中国海洋大学细胞生物学实验指导
实验一 透射电子显微镜的原理与演示
解剖、观察和分析历来是生物学研究的基本手段。用于细胞解剖观察的主要工具就是显微镜，它是我们观察细胞形态最常用的工具。但其分辨率的最小数值不会小于0.2(m(紫外光显微镜的分辨率也只能达到0.1(m),这一数值是光学显微镜分辨率的极限。限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应)，显微镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,一般显微镜设计的最大放大倍数为1000~1500倍,因为将0.2(m的质点放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨认清楚。如果分辨率不再提高,只提高放大倍数毫无意义，并不能增加图像的清晰度。
在光学显微镜下小于0.2(m的一些细微结构，即便是再提高放大倍数也无法看清，这些结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultramicroscopic structure; ultrastructure)要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。于是，德国柏林大学的E,Ruska等便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，终于在1938年研制出了世界上第一台实用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)。目前所使用的显微镜,根据光源不同，可分为光学显微镜(简称光镜)和电子显微镜(简称电镜)两大类。前者以可见光(紫外光显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。电镜的问世，为细胞生物学的研究打开了局面。尤其是1953年瑞典学者成功制造出的超薄切片机以及随后相继出现的各种电子染色技术，使超薄切片技术得到快速发展和完善，从而大大推动了电镜在生物学研究领域中的广泛使用。
目前，电镜技术在细胞生物学研究领域中已由细胞水平发展到了分子和原子水平。英国学者A,Klug博士已将高分辨电镜技术应用到了生物大分子的结构测定上，在核酸-蛋白质复合体的晶体结构研究中做出了突出成就，在1982年他也因此获得了诺贝尔化学奖。现在，电镜已经成为细胞生物学、分子生物学和分子遗传学等不可缺少的重要研究手段之一，仍然将为细胞生物学等生物学领域的研究做出应有的贡献。
实 验 目 的
1,通过对透射电镜的结构和成像原理的讲解,了解透射电镜的工作原理和结构。
2,通过对电镜演示，了解电镜的操作方法及其在细胞生物学领域中的应用情况。
实 验 用 品
透射与扫描电镜、超薄切片机、幻灯机、投影仪、超薄切片示教片，以及各种细胞超微结构照片等。
实 验 原 理
一、电镜与光镜的对比
1,电镜出现的必然性普通光镜虽然仍是我们观察细胞形态最常用的工具，但由于其所用光源为可见光(或紫外光)，故其分辨率(Resolution)存在有一个无法突破的限制。分辨率是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示B其公式如下：
分辨率的数值越小，显微镜的分辨能力就越大，反之越小。由上述公式可以看出，分辨率的数值与波长成正比，与镜口率成反比。因此,要想得到高分辨率必须要缩短波长和加大镜口率，在普通光镜中我们使用的光源为可见光，波长为400~700nm (平均值为550nm),这个数值无法改变,唯一可改变的数值为镜口率(N.A.),N.A.的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率(refraction coefficient)的大小。其计算公式如下：
由此可见，镜口率与n及sin (/2成正比。制作镜头所用的光学玻璃的折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃越理想。空气的折射率为1，水为1.33，香柏油为1.515，(-溴萘为1.66。镜口角总是小于180°,所以sin (/2的最大值必然小于1。对于干燥物镜来说，介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95; 而油镜用香柏油为介质,镜口率可接近1.5,如果用溴萘则可达1.66。而就目前看来,光镜镜口率的最大值也只有1.78。根据计算，光镜分辨率的最小数值不会小于0.2(m(将1.6代入分辨率公式求得),约等于光波的一半，紫外光显微镜的分辨率也只能达到0.1(m,这一数值是光学分辨率的极限。限制光镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应),光镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,所以一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500(,因为将0.2(m的质点放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨认清楚。
但在一般想象中,似乎显微镜的放大倍数越大,观察到的物体应该越清楚。然而事实并不然，因为在这里涉及到有效放大和无效放大两个概念。有效放大是指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大; 而无效放大则是指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。此外,我们所看到的物象是否清楚不仅决定于放大倍数，而且还要受到一些物理因素和透镜质量的影响(例如球差和色差等),但归根到底,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率。如果分辨率不再提高，只提高放大倍数毫无意义,并不能增加图像的清晰度。
在光镜下即便是再提高放大倍数也无法看清亚显微结构(或超微结构)。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多(表1),电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。于是，德国柏林大学的E.Ruska等便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，终于在1938年发明了世界上第一台实用透射电镜。由此可见，电镜的问世是研究细胞超微结构的必然需要。
2,电镜与光镜的异同点电镜在结构上与光镜相同，均是由照明光源和透镜构成。所不同的是，(1)电镜所用照明光源为电子枪发射的高压电子束，而光镜为卤灯(或汞灯)产生的可见光(或紫外光)。(2)电镜所用透镜为电透镜，聚焦方式为电聚焦; 而光镜所用透镜为光学透镜,聚焦方式为机械聚焦。(3)电镜所用介质必须是真空，而光镜则为空气(详细区别见表2)。
电镜与光镜的成像原理也基本相同，但由于二者所用照明光源的不同，其成像机理又有着本质的区别。光镜的成像过程是对可见光的反射与吸收; 而电镜的成像过程则是通过对电子束的散射(图1)。
图1 电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解
二、透射电镜的结构与成像原理
1,透射电镜的结构电镜的基本构造见图2。在结构上电镜主要由真空系统、供电及保护系统、电子照明系统、成象系统和观察记录系统五大部分构成，其中,电子照明系统、成象系统和观察记录系统又被称为透镜系统或电子光学系统。
(1) 真空系统 电镜所用“光”源为高压电子束，这就要求其介质必须处于真空状态。一般说来，抽真空的意义有三,①防止灯丝的氧化损伤；②确保电子束在运行过程中不受空气分子的干扰(因为电子在运行过程中一旦遇到空气分子便被散射或吸收,会严重干扰电子的运动轨迹); ③去除空气分子对样品的污染。
真空系统由机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门、冷阱和储气罐等装置构成。机械泵可从大气状态(1 Pa)抽到1.3(10-5~10-6Pa; 油扩散泵可从1.3(10-6Pa抽到1.3(10-7 ~10-9Pa；冷阱中加入液氮后还可以从1.3(10-9Pa抽到1.3(10-10Pa。对于一般的电镜，真空度达到1.3(10-9Pa便可安全使用。但对于高分辨率的超高压电镜，真空度必需达到1.3(10-12Pa才能安全使用，这就要求除上述抽真空装置外,还必须使用离子泵和真空涡流泵等来大大提高真空度。
(2) 供电及保护系统 一般的电镜均拥有两个电源,一个是高电压低电流的高压电源，主要作用是产生高速电子；另一个是低电压高电流的透镜电源，主要作用是控制高速电子束的运动轨迹。另外,为了保证电压和电流的高度稳定,电镜还配备有高精度的稳压和稳流等保护与控制系统; 而且一旦电镜的某一部分发生故障后,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜。
(3) 电子照明系统 由电子枪和两级聚光镜组成,电子枪可产生高压电子束，在灯丝前还有一栅板,栅板中央有一孔经可调的小孔，用来控制电子束流的粗细,以阻挡一些散射电子。极细的高压电子束还要经过两级聚光镜进行会聚。第一聚光镜将电子束的直径缩小20~60倍，第二聚光镜再将电子束的直径扩大1~2倍，以期得到极细而均匀的电子束流。
(4) 成象系统 成象系统包括样品室、成像和放大装置。样品室为放置样品的部位，样品放置在一金属样品托中(可同时放置两个不同的样品)，直接插入到样品室中。此外，还有一冷阱直接与样品室相连。冷阱由一液氮罐和一金属导杆组成，金属导杆直接插入到样品室中。液氮罐中的液氮(-196℃)将低温经金属导杆直接传递到样品室中,低温金属导杆通过直接吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度，而且样品室内温度的降低还可防止电子的热漂移。
