吸光光度法教学目的：掌握光度法的基本原理，了解光度分析条件的控制，分光光度法的应用范围。
教学重点：Beer定律；光度分析的应用。
教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。
吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。
分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。
6.1 概述
6.1.1吸光光度法的特点
1．光的基本性质紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50(m
单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。
互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见p216。
溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。
两互补色按一定比例混合后，可得到白色。
2．吸收光谱产生的原因由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有选择性。分子能级图，p215，图6－1。
吸收光谱曲线：A(C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。
a.(max与c无关 b,A(c
6.1.2光吸收的基本定律朗伯－比尔定律
1760年，Lambert用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光程成正比。1852年，Beer研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。
吸光度： 透光率：
2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度
（1）摩尔吸收（光）系数(
A＝Kbc b：cm c：mol/L
A=(bc (:摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1.mol-1
物理意义：一定(下，b＝1cm，c＝1 mol/L时的吸光度。
实际工作中不能用c＝1 mol/L的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。(能反映方法的灵敏度，光度法测定(：104，一般(:105已很灵敏。
（2）桑德尔灵敏度指数：S （(g/cm2）
在(max时，A=0.001下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。
S与(的关系：A＝0.001＝(bc，bc＝0.001/(
S=b(cm)(c(mol/dm3)(M(g/mol)(106(g/g＝((g/cm2)
<例>Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，(＝1.1(104,灵敏度高
Fe2+与磺基水杨酸络合物，(＝5.8(103,
双硫腙与Pb的(＝6.8(104，S＝M/(＝207/6.8(104=0.0030((g/cm2)
双硫腙与Cu的(＝4.52(104，S＝M/(＝63.5/4.52(104=0.0014((g/cm2) 灵敏度高
3．吸光度的加和性
共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1，A2，…An，则总吸光度为,
A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定）
6.1.3比色法和吸光光度法及其仪器
1.目视比色法：比较透过光的强度标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。
特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律也可用目视比色法，因为比较的是透过光。
2.光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。
3.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。
4.分光光度计及其基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器
（1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm氢灯或氘灯：紫外 160－350nm
（2）单色器滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。
棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/mm,衍射、干涉原理
（3）吸收池：玻璃:可见,石英:紫外、可见
（4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。
（5）显示器：检流计：72型。数字显示：722型。数字打印：UV－240。
6.2 光度分析法的设计
6.2.1显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML
1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，(>104；（3）有色化合物ML要稳定，不分解；
（4）ML的组成要一定（只ML无MLn）；（5）ML与L颜色差别大,吸收峰波长差：((>60nm.
2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂
6.2.2显色条件的选择
1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂L存在酸效应(L（H））
影响显色剂的溶度影响M的存在状态影响ML的组成和稳定性，如Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色
2-3 1：1 紫红
4-8 1：2 棕褐
8-10 1：3 黄色
2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。
4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
6．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。
干扰的消除：
制一定酸度，使干扰组分不生色。
掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。
（3） 选择适当的波长。
（4） 选择适当的参比液
（5） 分离干扰组分
6.2.3测量波长和吸光度范围的选择
1．测量波长的选择
(1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图6－7
吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T为65%-15%）(相对误差较小)
6.2.4参比溶液的选择
1．M、L均无色，可用蒸馏水作参比。
2,L无色，M有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。
3,L有色，M无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。
4．L、M均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。
