兽医免疫学适用专业：动物医学授课班级,2005级任课教师：文 明 (博士 )
2007年 9月～ 2008年 1月第一章 绪论第二章 抗原第三章 免疫系统第四章 抗体第五章 非特异性免疫第六章 特异性免疫第七章 变态反应第八章 免疫学实验技术第九章 免疫学防治技术第八章 免疫学实验技术免疫学实验技术是指利用免疫反应特异性的原理,建立的各种检测与分析以及建立这些技术的各种制备方法。
包括：
（ 1）免疫血清学技术 如沉淀试验等；
（ 2）细胞免疫学技术 如免疫细胞功能鉴定等；
（ 3）免疫学制备技术 如高免血清制备等。
第一节 免疫血清学技术一、免疫血清学技术的类型
（ 1）凝聚性反应：凝集试验和沉淀试验
（ 2）标记抗体技术：荧光抗体技术、酶标抗体技术、放射性同位素标记抗体技术、发光标记抗体技术等
（ 3）有补体参与的反应：如补体结合反应
（ 4）中和反应：如病毒中和试验、毒素中和试验
（ 5）免疫复合物散射技术：如激光散射免疫技术
（ 6）电免疫反应：如免疫传感器技术
（ 7）免疫转印技术：如 Western Blotting
抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为 血清学反应 或 免疫血清学技术。
1,特异性与交叉性具有高度特异性
The ability of an individual antibody combining site to
react with only one antigenic determinant.
The ability of a population of antibody molecules to
react with only one antigen.
若存在共同抗原，则发生交叉反应。
The ability of an individual Ab combining site to
react with more than one antigenic determinant.
The ability of a population of Ab molecules to react
with more than one Ag
二、免疫血清学反应的一般特点
2,抗原抗体结合机理
(1) 可逆性，分子表面结合
(2) 比例适当
(3) 存在二阶段性，即结合阶段和可见阶段
Ab
Ag
High Affinity
Ab
Ag
Low Affinity
Ag excess Equivalence – Lattice formationAb excess
3,免疫血清学反应的影响因素
(1) 电解质 (2) 温度 (3) 酸碱度 (4) 振荡 (5) 杂质三、凝聚性试验抗原与相应抗体结合形成免疫复合物，在电解质存在下，
免疫复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物，以此判定是否存在相应的抗体或抗原，称为凝聚性试验。
根据参与反应的抗原性质不同，可分为两大类：
（ 1）凝集试验 (agglutination test)
主要是颗粒性抗原参与
（ 2）沉淀试验 (precipitation test)
主要是可溶性抗原参与
（一）凝集反应当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时,在一定浓度的电解质环境中,抗原凝集成大小不等的凝集块,叫凝集反应 。
凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。
即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。
凝集试验的种类
（ 1）直接凝集试验,颗粒性抗原
（ 2）间接凝集试验,可溶性抗原
（ 3）病毒的血凝与血凝抑制试验
（ 4）乳胶凝集试验
1、直接凝集试验颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应 。
（ 1）玻片凝集反应
1,取清洁玻片一张,用接种环分别取诊断血清,诊断血清和生理盐水于玻片三个位置上 。
2,无菌用接种环取待检细菌培养物少许,分别混合于其中第一点诊断血清和生理盐水上 。
3,同法取对照细菌培养物少许,于第二点诊断血清混匀 。
4．轻轻摇动玻片，经 1-2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块，即为阳性反应；仍为均匀的乳浊液，即为阴性反应。
（ 2） 试管凝集反应为一种定量试验,用已知抗原检查血清中有无特异抗体,
并测定其相对含量 。
1,取 7只洁净小试管于管架,分别加 0.5mL生理盐水 。
2,在第 1管中加 1:10稀释血清 0.5mL,混合后吸出 0.5mL
毫升于第 2管,同样混匀后吸出 0.5mL于第 3管 。 依次类推,稀释到第 6管,吸 0.5mL弃去 。 第 7管不加血清作为对照；
3,用移液管吸取待检抗原,分别加每管 0.5mL；
4,同法于第 2排各管中加入伤寒 O菌液 0.5mL。
5．将各管振荡混匀，放 37℃ 水浴箱中 2—4小时或 37℃
孵育箱中过夜次日取出观察结果。
2,间接凝集反应将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。
间接血凝试验的分类：
（ 1）正向间接凝集试验
（ 2）反向间接凝集试验
（ 3）间接凝集抑制试验
（ 1） 间接血球凝集试验 (间接血凝试验 )
间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的 。 将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面,此时红血球即称为,致敏红血球,。 这种致敏的红血球具有细菌的抗原性,与相应的抗血清相遇可产生凝集现象 。
间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/6
4
1/1
28
1/2
56
1/5
12
1/1024 Po
s.
