探针
突变碱基置探针中央
控制杂交条件
结果分析,
反向杂交技术
基因芯片技术：可检测出新的突变类型
② 诊断未知的突变
PCR/SSCP/测序
DNA芯片技术
2,少数核苷酸缺失或插入的诊断
3,大片段丢失或插入的诊断
PCR/多重 PCR
4,基因重排（染色体易位）的诊断
5,基因扩增的诊断
㈡ 多态性连锁分析
DNA多态性 —— 在同种生物不同个体的
基因组中，常存在一些不影响基因功
能的 DNA顺序变异，称为 DNA多态性
（ polymorphism）
1.限制性片段长度多态性（ RFLP）
2,DNA重复序列多态性
1.限制性片段长度多态性（ RFLP）
概念：用限制酶切割基因组时，所产
生的限制性片段的数目和每个片段
的长度不同。
① RFLP直接分析法
② RFLP间接分析法
① RFLP直接分析法,
DNA→ 酶切 → Southern杂交分析
DNA→PCR → 酶切 → 电泳分析
② RFLP间接分析法,
在某一特定的家庭中，如果某一致病
基因与特异的多态性片段紧密连锁，
就可用这一种“遗传标记”来判断家
庭成员或胎儿的基因组中是否携带有
致病基因
2,DNA重复序列多态性
由于重复单位的数目不同而成多态性
㈢ 基因表达异常的诊断
1,mRNA的相对定量分析
斑点杂交或狭缝杂交
RT— PCR
2,mRNA的绝对定量分析
RT— PCR/竞争性 PCR
3,mRNA长度分析
Northern杂交 / RT— PCR产物电泳
㈣ 外源 DNA检测
核酸分子杂交
PCR技术
第二节 遗传病的基因诊断
一、遗传性疾病基因
诊断的策略
1,直接诊断
点突变
2,间接诊断
多态性连锁分析
二、血红蛋白病的基因诊断
血红蛋白病：异常血红蛋白病
地中海贫血
(一 )异常血红蛋白病的基因诊断
1.DNA检测与分析
① Hb D Punjab β珠蛋白基因第 121位
GAA CAA EcoR I
PCR/限制酶酶谱分析
②镰刀形红细胞性贫血症 GAA GUA
2.RNA检测与分析
(二 ) α-地贫的基因诊断
α-地贫的致病原因,
α珠蛋白基因的缺失或突变使 α珠蛋白链
的合成减少或完全不能合成。
1.DNA检测与分析,RFLP,PCR
2.RNA检测与分析,RT-PCR
(三 )β-地贫的基因诊断
β-地贫的致病原因,
β珠蛋白基因的点突变、移码突变、表达障
碍，导致珠蛋白量的减少或完全没有
1.DNA检测与分析
(1)PCR/ASO探针法
(2) PCR/RFLP连锁分析法
2.RNA检测与分析,RT-PCR
三、杜氏营养不良症 (DMD)、贝克型
进行性肌营养不良 (BMD)的基因诊断
DMD是由抗肌萎缩蛋白基因决定，该
基因长约 2.4Mb,79个外显子。
1.DNA检测与分析,RFLP,cDNA探
针法、多重 PCR
2.RNA检测与分析,RT-PCR
四、甲型血友病的基因诊断
第三节 感染性疾病的
基因诊断
一、感染性疾病基因诊断的策略
1,针对病原体特异的核酸序列设计探针
进行杂交
2,应用 PCR技术扩增病原体基因保守序
列
3,核酸杂交技术与 PCR技术联合应用
二、病毒性肝炎的基因诊断
1.PCR法
(1)引物设计,
(2)选择方法,
(3)产物分析,
2.分子杂交法
三、细菌性疾病的基因诊断
第四节 肿瘤的基因诊断
一、肿瘤基因诊断的策略
1,检测肿瘤相关基因
癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因
2,检测肿瘤相关病毒的基因
鼻咽癌 — EB，宫颈癌 — HPV
3,检测肿瘤标志物基因或 mRNA
肝癌 — 甲胎蛋白（ AFP）
结肠癌 — 癌胚抗原（ CEA）
二、肿瘤相关基因的检测
㈠ ras癌基因的检测
ras基因中最常见的点突变是第 12,13或 61密
码子突变
检测方法,
1,PCR/ASO
2,PCR-SSCP
㈡ p53的检测
p53基因突变主要为点突变，最常见的突
变区域位于密码子 130~290
检测方法,
1,PCR— SSCP
2,PCR— 测序
3,PCR— RFLP
㈢ 其它基因的检测
PCR结合其它技术
第五节 基因诊断在法医学
上的应用
一,DNA指纹 (DNA fingerprint)
DNA指纹：是指限制性酶消化产物在电泳
图谱或 southern杂交中产生的一系列带
纹, 不同带纹代表了在染色体不同位置
上的不同长度的 DNA序列。
DNA指纹在亲子鉴定中的应用
亲子鉴定的原理,
孟德尔遗传的分离律 。
亲权指数 (PI),
假设父提供生父基因成为孩子生父的可能性和
随机男人提供生父基因成为孩子生父的可能
性的比值叫作亲权指数（ paternity index,PI）。
假设某案例中母亲是 PLA2A-12/14型，孩子为
12/15型，从比较中可确定生父基因是 PLA2A-
15。此案中假设父为 14/15型。
前一种可能性假设为 X;后一种可能性假设为 Y。
上例中的假设父基因型为 14/15杂合子，他提
供生父基因 PLA2A-15的可能性为 1/2，即
X=1/2。随机男人提供生父基因 PLA2A-15的
机会为该基因的频率，即 Y=0.1187。因此，
此例的 PI值为 0.5/0.1187=4.2。
例如某亲子鉴定案检测结果如下,
PAL2A CSF1PO D3S1358 D13S317 D5S818 D1S1656
假
设
父
14/14 11/11 16/16 11/12 10/12 12/16
孩
子
14/16 11/12 16/16 11/12 10/11 16/16
PI 2.546 1.536 3.4471 2.7480 1.0391 2.3332
父子关系相对机会（ relative chance of
paternity,RCP）,
PI值是一个绝对值，为使鉴定结果能
够以概率形式表达父子关系的相对机会，
PI值须转换成一种相对值 RCP。
RCP=[PI/（ PI+1） ]× 100%。按照国内外
亲子鉴定的惯例，当 RCP值大于 99.73%
时，则可以认为假设父与孩子具有亲生
关系。 如果 RCP值达不到 99.73%时，则
可以认为假设父与孩子不具有亲生关系。
小 结
1.掌握：掌握基因诊断的基本概念、原理；
基因诊断中常用的分子生物学技术；血
红蛋白病、杜氏营养不良症的基因诊断
方法。
2.熟悉感染性、肿瘤疾病的基因诊断策略
及诊断方法；
1.Southern blotting的原理、过程
及应用。
2.PCR,RT-PCR,LCR,RNA-
PCR的基本原理。
通过检索 Genebank(美国基因 \蛋白数据
库 ),EMBL(欧洲分子生物学实验室数据
库 )和 DDBJ(日本国家遗传研究所基因数
据库 )DNA序列数据库