成像和放大部分分别由物镜、中间镜I、中间镜II和投影镜四级电磁透镜组成,透过样品的电子经过物镜后可被放大50倍，经中间镜I可被放大3倍,经中间镜II可被放大15倍，经投影镜可被放大200倍，共计可被放大约500,000倍。
(5) 观察记录系统 由观察室、放大镜和照相装置构成。观察室又包括荧光屏和铅玻璃窗。透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像。由于电子对人眼有害，故需要通过一个铅玻璃窗来观察，为了观察得更加清晰，在观察室外还配有一放大镜。鉴于电子形成的荧光图像衰减速度很快，所以一旦观察到理想的结构图像就需要尽快利用照相装置进行照相。值得注意的是，电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦，且底片还必须要经过预干燥处理。
2,透镜电镜的成像原理透射电镜之所以能获得高分辨率的图像,主要是因为它解决了两个关键问题,一是用电子枪发射出了波长极短的电子波,二是利用电磁透镜可控制电子的运动轨迹,即可对电子束进行聚焦、放大和成像。故透射电镜的有效放大倍数可高达数百万倍。
电子枪发射出的高速电子束在磁场中聚焦，从而被会聚到待观察的样品上；电子束在通过样品时会发生散射，但由于样品不同部位的质量厚度不同,即物质的组成结构不同，电子束发生散射的程度就不同；透过样品后的电子束撞击到荧光屏上，由电能转变成光能，形成了浓淡不同的图像。此图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构，因而可用来分析和研究样品的超微结构。
由此可见，在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来,否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子。这也是电镜的分辨率由电子束波长所决定的原因之所在。
另外，用于透射电镜的标本须制成厚度仅有0.05(m的超薄切片，而且由于电子束不能透过玻璃,因此这种切片需要用用特制的样品托，而不能用普通光镜所用的载玻片。
图2 光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解三、电镜的分类由于不同种类的电镜在结构和使用方法上或多或少都有一定程度的交叉或重叠,因此要试图把所有各种各样的电镜进行完全合理的分类是十分困难的,但就目前来讲,根据电子束和样品之间作用方式的不同对电镜进行分类是相对比较合理的一种方法,总的看来，电子束和样品之间的作用方式有如下四种,1) 物体透射电子；2) 物体发射电子；3) 物体反射电子；4)物体吸收电子。常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的表面图像,其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。其它两种作用方式的电镜由于与我们细胞生物学研究关系不大,在此就不再一一向大家介绍了。
四、电镜的操作演示与示教
1,电镜操作的演示学生参观分两组交叉进行，一组参观透射电镜，一组参观扫描电镜，然后再交换参观内容。
2,电镜照片的展示挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞结构的超微结构特征。
作 业
1,通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的区别。
2,区分细胞的超微结构和显微结构,写出各种示教细胞器的名称及其结构特征。
思 考 题
1,通过本实验的学习，比较光镜与电镜的主要异同点。
答,电子显微镜与光学显微镜的主要异同点
光学显微镜
电子显微镜
照 射 光
光 束
电子束
波长(nm)
长：200~750
短：0.003~0.008
介 质
空 气
真 空
透 镜
光学透镜
电磁透镜
分 辨 力
0.2~0.1(m
0.1nm
放大倍数
1,000
1,000,000
聚焦方式
机械聚焦
电聚焦
反 衬 度
吸收、反射
散射、吸收、衍射、相位
2,总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点。
答：常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的表面图像,其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。
[ 附 ] 扫描电镜的结构与成像原理在Oatley等学者的努力下，于1965年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发射出的次级电子，由带样电荷的栅极收集后,即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号,可用于电子成像。
1,扫描电镜的基本结构扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理及显示系统，以及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中,电子枪、电磁透镜、扫描线圈又被称为电子光学系统。
其电子枪所发射电子的波长一般为1~10nm，使用的电压范围为1~10KV。扫描线圈为扫描电镜所特有的结构，可作光栅状扫描，以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样品室较大，样品有专用的样品托，可在样品室内进行各不同方向的平移和倾转；另外，在样品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系统包括次级电子探测器、光电倍增管和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成，主要作用是收集由标本表面发射出的次级电子，并将其转变成光子；光电倍增管可将光子信号放大后，又将其转换成电压信号；而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像。
2,扫描电镜的成像原理电子枪发射出的电子束，经电磁透镜会聚成极细的电子束，并进而聚焦在待测样品表面；由于样品各不同部位的表面形貌不同，入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用后所产生的次级电子信号也不同; 此次级电子信号为探测器接受后,被转变成光子，传递给光电倍增管进行放大和转换；转换成的电压信号经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏上。
由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描，再加上显象管的偏转线圈电流与扫描线圈电流高度同步，因此，显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的次级电子数均是一一对应的，因此，显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。
综上所述，扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品的制备方法简便,不需经过超薄切片，经固定、干燥和喷金后即可；(2)扫描电镜采用的是次级电子成像; (3)扫描电镜所观察到图像景深长,图像富有立体感,但只能反映出样品的表面形貌; (4)图像的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×);(5)样品的辐射损伤及污染程度小等。但与透射电镜相比，扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性，如(1)分辨率还不够高; (2)无法显示样品内部的详细结构等。为此，近年来出现了一种新的电镜技术-冰冻蚀刻技术(freeze etching)，利用“复膜(replica)”在透射电镜下进行观察,既可观察到样品的内部结构,又可观察到富有立体感的图像,还提高了分辨率。
实验二 孚尔根反应（Feulgen Reaction）
Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
实 验 目 的
1,熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法
2,对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识
实 验 原 理
自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
实 验 用 品
一、器材 显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台。
二、材料 香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy's固定液固定的肝脏和精巢切片20片。
三、试剂
1,schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳,摇1min,用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
2,亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水,以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
3,1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
4,1%亮绿(light green) 亮绿1g，溶于100ml蒸馏水中。
5,30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。
实 验 方 法
Carnoy液固定
↓
95%酒精（2次）每次20-30min
↓
100%酒精2次(30 min,40 min)
↓
二甲苯透明
↓
石腊包埋
↓
切片贴片
↓
二甲苯I(20 min)