Neg
.
Titer
64
8
512
<2
32
128
32
4
Patient
1
2
3
4
5
6
7
8
间接血凝试验间接血凝抑制试验
+?
Prior to Test
+?+
Test
Patient’s sample
可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫 沉淀反应 (Precipitation)。
由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。
为了求得抗原与抗体的适宜比例,保证有足够的抗体,
而且抗原分子小,具有较大的反应面积,因此操作上通常是稀释抗原,不稀释抗体 。
沉淀反应的种类有 环状沉淀试验,絮状沉淀试验,琼脂扩散试验 及 免疫电泳试验 等 。
（二）沉淀试验沉淀反应试验的类型
（ 1）液相沉淀试验如絮状沉淀试验、环状沉淀试验等
（ 2）凝胶扩散试验如琼脂扩散试验
（ 3）免疫电泳试验如免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等
1,环状沉淀反应当抗原与相应抗体形成接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。
阳性对照 阴性对照 待检样本血清抗原
2,琼脂扩散试验琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应 。
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中与抗原相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散试验广泛地用于抗原成分的分析。
琼脂扩散试验结果双扩散试验结果示意图
A：已知抗体
a,b：阳性对照； c,d,e,f：被检材料抗原特异性与沉淀线形状的关系
a,b为抗体； A,A’,B为抗原；
A,B完全不同 ； A,A’部分相同
（ 1） 免疫电泳试验免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，
然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。
3、免疫电泳技术
（ 2） 对流免疫电泳试验对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法 。 此方法能在短时间内出现结果,故可用于快速诊断,敏感性比琼脂扩散试验高 10-15倍 。
抗体分子在 PH8.6条件下只带微弱的负电荷，且其分子量较大，在电场中游动慢。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。
对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图
（ 3） 火箭电泳试验火箭电泳实际是一种定量免疫电泳 。 其原理为：在电场作用下,抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动,二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线,而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系,因此本法可以测定样品中抗原的含量 。
四、标记抗体技术将某些物质标记在抗体分子上，通过抗原与抗体的特异性结合和标记物的敏感性检测，显示抗原抗体复合物的存在，这种技术称为抗体标记技术。
根据标记物的不同，可分为酶标抗体技术荧光抗体技术同位素标记技术
(一 )酶标抗体技术 (Enzyme-labelled antibody technique)
是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。
1、原理酶标记抗体，既不影响抗体的免疫反应性，也不改变酶的催化活性；
加入酶底物后，酶可使其（供氢体）由无色的还原型转化为有色的氧化型。
这种有色反应的颜色变化与样本中抗原或抗体的量成正比，且能用分光光度计进行测定 。
2、用于标记的酶常用的有辣根过氧化物酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶葡萄糖氧化酶半乳糖苷酶但最常用的是,辣根过氧化物酶碱性磷酸酶辣根过氧化物酶（ Horseradish peroxidase,HRP）
是从植物辣根中提取得到的一种过氧化物酶 。
HRP催化的底物有：
（ 1） 邻苯二胺 (O-phenylenylendiamine,OPD)
为橙色，最大吸收波长为 490nm。
适用于 ELISA。
（ 2） 3,3’二氨基联苯胺 (3,3‘-diaminobenzidine,DAB)