改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。
6.2.5标准曲线的制作
配制一系列标准溶液，作A－c曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。
6.3 光度分析法的误差
6.3.1对朗伯－比尔定律的偏离
1．非单色光
2．介质不均匀引起的偏离
3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合
6.3.2 吸光度测量的误差光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差(T为定值。
一定的ΔT，对应的Δc不同，相对误差Δc/c不同。
c小，ΔT引起的Δc小，Δc/c大；c大，ΔT引起的Δc大，Δc/c大。
相对误差：
6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用
6.4.1示差吸光光度法
1．原理(高浓度示差吸光光度法)
选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。
a.先做((~(c标准曲线；b.测待测溶液的((；c.从标准曲线查出相应的(c；d.cx=c0+ (c
设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果：，示差光度法结果：
6.4.2双波长吸光光度法
1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物试样的分析
2．应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。
6.4.3酸（碱）离解常数的测定
HB = H+ + B－
在某波长(下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B－均有吸收，液层厚度b=1cm）则
6.4.4络合物组成的测定
（1）饱和法(又称摩尔比法) （2）连续变化法(又称等摩尔系列法)
固定一种组分(通常是金 cM+cR=c，改变cM和cR的相对量，
属离子M)的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物剂(R)的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列
[R]/[M]比值不同的溶液,溶液的吸光度。当溶液中络合物并配制相应的试剂空白作 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。
参比液，分别测定其吸光度。 当cM/c为0.5时，络合比为1:1；
以吸光度A为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。 当cM/c为0.33，络合比为1:2；
作业：P238 3,5,6 P239 8,11,12 P240 15,17,19
教学重点：Beer定律；光度分析的应用。
教学难点：光吸收原理；光度分析的准确度。
吸光光度法：基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法和分光光度法。
分光光度法的优点：灵敏、准确、快速、选择性好、适于微量组分的测定。
6.1 概述
6.1.1吸光光度法的特点
1．光的基本性质紫外光：200-400nm 可见光：400-750nm 红外：0.75-50(m
单色光：单一波长的光。 复合光：由不同波长的光组成的光。
互补色光：按一定比例混合，能够组成白光的两种光互称为互补色光。见p216。
溶液呈现的颜色是它吸收光的互补色。
两互补色按一定比例混合后，可得到白色。
2．吸收光谱产生的原因由于不同的物质微粒具有不同的量子能级，其能量差也不同，因此物质对光的吸收具有选择性。分子能级图，p215，图6－1。
吸收光谱曲线：A(C曲线。它反映某溶液对不同单色光的吸收程度，在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。
a.(max与c无关 b,A(c
6.1.2光吸收的基本定律朗伯－比尔定律
1760年，Lambert用实验指出，当光通过透明介质时，光的减弱程度与光通过介质的光程成正比。1852年，Beer研究证明了，光的吸收程度与透明介质中光所遇到的吸光质点的数目成正比，在溶液中即与吸光质点的浓度成正比。
吸光度： 透光率：
2．摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度
（1）摩尔吸收（光）系数(
A＝Kbc b：cm c：mol/L
A=(bc (:摩尔吸收系数，只与波长有关。单位：L.cm-1.mol-1
物理意义：一定(下，b＝1cm，c＝1 mol/L时的吸光度。
实际工作中不能用c＝1 mol/L的溶液测吸光度(A＝0.2-0.7)。(能反映方法的灵敏度，光度法测定(：104，一般(:105已很灵敏。
（2）桑德尔灵敏度指数：S （(g/cm2）
在(max时，A=0.001下，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量。
S与(的关系：A＝0.001＝(bc，bc＝0.001/(
S=b(cm)(c(mol/dm3)(M(g/mol)(106(g/g＝((g/cm2)
<例>Fe2+与邻二氮菲生成红色络合物，(＝1.1(104,灵敏度高
Fe2+与磺基水杨酸络合物，(＝5.8(103,
双硫腙与Pb的(＝6.8(104，S＝M/(＝207/6.8(104=0.0030((g/cm2)
双硫腙与Cu的(＝4.52(104，S＝M/(＝63.5/4.52(104=0.0014((g/cm2) 灵敏度高
3．吸光度的加和性
共存的多种吸光物质对同一波长光吸收的光度值分别为A1，A2，…An，则总吸光度为,
A=A1+A2+…+An （据此可进行多组分的测定）
6.1.3比色法和吸光光度法及其仪器
1.目视比色法：比较透过光的强度标准色阶：在相同条件下显色，目视比较。
特点：灵敏度高，准确度低，不同人看，结果不同，不符合朗伯－比尔定律也可用目视比色法，因为比较的是透过光。
2.光电比色法：比较溶液对某一波长光的吸收情况。比目视比色法的准确度和选择性好。
3.吸光光度法：与光电比色法的原理相同，只是二者获得单色光的方法不同，前者使用滤光片，后者使用光栅、棱镜，因而比光电比色法的准确度和选择性好。
4.分光光度计及其基本部件：光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显示器
（1）光源 钨丝灯：可见、红外 400－1000nm氢灯或氘灯：紫外 160－350nm
（2）单色器滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。
棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃棱镜:可见,石英棱镜:紫外、可见光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200条/mm,衍射、干涉原理
（3）吸收池：玻璃:可见,石英:紫外、可见
（4）检测器：光电转换器件（光电管、光电倍增光，光电二极管阵列）。利用光电效应，光照产生光电流，测定光电流的大小。
（5）显示器：检流计：72型。数字显示：722型。数字打印：UV－240。
6.2 光度分析法的设计
6.2.1显色反应：将待测组分转化成有色化合物的的反应。M＋L＝ML
1.要求：（1）选择性好；（2）灵敏度高，(>104；（3）有色化合物ML要稳定，不分解；
（4）ML的组成要一定（只ML无MLn）；（5）ML与L颜色差别大,吸收峰波长差：((>60nm.