↓
二甲苯II(10 min)
↓
100%酒精5min
↓
95%酒精5min
↓
85%酒精5min
↓
70%酒精5min
↓
50%酒精5min
↓
30%酒精5min
↓
蒸馏水5-10min
↓
1 mol/L HCl的染色缸内（清洗一下）
↓
温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min
↓
取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液
（注意,这个步骤非常重要，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂）
↓
蒸馏水冲洗3次（使水解停止）
↓
Schiff试剂中染色40min
↓
用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)
↓
流水冲洗5 min
↓
蒸馏水洗片刻
↓
1%亮绿复染数秒钟
（注意,复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）
↓
水洗脱水封片
实 验 结 果
细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。
作 业
1,绘图表示Feulgen反应的染色结果,并验交Feulgen反应的永久切片1张。
2,总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
思 考 题
1,Feulgen反应的实验原理是什么？
答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
2,在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？
答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。
[ 附 ] Feulgen方法应注意的几个问题：
1,对照切片的制做进行Feulgen反应时,一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。
2,固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。
但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。
3,水解时间
Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
4,Schiff试剂的作用
Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
实验三 染色体的标本制作及其组型实验
长期以来，在真核生物中,染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体,对生物的遗传、变异、进化和个体发生,以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A.Levan合作,利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。
实 验 目 的
1,通过实验，初步掌握染色体标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理
2,通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法
实 验 原 理
自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点,1,用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处; 2,用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3,空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数,1,相对长度(relative length),指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2,臂指数(arm index),指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3,着丝粒指数(centromere index),指短臂占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%,该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4,染色体的臂数,对于端部着丝粒染色体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体，大于7.0为端部着丝粒染色体；着丝粒指数在50.0~37.5之间的染色体为中央着丝粒染色体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染色体，小于12.5为端部着丝粒染色体。
实 验 用 品
一、材料 小白鼠，蟾蜍二、器材普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各20把，100ml量筒5个，滴管20支，10ml小烧杯5个，10ml刻度离心管20支，试管架5个，染色用玻璃板5块,载、盖片各20片；显微镜20台,香柏油5瓶，擦镜纸5本，直尺20把，复印的染色体标本图20页。
三、试剂
1,秋水仙素,称取秋水仙素10mg加10ml的注射用水，即得0.1%的秋水仙素液,以此作为原液。在使用时，需将原液稀释50倍，即取0.1ml原液，加4.9ml注射用水，稀释后秋水仙素的浓度为 20蔳/ml。
2,生理盐水,哺乳动物及人类为0.9%的NaCl溶液，两栖类为0.7%的NaCl溶液。
3,Carnoy's固定液；甲醇:冰醋酸为3:1,必须现用现配。
4,Giemsa染液的配制；
吉姆萨粉(Giemsa stain)
l.0g
甘油(AR)
66ml
甲醇(AR)
66ml
将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。
5,磷酸缓冲液；
1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O,2.39g 溶于100ml双蒸水中。
1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于100ml双蒸水中。
取1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O液80ml、1/15 mol/L KH2PO4液 20ml混合即为pH=7.38之磷酸缓冲液。
如用无水Na2HPO4配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制；
A液:
Na2HPO4 9.47g
双蒸水 1000ml
B液:
KH2PO4 9.06g
双蒸水 1000ml
根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液。
表1 磷酸缓冲液配制比例
pH值
A液(ml)
B液(ml)
5.8
7.8
92.2
6.0
12.0
88.0
6.4
26.5
73.5
6.6
37.5
62.5
6.8
50.0
50.0
7.0
61.1
38.9
7.2
71.5
28.5
7.4
80.4
19.6
6,0.3% KCl水溶液（低渗液）。
实 验 方 法
染色体标本的制做取小白鼠注射秋水仙素
↓14~16h后断头法杀死，取睾丸洗净血污
↓
移入KCl的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色)
↓铜网过滤至刻度离心管中加入KCl低渗溶液于37℃水浴中低渗处理30min（使细胞膨胀）
↓
800~1000r/min离心8min
↓轻轻地去除上清液加入新配制的Carnoy's固定液，立即用吸管轻轻将细胞吹散
↓
室温固定8min
↓
800~1000r/min离心8min
↓弃去上清液加入新制Carnoy's固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液
↓
取出预冷的干净载玻片，以10~15cm高度滴加细胞悬液（细胞胀破）
↓
立即吹打载玻片
↓
多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥
↓
稀释Giemsa原液
Giemsa染色（倒置染色法，后有说明）30min
↓
用流水冲洗标本载玻片
↓
文火烤干显微观察
↓
选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相
[附]：倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架,使标本载玻片的标本面向下放置到支架上,在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。
二、染色体的组型实验
1,选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大10倍的清晰照片。
2,将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。
3,根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。
4,把相对长度与臂指数相近者配成一对。
5,参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。
6,用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。
实 验 结 果