适用于免疫组化和免疫印迹。
碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase,AP）
是从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取的一种酶。
其催化底物为对硝基苯磷酸盐，黄色，吸收波长为 400nm。
3、常用的酶标抗体技术
(1)酶标抗体组化技术标本制备与处理 滴加酶标抗体 显色反应 标本观察
(2) 酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）
包被 洗涤 滴加酶标抗体 底物显色 酶标仪测定
(二 )荧光抗体标记技术
（ Fluoresent-labelled antibody technique）
是应用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析相应抗原或抗体的一种方法。
1、原理荧光素在超低浓度时可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
2、荧光素能产生明显荧光并作染料用的有机化学物质，称为荧光素。
目前，常用的荧光素有：异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明 (RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明 (TMRITC)。
最常用的是 FITC，它为一种黄色粉末，分子量为 389，最大发射光谱为 520～ 600nm，呈明亮的黄绿色荧光。
3、荧光抗体技术
（ 1）标本制备：涂片、压片；冰冻切片、石蜡切片等
（ 2）荧光抗体染色：有直接法和间接法
（ 3）荧光显微镜观察：光源为高压汞灯；要滴加缓冲甘油
(三 )放射免疫标记技术 (Radioimmunoassay,RIA)
1、原理放射性同位素在核衰变时，会发射雏 α,β 或 γ 射线，
这些射线可用仪器探测出来。
如,3H释放的射线，可用液体闪烁仪检测；
32P和 35S的射线。可井型闪烁计数计检测；
另外，也可通过放射自显影进行检测。
2、标记用的放射性同位素
3H：半衰期为 12.35年
125I：半衰期为 60.25天
32P：半衰期为 14.28天
35S：半衰期为 87.40天
3、应用
（ 1）疾病诊断
（ 2）微量活性物质的测定
（ 3）药物监测第二节 细胞免疫学技术
1、细胞免疫学技术的类型,
（ 1） T细胞及其亚群的计数，如 玫瑰花环试验 等
（ 2） T细胞活性测定，如 淋巴细胞转化试验 等
（ 3）淋巴因子检测
（ 4） K细胞及 NK细胞活性试验一、概述
2、细胞免疫学技术的应用
（ 1）测定动物的细胞免疫状态及水平
（ 2）测定注射后动物的细胞免疫反应
（ 3）筛选免疫增强剂或抑制剂，研究化学药物及其疗法对动物机体免疫技能的影响
（ 4）测定淋巴因子的活性及效价水平二,红细胞玫瑰花环试验玫瑰花环试验,又称为花结试验 。 是测定淋巴细胞数量和功能的一种方法 。
28
T 细胞的 E 玫瑰花环试验
T和 B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于 T淋巴细胞表面具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成 E花环，因此,T细胞也称为 红细胞花瓣形成细胞 。
根据 E— 玫瑰花环形成率，可间接判断机体细胞免疫力。目前，
已广泛应用于临床，作为 测定细胞免疫状态 的一个指标。
三,淋巴细胞转化试验正常机体 T淋巴细胞在体外培养过程中受到特异性抗原或有丝分裂原刺激,可转化为淋巴母细胞 。 细胞免疫缺陷时,患恶性肿瘤或某些其他疾病时,转化率显然降低 。 目前,最常用 植物血凝素 (PHA)作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率,从而判定其细胞免疫功能,称为 PHA刺激淋巴细胞转化实验 。
方法：
（ 1） 采肝素抗凝血,37℃ 静置 2小时,吸取血浆层入另一无菌试管,2000rpm离心 10分钟,弃上清液,用 199培养液将沉淀白细胞配成 1ⅹ 107/mL细胞悬液 。
（ 2） 取细胞悬液加入含有细胞培养液的培养瓶中 。
（ 3） 按每毫升营养液加 30ugPHA加入 PHA。
（ 4） 37℃ 孵育 68— 72小时,其间每天翻动 1-2次 。
（ 5） 振荡培养瓶,将细胞重新悬起,移入试管中 。
（ 6） 1000rpm离心 5分钟 。
（ 7） 弃去上清取沉淀物滴于载玻片上,干燥,瑞氏染色镜检 。
（ 8）计算淋巴细胞的转化率：
％化淋巴细胞数转化淋巴细胞数＋未转 转化淋巴细胞数淋巴细胞转化率＝ 100?