2．显色剂：满足以上要求。有机显色剂
6.2.2显色条件的选择
1.溶液的酸度：M＋L＝ML（显色剂L存在酸效应(L（H））
影响显色剂的溶度影响M的存在状态影响ML的组成和稳定性，如Fe3＋－磺基水杨酸 pH 组成 颜色
2-3 1：1 紫红
4-8 1：2 棕褐
8-10 1：3 黄色
2.显色剂用量：显色剂过多有时会引起副反应，加入量要严格控制，可通过实验确定。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下进行。
4．溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大部分离解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
6．干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物，正干扰；生成无色络合物，负干扰。
干扰的消除：
制一定酸度，使干扰组分不生色。
掩蔽剂，与干扰组分生成无色物。
（3） 选择适当的波长。
（4） 选择适当的参比液
（5） 分离干扰组分
6.2.3测量波长和吸光度范围的选择
1．测量波长的选择
(1)“最大吸收原则”：选择被测物质的最大吸收波长的光作为入射光。(无干扰)(2)”吸收最大，干扰最小”：在最大波长处有其他物质干扰时。如图6－7
吸光度范围的选择：A:0.2-0.8（T为65%-15%）(相对误差较小)
6.2.4参比溶液的选择
1．M、L均无色，可用蒸馏水作参比。
2,L无色，M有色，可用不加显色剂的被测试液作参比溶液。
3,L有色，M无色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。
4．L、M均有色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液。
改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除于扰。
6.2.5标准曲线的制作
配制一系列标准溶液，作A－c曲线，待测组分的含量可以从标准曲线上查出。
6.3 光度分析法的误差
6.3.1对朗伯－比尔定律的偏离
1．非单色光
2．介质不均匀引起的偏离
3．由于溶液本身的化学反应引起的偏离。溶液本身离解、缔合、络合
6.3.2 吸光度测量的误差光度分析的准确度，由仪器本身决定的，对一台仪器来说读数误差(T为定值。
一定的ΔT，对应的Δc不同，相对误差Δc/c不同。
c小，ΔT引起的Δc小，Δc/c大；c大，ΔT引起的Δc大，Δc/c大。
相对误差：
6.4 其他吸光光度法和光度分析法的应用
6.4.1示差吸光光度法
1．原理(高浓度示差吸光光度法)
选用比cx浓度稍小的c0为参比,调透光率100%,相当于标尺扩大10倍。
a.先做((~(c标准曲线；b.测待测溶液的((；c.从标准曲线查出相应的(c；d.cx=c0+ (c
设普通光度法和示差光度法的测量误差为x%普通光度法结果：，示差光度法结果：
6.4.2双波长吸光光度法
1．原理：当没有合适的参比溶液时可选择双波长吸光光度法；广泛运用于环境试样和生物试样的分析
2．应用：（1）混浊试液中组分的测定；（2）单组分的测定；（3）两组分共存时的分别测定。
6.4.3酸（碱）离解常数的测定
HB = H+ + B－
在某波长(下，测量溶液吸光度（设酸HB和碱B－均有吸收，液层厚度b=1cm）则
6.4.4络合物组成的测定
（1）饱和法(又称摩尔比法) （2）连续变化法(又称等摩尔系列法)
固定一种组分(通常是金 cM+cR=c，改变cM和cR的相对量，
属离子M)的浓度，改变络合 配制一系列溶液，在有色络合物剂(R)的浓度，得到一系列 的最大吸收波长处测量这一系列
[R]/[M]比值不同的溶液,溶液的吸光度。当溶液中络合物并配制相应的试剂空白作 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。
参比液，分别测定其吸光度。 当cM/c为0.5时，络合比为1:1；
以吸光度A为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。 当cM/c为0.33，络合比为1:2；
作业：P238 3,5,6 P239 8,11,12 P240 15,17,19