在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体,其间相互散开,短臂收缩适中,二条姐妹染色单体大致平行分离,着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40条，多为端部和亚端部染色体，只有2对亚中部着丝粒染色体。
人类染色体为46条，可分为A、B、C、D、E、F、G七个群，其各自的基本特征见表2。
表2 人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征类别
包括染色体的序号
主 要 特 征
A群
第1~3对
体积大，中部着丝粒。第2对着丝粒略偏离中央
B群
第4~5对
体积大，中部着丝粒。彼此间不易区分
C群
第6~12对，X
中等大小,亚中部着丝粒。第6对的着丝粒靠近中央,X染色体大小介于第6与7对之间,第9对的长臂上有一次缢痕,第11对的短臂较长,第12对的短臂较短,彼此间不易区分
D群
第13~15对
中等大小，近端部着丝粒，有随体。彼此间不易区分
E群
第16~18对
中等大小。第16对为中央着丝粒，长臂上有一次缢痕；第17、18对为亚中央着丝粒，后者的短臂较短
F群
第19~20对
体积小，中部着丝粒。彼此间不易区分
G群
第21~22对，Y
第21、22对体积小,近端着丝粒,有随体,长臂常呈分叉状；Y染色体较前者略大,近端着丝粒,无随体,长臂常彼此平行
作 业
1,通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。
2,对于分散好的染色体，进行染色体计数。
3,对于呈非整倍性的染色体标本，分析其形成原因。
4,认真做好小鼠的染色体组型图。
思 考 题
1,请你分析一下在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些？
答： 秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。
低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。
离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。
固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。
载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。
用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。
滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。
2,本实验中，对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时,发现染色体数有的为40条，而有的则为20条，为什么？拥有20条染色体的单倍体细胞会是什么细胞？
答：有40条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞、精母细胞。有20条染色体的可能是已完成第一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现40条和20条染色体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。
3,从一般意义上讲，染色体标本制做的四大要点是什么？
答：A、植物血球凝集素（PHA）处理获得活跃分裂的细胞；
B、秋水仙素处理可使细胞分裂停止在中期；
C、低渗处理可使染色体分散；
D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上。
实验四 染色体G-带的分带技术
60年代以来，染色体分带技术有了突飞猛进的发展，特别是1970年以来，许多人类染色体分带技术的出现在细胞遗传学的科学研究中开创了一个新的时期。染色体分带技术可使我们准确无误地识别每一条染色体，使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变，这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定，特殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法，有助于染色体研究的发展，在临床上有着重要意义。
染色体分带技术最早(1968年)开始于瑞典科学家Caspersson及他的同事的开拓性工作，他们用氮芥喹丫因使染色体不同部位分化染色，显示出清晰的带纹。1971年，Pardue等又提出了吉姆萨(Giemsa)显带技术。在前人研究的基础上，人们引用不同的物理、化学方法处理染色体标本，并用一定的染料染色，可使每条染色体上出现明暗相间或深浅不同的带纹，称为染色体带。根据染色方法的不同可分为Q、G、C、R、N、T及Cd等几种类型的带，同时对显带机理进行了探讨。本实验重点介绍在动物细胞染色体中常用的G-小带产生的机理及方法。
实 验 目 的
1,学习染色体的G-带显示方法；
2,了解G-带染色体在细胞遗传学分析中的重要意义。
实 验 原 理
关于G-带形成的机理，到目前为止还没有完全定论，但有人提出了以蛋白质构象改变为基础的显带机理。此机理认为，带纹所反映的是蛋白质结构的差异，这种差异与DNA的功能活动相适应。G-带的形成与Giemsa染料的组成及染色特性分不开。Giemsa染料是由亚甲蓝(美蓝)、天蓝和曙红组成的复合染料，除曙红外，均为噻臻类染料，它只与DNA中的PO43-基结合而不与蛋白质结合，所以染色体着色首先是两个噻臻分子与DNA的结合，在此基础上结合一个曙红分子；形成2:1噻臻-曙红沉淀物。其次要有一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。染色体上含有高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻臻-曙红沉淀物的形成，这些区域相当于含高比例二硫键的氧化态蛋白质区域，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域(明带区)则为含疏基的还原态蛋白质，为亲水性蛋白质，对染料亲合力低，所以不显色。这表明，在G-带形成的过程中，蛋白质状态是一个主要因素。这与染色体的功能有关。如果染色体上某一区域的DNA为重复序列，转录活性低，相应地包装它们的蛋白质也较稳定，可能通过较强的二硫键形成很稳定的疏水的(-螺旋结构，成为染料沉淀物积累的环境，从而显示出阳带(暗带)。反之，如果染色体上某一区域的DNA富含具转录活性的结构基因，则功能上相对活跃，包装它们的蛋白质也较疏松，构象上类似(-折叠结构，经处理后二硫键断裂，还原为巯基，成为亲水性蛋白，不利于染料沉淀物的积累，所以着色浅，显示阴带(明带)。关于G-带形成的机理还有待进一步探讨。G-带有许多优点,染色是永久性的，以较长时间保存；带纹分析通常较好；用普通光学显微镜可观察等。
实 验 用 品
一、试剂,2mol/L NaCl溶液，5mol/L尿素溶液，Giemsa染液，磷酸缓冲液(pH6.8)。
二、器材,显微镜，恒温水浴箱，染色缸，滤纸，冰箱。
三、材料,小鼠染色体标本
实 验 方 法
老化3~7天的染色体标本
↓
置于37℃，pH7.0的NaCl和尿素的混合液中处理60min
↓
蒸馏水冲洗
↓
2% Giemsa染液(pH7.0)染色60min
↓
水冲洗
↓
晾干，二甲苯透明2~3min
↓
中性树胶封片
实 验 结 果
在显微镜下，可见分布在小鼠染色体全长上的宽窄不同的相间条带。带纹的多少随染色体的不同而异，另外还同染色体所处的时期不同而有差异，一般中期染色体带纹较少，早中期与晚前期染色体的带纹较多，前期染色体多呈颗粒状。
作 业
1,绘制2~3条小鼠染色体的G-带模式图。
2,解释早中期与晚前期染色体的带纹较多、而中期染色体带纹较少的原因。
思 考 题
1,染色体G-带的含义是什么？
答：将染色体标本用热、碱、胰酶、尿素、去垢剂或某些盐溶预先处理，再用Giemsa染料染色，可以显示类似带纹，称为G显带，G带显示的是染色体上富含AT的区域。
2,染色体G-带有何应用价值与应用前景？
答：G-带有许多优点,染色是永久性的，以较长时间保存；带纹分析通常较好；用普通光学显微镜可观察等。根据这一技术可识别出染色体的微小变化，如染色体的丢失、移位等。许多细胞系保留多个染色体标志亦用此法加以识别，从而可以特异的和确切的鉴别待测细胞。同时，G-带可使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变，这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定，特殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法，有助于染色体研究的发展。
实验五 PEG介导的动物细胞融合技术
细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。人工的细胞融合开始于20世纪50年代,60年代到70代作为一门新兴的技术,发展非常快,应用范围也极为广泛,除了同种类细胞间可以融合,种间远缘细胞也能融合,细胞与组织不同,不排斥异类、异种细胞,动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