第三节 免疫学制备技术免疫学制备技术是免疫学检测的第一步免疫学制备技术是指制备与免疫检测有关的技术，包括抗原制备、抗体制备、抗体纯化 和 抗体标记 等。
一,免疫血清的制备
1,抗原制备
2,免疫方法
（ 1）选择健康雄兔
（ 2）免疫注射二、抗体纯化三、抗体标记第一次（ 1d）：脚底部注射 0.5mL
第二次（ 7d）：腘淋巴结注射 0.5mL
第三次（ 14d）：皮下注射 1.0mL
第四次（ 21d）：静脉注射 1.0mL
1．免疫学实验技术的三大类型。
2．免疫血清学技术的一般特点。
3．影响免疫血清学反应的因素。
4．凝集反应与沉淀反应的概念。
5．酶标抗体技术的原理及常用标记酶。
6．荧光抗体技术的原理及常用荧光素。
7．简述常见的几种细胞免疫学技术。
2007年 9月～ 2008年 1月第一章 绪论第二章 抗原第三章 免疫系统第四章 抗体第五章 非特异性免疫第六章 特异性免疫第七章 变态反应第八章 免疫学实验技术第九章 免疫学防治技术第八章 免疫学实验技术免疫学实验技术是指利用免疫反应特异性的原理,建立的各种检测与分析以及建立这些技术的各种制备方法。
包括：
（ 1）免疫血清学技术 如沉淀试验等；
（ 2）细胞免疫学技术 如免疫细胞功能鉴定等；
（ 3）免疫学制备技术 如高免血清制备等。
第一节 免疫血清学技术一、免疫血清学技术的类型
（ 1）凝聚性反应：凝集试验和沉淀试验
（ 2）标记抗体技术：荧光抗体技术、酶标抗体技术、放射性同位素标记抗体技术、发光标记抗体技术等
（ 3）有补体参与的反应：如补体结合反应
（ 4）中和反应：如病毒中和试验、毒素中和试验
（ 5）免疫复合物散射技术：如激光散射免疫技术
（ 6）电免疫反应：如免疫传感器技术
（ 7）免疫转印技术：如 Western Blotting
抗原与相应抗体在体内和体外均能发生特异性结合，因抗体主要来自血清，因此在体外进行的抗原抗体反应称为 血清学反应 或 免疫血清学技术。
1,特异性与交叉性具有高度特异性
The ability of an individual antibody combining site to
react with only one antigenic determinant.
The ability of a population of antibody molecules to
react with only one antigen.
若存在共同抗原，则发生交叉反应。
The ability of an individual Ab combining site to
react with more than one antigenic determinant.
The ability of a population of Ab molecules to react
with more than one Ag
二、免疫血清学反应的一般特点
2,抗原抗体结合机理
(1) 可逆性，分子表面结合
(2) 比例适当
(3) 存在二阶段性，即结合阶段和可见阶段
Ab
Ag
High Affinity
Ab
Ag
Low Affinity
Ag excess Equivalence – Lattice formationAb excess
3,免疫血清学反应的影响因素
(1) 电解质 (2) 温度 (3) 酸碱度 (4) 振荡 (5) 杂质三、凝聚性试验抗原与相应抗体结合形成免疫复合物，在电解质存在下，
免疫复合物相互凝聚形成肉眼可见的凝集小块或沉淀物，以此判定是否存在相应的抗体或抗原，称为凝聚性试验。
根据参与反应的抗原性质不同，可分为两大类：
（ 1）凝集试验 (agglutination test)
主要是颗粒性抗原参与
（ 2）沉淀试验 (precipitation test)
主要是可溶性抗原参与
（一）凝集反应当颗粒性抗原与其相应抗血清混合时,在一定浓度的电解质环境中,抗原凝集成大小不等的凝集块,叫凝集反应 。
凝集反应广泛地应用于疾病的诊断和各种抗原性质的分析。
即可用已知免疫血清来检查未知抗原，亦可用已知抗原检测特异性抗体。
凝集试验的种类
（ 1）直接凝集试验,颗粒性抗原
（ 2）间接凝集试验,可溶性抗原