目前,诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada,1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)(Pontecorvo,1975)和电激(Zimermann,1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城鸡瘟病毒，在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用；较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合,也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性,使用时先用紫外线将病毒灭活,稀释到一定浓度加入到细胞悬液中,诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。后两种方法则是利用化学和物理手段，暂时使质膜脂类分子的有序排列发生改变，待去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便有可诱导相接触的细胞发生融合。总之，这3种方法都是在相互接触的两细胞进行自我修复过程中融合的。
细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备,核质关系,体细胞的遗传和发育,新品种的培养,免疫作用,疾病的治疗和性状的改良,潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。
实 验 目 的
1,通过PEG介导的鸡血细胞融合实验,对体细胞融合有一个清楚的概念
2,并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术
实 验 原 理
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响。1,PEG的分子量与浓度,细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2,PEG的pH值,经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3,PEG的处理时间,处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4,融合时的温度,由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为38~40℃。
本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为,1,鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2,实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。
实 验 用 品
一、器材
1,主要设备,普通离心机、普通光学显微镜
2,小型器材,100ml量筒2个,滴管10支,10ml刻度离心管20支,载、盖片各20片二、材料 新鲜鸡血三、试剂
1,Alsever液制备葡萄糖(Glucose)
2.05g
枸椽酸钠
0.8g
氯化钠(NaCl)
0.42g
重蒸水
至100ml
2,0.85%生理盐水液
3,GKN液氯化钠
8g
氯化钾(KCl)
0.4g
Na2HPO4?2H2O
1.77g
NaH2PO4?H2O
0.69g
葡萄糖
2g
酚红(phenolred)
0.01g
溶于1000ml重蒸水中。
4,50% PEG液 (现用现配)
根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。
实 验 方 法
将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成1:4悬液 （抗凝效果最佳）
↓
4度冰箱保存
↓
取上述悬液加入生理盐水混匀
↓
1200r/min离心5分钟
↓弃上清上述离心速率重复离心两次(5min,10min)
（以达到去除细胞表面粘附物质的目的）
↓弃上清
加入适量GKN液，配成细胞悬液
↓
取悬液以血球计数法计数
↓
再用GKN液将红细胞的浓度稀释
↓
加入 50%的PEG液混匀
↓
吸取1~2滴镜检并计算出融合率
实 验 结 果
经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。
细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：
在实验中统计融合率时,要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。
作 业
1,绘出你所观察到的融合细胞的形态，并计算出细胞融合率。
2,请你写出细胞融合实验操作中应该注意的有关事项。
思 考 题
1,细胞融合方法主要有哪几类？各有何优缺点？
答：几类细胞融合方法的优缺点如下：
病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于存活；缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。
化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果好；缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细胞的存活率。
电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单；缺点为它除需要电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。
2,PEG法细胞融合的影响因素有哪些？
答：1,PEG的分子量与浓度,细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2,PEG的pH值,经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3,PEG的处理时间,处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4,融合时的温度,由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为38~40℃。
3,本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？
答：本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合；但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合方法进行融合实验。
实验六 线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
实 验 目 的
1,观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；
2,学习一些细胞器的超活染色技术。
实 验 原 理
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
实 验 用 品
一、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
二、试剂
1,Ringer溶液：
氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g)
氯化钾 0.25g
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml
2,10%、1/3000中性红溶液：
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。
3,1%、1/5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
三、材料人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。
实 验 方 法
人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上
↓
滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液
↓
用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞
↓
刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中
↓
染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)
↓
盖上盖玻片,显微镜下观察
二、植物细胞液泡系的超活染色与观察取豆芽的根尖
↓用刀片纵切根尖放入中性红染液滴中，染色5~10min。
↓
吸去染液，滴一滴Ringer液
↓
盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)
实 验 结 果
在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
作 业
1,绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布
2,绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布
思 考 题
1,用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?
答：不同的活体染色剂对不同的细胞器有染色专一性。詹纳斯绿B(Janus green B) 仅对线粒体具有专一性，而对液泡系没有专一性；中性红(neutral red)则对液泡系具有专一性，而对线粒体没有专一性。因此，用一种活体染色剂对细胞进行超活染色时，不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器。
2,小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅?
答：因为生长点处的细胞分裂旺盛，且较小，处于新生阶段，故液泡数量多、染色深；而延长区的细胞已经成熟，细胞分裂能力下降，且细胞较大，因此细胞中液泡数量变少、染色变浅。
3,高等动物和高等植物细胞中的液泡系(高尔基体)分布上有何不同?
答：高等动物中高尔基复合体一般都位于细胞核附近；而高等植物中高尔基体弥散于整个细胞中，不集中。
实验七 叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的,由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实 验 目 的
1,通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。
2,观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实 验 原 理
分离细胞器的常用方法是将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
实 验 用 品
一、器材
1.主要设备,普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材,500ml烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料 新鲜菠菜。
三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
实 验 方 法
一、叶绿体的分离与观察
新鲜的嫩菠菜叶
↓
洗净擦干去除叶梗脉
↓
取30克放入150ml氯化钠溶液
↓
入组织捣碎机匀浆
↓
低速匀浆（5000r/min）3~5min（破碎细胞）
↓
匀浆液
↓6层纱布过滤，取4ml
1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞）
↓取上清
3000r/min离心5min
↓保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体）
用氯化钠溶液悬浮
↓
光学显微镜下观察
二、菠菜叶手切片观察新鲜菠菜叶
↓
刀片切出一斜面置于载玻片上
↓
滴加1~2d氯化钠溶液
↓
盖上盖片显微镜下观察
实 验 结 果
一、叶绿体的分离和观察
1,普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2,以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。
3,加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
二、菠菜叶手切片观察
1,在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞,为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞,为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞,为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2,在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3,用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。
作 业
1,根据荧光观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。
2,概述滤镜系统的选用原则。
思 考 题
1,叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？
答：一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
在分离叶绿体时应注意操作要迅速，控制好离心速度和时间。同时弃上清时不要把沉淀荡起，再次加氯化钠溶液时应用胶头滴管吹匀混合液，力气不能过大，以免造成叶绿体破碎。最后一次加氯化钠溶液时应少加，以免所得叶绿体的浓度太小，不易观察到。
2,普通光学显微镜与荧光显微镜有何异同点？
答：相同点：1）均为光学显微镜；2）均可对生物样品进行定性和定量分析。
不同点：1）二者所用光源不同：普通光学显微镜用的是自然光，而荧光显微镜则多为紫外光；2）荧光显微镜含有一套特殊的滤镜系统；3）荧光显微镜还具有灵敏度高、特异性强等特点；4）荧光显微镜只能使用无荧光载玻片和无荧光油等。
实验八 细胞凝集反应
细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构，蛋白质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被（又称为糖萼）。许多研究结果表明：细胞间的分子识别、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生等均与细胞外被（分枝状寡糖链）有关。凝集素能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”，从而达到细胞凝集的效果。
实验目的
1、观察血细胞的凝集现象；
2、掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
实验原理
凝集素（1ectin）是一类含糖的（少数凝集素例外）并能与糖进行专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素促使细胞凝集主要是由于它能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”的结果，且加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。
实验用品
一、器材显微镜、托盘天平、载玻片若干、滴管2支、离心管2支。
二、试剂
PBS缓冲液：称取NaCl 7.2g、NazHP04 1.48g、KH2P04 0.43g、加蒸馏水，定容至l000 mL，调pH值到7.2。
三、实验材料
1．土豆块茎。
2．2％的红细胞以无菌方法抽取兔子静脉血液（加抗凝剂），用生理盐水洗5次，每次2000 r/min，离心5 min，最后按沉淀压积的红细胞体积用生理盐水配成2％红细胞悬液
实验方法
称取土豆去皮块茎2g
↓
加10 mL PBS缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素）
↓
载玻片上滴一滴土豆凝集素
↓
再滴一滴2％红细胞液
↓充分混匀静置20 min
↓
低倍显微镜下观察血球凝集现象
↓
以PBS液加2％血细胞悬液作为对照实验
实验作业
1．绘制简图，表示血细胞的凝集过程；
2．图示血细胞凝集的原理。
实验九 腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法
在机体的免疫过程中，巨噬细胞（M(）承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和衰老的细胞，以及传递抗原信息；M(将捕获的抗原进行加工处理后，把降解的抗原信息传递给T、B淋巴细胞。M(又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂，且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。
实 验 目 的
掌握巨噬细胞(M()体外吞噬异物能力的测定方法，观察机体的非特异性免疫现象。
实 验 原 理
巨噬细胞(M()在机体的非特异性免疫中具有重要作用，其吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。本实验采用测定小鼠腹腔M(吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对机体免疫状态的抑制作用。
实 验 用 品
一、材料
1,小白鼠6~10只，随机分为二组。
2,5%鸡红细胞悬液：用已灭菌的注射器，自健康鸡的翼下静脉采血1ml，放置于5倍体积的Alsever's溶液中。4℃条件下可保存一周。使用时用灭菌的生理盐水洗涤3遍(2000r/min，每次5min)，然后用生理盐水配成5%的浓度。
二、试剂
1,Alsever's溶液葡萄糖 2.05g
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O) 0.89g
氯化钠 0.42g
溶解后加蒸馏水至100ml，用柠檬酸(C6H8O7·H2O)调pH至7.2，超滤除菌或6.6(104Pa(10磅)灭菌20min，保存4℃冰箱备用。
2,Hank’s液
(1)贮存液(药品全部用AR试剂)，
甲液,①NaCl 80g,MgSO4·7H2O 1g,MgCl2·6H2O 1g，用双蒸馏水定容至450ml。
②CaCl2 1.4g双蒸馏水定容至50ml。
将①、②液混合，加氯仿1ml。
乙液,Na2HPO4·l2H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,酚红0.2g,葡萄糖l0g,用双蒸馏水定容至500ml,加氯仿lml。
(2)应用液:
贮存液甲:贮存液乙:双蒸馏水=1:1:18。6.6(104Pa (10磅)灭菌20min。4℃保存可使用1个月。临用前，用3.5%的NaHCO3调pH至7.2。
3,0.9%生理盐水(灭菌)
4,Giemsa染液
(1)贮存液:
称取Giemsa粉0.5g研细，再将33ml甘油逐滴加入，继续研磨至无颗粒。80℃水浴过夜，然后加入33ml甲醇。置棕色瓶中，于56℃放置24h后即可使用。
(2)应用液:
临用时取贮存液lml加l0ml pH7.4磷酸缓冲液，混匀后过滤。
5,甲醇
6,肝素钠溶液,用灭菌生理盐水配制。每20IU 0.1ml可抗凝1ml全血。