（ 3）病毒的血凝与血凝抑制试验
（ 4）乳胶凝集试验
1、直接凝集试验颗粒抗原与抗体直接结合出现凝集现象叫直接凝集反应 。
（ 1）玻片凝集反应
1,取清洁玻片一张,用接种环分别取诊断血清,诊断血清和生理盐水于玻片三个位置上 。
2,无菌用接种环取待检细菌培养物少许,分别混合于其中第一点诊断血清和生理盐水上 。
3,同法取对照细菌培养物少许,于第二点诊断血清混匀 。
4．轻轻摇动玻片，经 1-2分钟后肉眼观察，出现乳白色凝集块，即为阳性反应；仍为均匀的乳浊液，即为阴性反应。
（ 2） 试管凝集反应为一种定量试验,用已知抗原检查血清中有无特异抗体,
并测定其相对含量 。
1,取 7只洁净小试管于管架,分别加 0.5mL生理盐水 。
2,在第 1管中加 1:10稀释血清 0.5mL,混合后吸出 0.5mL
毫升于第 2管,同样混匀后吸出 0.5mL于第 3管 。 依次类推,稀释到第 6管,吸 0.5mL弃去 。 第 7管不加血清作为对照；
3,用移液管吸取待检抗原,分别加每管 0.5mL；
4,同法于第 2排各管中加入伤寒 O菌液 0.5mL。
5．将各管振荡混匀，放 37℃ 水浴箱中 2—4小时或 37℃
孵育箱中过夜次日取出观察结果。
2,间接凝集反应将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关的颗粒载体上，然后与相应的抗体结合，也可出现颗粒载体的凝集现象，称为间接凝集反应。间接凝集反应比直接凝集反应敏感性为高，可用于微量抗体或抗原的检查。
间接血凝试验的分类：
（ 1）正向间接凝集试验
（ 2）反向间接凝集试验
（ 3）间接凝集抑制试验
（ 1） 间接血球凝集试验 (间接血凝试验 )
间接血球凝集试验是根据红血球表面的吸附作用而建立起来的 。 将细菌可溶性抗原提出使之吸附于红血球表面,此时红血球即称为,致敏红血球,。 这种致敏的红血球具有细菌的抗原性,与相应的抗血清相遇可产生凝集现象 。
间接血凝抗原的制备可用加碱或加热的方法使菌体中的多糖物质浸出，去除类脂以免干扰红血球的吸附作用。但如系蛋白质时则用来吸附的红血球需先用鞣酸予以处理。
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/6
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1/1024 Po
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64
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Patient
1
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间接血凝试验间接血凝抑制试验
+?
Prior to Test
+?+
Test
Patient’s sample
可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在下，两者比例适合，即可有沉淀物出现，叫 沉淀反应 (Precipitation)。
由于沉淀反应抗原多系胶体溶液。沉淀物主要是由抗体蛋白所组成。
为了求得抗原与抗体的适宜比例,保证有足够的抗体,
而且抗原分子小,具有较大的反应面积,因此操作上通常是稀释抗原,不稀释抗体 。
沉淀反应的种类有 环状沉淀试验,絮状沉淀试验,琼脂扩散试验 及 免疫电泳试验 等 。
（二）沉淀试验沉淀反应试验的类型
（ 1）液相沉淀试验如絮状沉淀试验、环状沉淀试验等
（ 2）凝胶扩散试验如琼脂扩散试验
（ 3）免疫电泳试验如免疫电泳、对流免疫电泳、火箭免疫电泳等
1,环状沉淀反应当抗原与相应抗体形成接触面时，如二者比例适当，接触面上可形成一个乳白色的环状物即为阳性沉淀反应。
阳性对照 阴性对照 待检样本血清抗原
2,琼脂扩散试验琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应 。
抗体在含有电解质的琼脂凝胶中与抗原相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。
如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线。因此，琼脂扩散试验广泛地用于抗原成分的分析。
琼脂扩散试验结果双扩散试验结果示意图
A：已知抗体
a,b：阳性对照； c,d,e,f：被检材料抗原特异性与沉淀线形状的关系
a,b为抗体； A,A’,B为抗原；
A,B完全不同 ； A,A’部分相同
（ 1） 免疫电泳试验免疫电泳实验是先将抗原物质在琼脂凝胶中做电泳分离，
然后于凝胶槽中加入抗体血清。使抗原抗体进行双向扩散，在比例适宜部位形成特异的抗原抗体沉淀弧线。每条沉淀弧线代表一组抗原抗体复合物，故可用抗原成分分析；且可以根据其迁移率与抗体所出现的特异反应进行鉴定。
3、免疫电泳技术
（ 2） 对流免疫电泳试验对流免疫电泳是在琼脂扩散基础上结合电泳技术而建立的一种简便而快速的方法 。 此方法能在短时间内出现结果,故可用于快速诊断,敏感性比琼脂扩散试验高 10-15倍 。
抗体分子在 PH8.6条件下只带微弱的负电荷，且其分子量较大，在电场中游动慢。琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原抗体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。
对流免疫电泳抗原孔、抗体孔位置示意图
（ 3） 火箭电泳试验火箭电泳实际是一种定量免疫电泳 。 其原理为：在电场作用下,抗原在含定量抗体的琼脂介质中泳动,二者比例在合适时在较短时间内形成状似火箭或锥形的沉淀线,而此沉淀线的高度常与抗原量成正比关系,因此本法可以测定样品中抗原的含量 。
四、标记抗体技术将某些物质标记在抗体分子上，通过抗原与抗体的特异性结合和标记物的敏感性检测，显示抗原抗体复合物的存在，这种技术称为抗体标记技术。
根据标记物的不同，可分为酶标抗体技术荧光抗体技术同位素标记技术
(一 )酶标抗体技术 (Enzyme-labelled antibody technique)
是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立起来的免疫检测技术。
1、原理酶标记抗体，既不影响抗体的免疫反应性，也不改变酶的催化活性；
加入酶底物后，酶可使其（供氢体）由无色的还原型转化为有色的氧化型。
这种有色反应的颜色变化与样本中抗原或抗体的量成正比，且能用分光光度计进行测定 。
2、用于标记的酶常用的有辣根过氧化物酶碱性磷酸酶酸性磷酸酶葡萄糖氧化酶半乳糖苷酶但最常用的是,辣根过氧化物酶碱性磷酸酶辣根过氧化物酶（ Horseradish peroxidase,HRP）
是从植物辣根中提取得到的一种过氧化物酶 。
HRP催化的底物有：
（ 1） 邻苯二胺 (O-phenylenylendiamine,OPD)
为橙色，最大吸收波长为 490nm。
适用于 ELISA。
（ 2） 3,3’二氨基联苯胺 (3,3‘-diaminobenzidine,DAB)
适用于免疫组化和免疫印迹。
碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase,AP）
是从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取的一种酶。
其催化底物为对硝基苯磷酸盐，黄色，吸收波长为 400nm。
3、常用的酶标抗体技术
(1)酶标抗体组化技术标本制备与处理 滴加酶标抗体 显色反应 标本观察
(2) 酶联免疫吸附试验 (Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）
包被 洗涤 滴加酶标抗体 底物显色 酶标仪测定
(二 )荧光抗体标记技术
（ Fluoresent-labelled antibody technique）
是应用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析相应抗原或抗体的一种方法。
1、原理荧光素在超低浓度时可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。
2、荧光素能产生明显荧光并作染料用的有机化学物质，称为荧光素。
目前，常用的荧光素有：异硫氰酸荧光素 (FITC)、四乙基罗丹明 (RB200)和四甲基异硫氰酸罗丹明 (TMRITC)。
最常用的是 FITC，它为一种黄色粉末，分子量为 389，最大发射光谱为 520～ 600nm，呈明亮的黄绿色荧光。
3、荧光抗体技术
（ 1）标本制备：涂片、压片；冰冻切片、石蜡切片等
（ 2）荧光抗体染色：有直接法和间接法
（ 3）荧光显微镜观察：光源为高压汞灯；要滴加缓冲甘油
(三 )放射免疫标记技术 (Radioimmunoassay,RIA)
1、原理放射性同位素在核衰变时，会发射雏 α,β 或 γ 射线，
这些射线可用仪器探测出来。
如,3H释放的射线，可用液体闪烁仪检测；
32P和 35S的射线。可井型闪烁计数计检测；
另外，也可通过放射自显影进行检测。
2、标记用的放射性同位素
3H：半衰期为 12.35年
125I：半衰期为 60.25天
32P：半衰期为 14.28天
35S：半衰期为 87.40天
3、应用
（ 1）疾病诊断
（ 2）微量活性物质的测定
（ 3）药物监测第二节 细胞免疫学技术
1、细胞免疫学技术的类型,
（ 1） T细胞及其亚群的计数，如 玫瑰花环试验 等
（ 2） T细胞活性测定，如 淋巴细胞转化试验 等
（ 3）淋巴因子检测
（ 4） K细胞及 NK细胞活性试验一、概述
2、细胞免疫学技术的应用
（ 1）测定动物的细胞免疫状态及水平
（ 2）测定注射后动物的细胞免疫反应
（ 3）筛选免疫增强剂或抑制剂，研究化学药物及其疗法对动物机体免疫技能的影响
（ 4）测定淋巴因子的活性及效价水平二,红细胞玫瑰花环试验玫瑰花环试验,又称为花结试验 。 是测定淋巴细胞数量和功能的一种方法 。
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T 细胞的 E 玫瑰花环试验
T和 B淋巴细胞表面具有不同的受体。由于 T淋巴细胞表面具有与绵羊红细胞结合的受体，能与绵羊红细胞非特异性结合，形成 E花环，因此,T细胞也称为 红细胞花瓣形成细胞 。
根据 E— 玫瑰花环形成率，可间接判断机体细胞免疫力。目前，
已广泛应用于临床，作为 测定细胞免疫状态 的一个指标。
三,淋巴细胞转化试验正常机体 T淋巴细胞在体外培养过程中受到特异性抗原或有丝分裂原刺激,可转化为淋巴母细胞 。 细胞免疫缺陷时,患恶性肿瘤或某些其他疾病时,转化率显然降低 。 目前,最常用 植物血凝素 (PHA)作为分裂原来检测受试者的淋巴细胞转化率,从而判定其细胞免疫功能,称为 PHA刺激淋巴细胞转化实验 。
方法：
（ 1） 采肝素抗凝血,37℃ 静置 2小时,吸取血浆层入另一无菌试管,2000rpm离心 10分钟,弃上清液,用 199培养液将沉淀白细胞配成 1ⅹ 107/mL细胞悬液 。
（ 2） 取细胞悬液加入含有细胞培养液的培养瓶中 。
（ 3） 按每毫升营养液加 30ugPHA加入 PHA。
（ 4） 37℃ 孵育 68— 72小时,其间每天翻动 1-2次 。
（ 5） 振荡培养瓶,将细胞重新悬起,移入试管中 。
（ 6） 1000rpm离心 5分钟 。
（ 7） 弃去上清取沉淀物滴于载玻片上,干燥,瑞氏染色镜检 。
（ 8）计算淋巴细胞的转化率：
％化淋巴细胞数转化淋巴细胞数＋未转 转化淋巴细胞数淋巴细胞转化率＝ 100?
第三节 免疫学制备技术免疫学制备技术是免疫学检测的第一步免疫学制备技术是指制备与免疫检测有关的技术，包括抗原制备、抗体制备、抗体纯化 和 抗体标记 等。
一,免疫血清的制备
1,抗原制备
2,免疫方法
（ 1）选择健康雄兔
（ 2）免疫注射二、抗体纯化三、抗体标记第一次（ 1d）：脚底部注射 0.5mL
第二次（ 7d）：腘淋巴结注射 0.5mL
第三次（ 14d）：皮下注射 1.0mL
第四次（ 21d）：静脉注射 1.0mL
1．免疫学实验技术的三大类型。
2．免疫血清学技术的一般特点。
3．影响免疫血清学反应的因素。
4．凝集反应与沉淀反应的概念。
5．酶标抗体技术的原理及常用标记酶。
6．荧光抗体技术的原理及常用荧光素。
7．简述常见的几种细胞免疫学技术。