7,0.6%环磷酰胺溶液,用灭菌生理盐水配制。
三、设备保温箱、显微镜、带盖解剖盘．医用剪刀、镊子、刻度离心管及试管架、载玻片、滴管、酒精及碘酒棉球、擦镜纸、称量纸及滤纸。
实 验 方 法
实验前二天，给实验组小鼠腹腔注射0.6%的环磷酰胺(0.2ml/只)
对照组小鼠注射灭菌生理盐水
↓
每只小鼠注射pH7.2 的Hank液 2m1
(腹腔注射时进针切忌过深，针头方向最好向后，以免伤其内脏，使血管破损出血，影响实验取材)
↓
实验当天给小鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.5ml/只
↓2~3h后脱颈法处死小鼠立即由腹腔注入lml生理盐水
↓轻揉小鼠腹部约lmin，剪开腹部皮肤,肌肉层上开口滴管伸入腹腔吸出腹腔液，置于滴有肝素钠的离心管中混匀
↓
把腹腔液滴加在洁净的载玻片上
↓
将载玻片置于带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布)
↓37℃培养箱孵育30min
取出玻片，漂洗去上清液和末粘附在玻片上的细胞
(漂洗标准,在显微镜下检查无重叠细胞层，且水流不要过急以免将贴附在玻片上的M(冲掉)
↓室温下晾干或用吹风机吹干载玻片
Giemsa染液染色5~l0min
↓
冲洗去多余染液，晾干
↓
高倍镜或油镜下观察并计数计算出吞噬百分率和吞噬指数
[附]：吞噬百分率 = 吞噬鸡红细胞的M(数/M(总数(l00
吞噬指数 = M(吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的M(总数
作 业
根据你的观察和计数，计算M(的吞噬百分率和吞噬指数。
实验十 动物细胞微丝束的光学显微镜观察
细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纤丝（filament）两大类；另外，胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同，纤丝又可分为微丝（microfilament，MF）、中间丝（intermediate filament，IF）和粗丝（thick filament，TF）三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维（F-actin），直径为6~7 nm，又名肌动蛋白丝，其长度不定，多分布在近细胞膜的下方。微丝在不同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stress fiber）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）显示微丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细胞中普遍存在，于活体内哪些细胞具有张力纤维研究得还比较少，比较明确的是，一些迅速运动的细胞如巨噬细胞、变形虫等缺乏张力纤维。张力纤维的组成除了肌动蛋白外，还有肌动蛋白结合蛋白如α-辅肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白等沿着张力纤维的轴向进行周期性地分布，类似于肌原纤维的组织分布，并具有收缩功能。
实 验 目 的
1,掌握考马斯亮蓝R250染动物细胞胞质微丝的方法。
2,对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。
实 验 原 理
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
实 验 用 品
一、材料 体外培养的动物细胞。
二、试剂
1,0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3)
50 ml
NaCl
0.15 mol/L
重蒸馏水
至1000 ml
其中PB的配法,0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
2,M-缓冲液咪唑(imidazole,pH6.7)
50 mmol/L
KC1
50 mmol/L
MgCl2
0.5 mmol/L
EGTA
l mmol/L
EDTA
0.l mmol/L
巯基乙醇(mercaptoethanol)
l mmol/L
甘油
4 mmol/L
用1 mol/L HCl调pH至7.2。
3,1%的Triton X-l00/M-缓冲液
4,0.2%考马斯亮蓝R250染液，溶剂是:
甲醇
46.5 ml
冰醋酸
7 ml
蒸馏水
46.5 ml
5,30%戊二醛-PB溶液，pH7.2
三、器材 显微镜、载玻片、35mm小染缸。
实 验 方 法
细胞培养在盖玻片上，生长密度达++~+++时取出
↓
PBS液轻轻涮洗
↓
l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min（室温或37℃）
（Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰）
↓
M-缓冲液轻轻洗细胞3次（稳定细胞骨架）
↓
3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min
↓
PBS液洗细胞若干次
↓滤纸吸干
0.2%考马斯亮蓝R250染片30min
↓
小心地用水漂洗
↓
空气干燥
↓
直接观察或用树脂封片
实 验 结 果
用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布。在成纤维样细胞如CHO、包皮等细胞中，纤维沿细胞长轴排列:而在上皮样细胞，如HeLa等，因细胞呈多边形，张力纤维有交叉，沿不同方向跨越胞体伸向细胞突起处或粘着斑处。
图 细胞内骨架纤维的显微照片（考马斯亮蓝R250染色）
注意：张力纤维是一动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型；反之，张力纤维收敛略现弯曲；当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。
作 业
描绘你所观察到的细胞张力纤维图像。
实验十一 杂交瘤技术
杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面,具有极其远大的应用前景,因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。
实 验 目 的
1,掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法
2,能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体
实 验 原 理
杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。
一、动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
二、细胞融合
B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
三、杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活,但B淋巴细胞是正常细胞,故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型,缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
实 验 用 品
一、器材
1,主要设备,无菌室一间(或超净台一台),普通离心机一台,倒置显微镜一架,酶联免疫检测仪一台,CO2恒温培养箱一台,恒温水浴一台,高压灭菌名锅一个。
2,小型器材,血细胞计数板二块,25ml和50ml培养瓶20个,96孔和24孔培养板各10块,40孔酶标板20块,50ml塑料离心管6支,10ml玻璃离心管10支,1ml、5ml和10ml吸管各4支,6cm培养皿2套,100ml和50ml培养液瓶各10个,1ml、5ml和10ml注射器各2支,小滴管8支,玻璃套管4,中、小型手术剪刀各2把,中、小型手术镊各2把,6号针头8个,L型6号针头2个,500ml和1000ml杯各2个,酒精灯一盏,不锈钢网(55cm 200目)2块,解剖盘2个,培养液抽滤灭菌装置一套,橡皮塞若干,70%酒精棉若干。
二、材料
8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒(用作抗原)。
三、试剂
RPMI 1640培养基,小牛血清(FCS),GKN液,50%PEG液,HT培养液,HAT培养液,0.5% 台盼蓝(trypan blue),1 mol/L NaOH,1 mol/L HCl,包被液,底物反应液,辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG,青霉素,链霉素。
[附] 各种试剂配方如下：
1,RPMI 1640基本培养液
RPMI 1640粉10g,青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml,用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22(m滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
2,RPMI 1640完全培养液
RPMI 1640基本培养液 80ml
无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml
(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)
3,100×HT母液次黄嘌呤(H) 136.1mg
胸腺嘧啶(T) 38.8mg
三蒸水 100ml
于50℃溶解后，用0.22蕀滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
4,100×A母液氨基喋呤(A) 1.76g
三蒸水 90ml
滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl调pH至7.5，加三蒸水至1000ml,用0.22(m滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
5,HT培养液
RPMI 1640完全培养液 1000ml
100×HT母液 10ml
6,HAT 培养液
RPMI 1640完全培养液 1000ml
100×HT母液 10ml
100×A母液 10ml
7,GKN 液配方同实验三，所不同的是需用0.22(m滤膜抽滤除菌。
8,50% PEG(聚乙二醇)溶液取分子量1000Da的PEG 5g 用高压灭菌溶化，冷却50℃时加入等体积已预热至50℃的无菌GKN，充分混匀后分装冻存备用。在融合时用1mol/L NaOH调pH至8.0~8.2左右。
9,包被液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
10,PBSS-Tween20缓冲液
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Tween 20 0.5ml
加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
11,底物缓冲液
A液,0.1mol/L 柠檬酸
B液,0.2mol/L Na2HPO4
取A液 24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸馏水至100ml。
12,底物反应液(使用液)
底物缓冲液 100ml
邻苯二胺(OPD) 40mg
过氧化氢(H2O2) 150ml
实 验 方 法
杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤。
一、动物免疫动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。
由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能助于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了,因此在实验时有一定的随机性；此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激,会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖,易形成“优势克隆”,因此所产生单克隆抗体的种类较少,很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。此外此法的免疫程序太长，费时费力。而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。
在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。具体方法如下。
1,纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。
2,用戊巴比妥钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
3,无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原(人轮状病毒)液分别注射到两只小鼠脾脏内。
4,将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
5,免疫三天后取脾细胞进行融合。
二、细胞融合及HAT筛选细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。病毒介导的细胞融合方法要涉及仙台病毒的培养和灭活，尤其是仙台病毒的培养条件要求严格，过程比较复杂，因此现在一般不使用此方法。电融合为80年代刚刚兴起的一种融合方法，它除需要昂贵的电融合仪外，另外还需要特定的技术条件。目前最常使用的融合方法是PEG介导的细胞融合方法,该方法具有操作简便、快速省时且融合效果好等优点。本实验使用的是一种快速PEG融合方法，具体操作如下；
(一) 细胞悬液的制备(均在无菌条件下操作)
在杂交瘤技术中要使用三种细胞悬液；脾细胞悬液、SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞悬液和腹腔巨噬细胞(用作饲养细胞)悬液。
1,脾细胞悬液的制备取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血处死(收集流出血液制备阳性血清)，用70%精浸泡5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37GKN液清洗2-3次。向脾内注射0.2ml GKN液后(使脾脏膨胀以得于细胞散开)，放入培养皿中，加入5mlGKN，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000r/min心与5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液入37℃备用。
2,SP2/0-Ag14细胞悬液的制备将SP2/0-Ag14细胞用RPMI 1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代3天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3~5瓶(50ml的培养瓶)SP2/0 Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放入一个50ml塑料离心管中1000r/min离心5min(为省时可同脾细胞一同离心)，弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀,取0.1ml用活细胞计数，其余悬液放37℃备用。
3,腹巨噬细胞悬液的制备杂交瘤细胞开始生长时,需要有饲养细胞,一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。
取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培养液,按摩腹部1~2min后,用注射器抽出腹腔液(一般可抽出8~9ml)，放入一个50ml塑料离心管中,置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3~5块24孔或96孔培养板。可根据需要接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。
(二) 细胞融合及HAT筛选(在无菌条件下操作)
已计数脾细胞和骨髓瘤细胞按6:1的数量比例混合于离心管
↓
1000r/min离心5min
↓弃上清轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散
↓40℃预热1~2min
边摇边在45秒内匀速加工50% PEG溶液
↓
90秒内边摇边向管内加速加入37℃ GKN液
↓室温静置10min
1000r/min离心10分钟
↓
加入37℃的腹腔巨噬细胞悬液和40ml HAT培养液
↓
将细胞悬液分种于二块24孔板和96孔板
↓
37℃ 5% CO2孵箱中培养
↓
观察细胞的生长情况
↓
5天用HAT培养液半量换液10天用HT培养液半量换液
14天用HT培养液全量换液
↓
当杂交瘤细胞长满孔底面积的1/2~2/3时,即可取培养上清液进行抗体检测
三、抗体的检测杂交瘤技术所使用的抗体检测方法必须具有简便、快速、敏感而且能在短时间内检测大量样品的特点。常用的方法有酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IIF)、放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)和双相扩散法等。间接免疫荧光法需要使用荧光显微镜，价格昂贵，灵敏度也较低，而且不能用于可溶性抗原的抗体检测，但其优点是能进行反应的定位。放射免疫法操作较复杂，所用的液体闪烁仪及制剂价格昂贵，但其灵敏度较高。而酶联免疫吸附法则操作简便快速、灵敏度高(0.5ng/ml)，且适于大规模操作,它需要酶联免疫检测仪,价格较便宜。双相扩散法操作简单，不需要昂贵仪器，实验周期也较短，但灵敏度较低，一般可用于抗体的初步检测。
在杂交瘤技术中常常使用酶联免疫吸附法和双相扩散法。下面分别介绍一下。
(一) 酶联免疫吸附法纯人轮状病毒用包被液稀释到10(g/100(l
↓
将此浓度抗原液按每孔100(l的量分别加入40孔酶标板孔中轻轻震荡使液体覆盖孔底
↓
4℃过夜
↓
倾去酶标板液体用PBSS-Tween20缓冲液洗涤每次洗3min共洗3次
↓
1%小牛血清白蛋白室温下封闭30min
↓
甩去封闭液用PBSS-Tween20缓冲液洗3次，每次3min
↓
每孔加入待测杂交瘤培养上清液100(l
留出4孔加入100(l阳性血清作为阳性对照
4孔加入100(l HT培养液作为阴性对照
4孔加入PBSS-Tween20缓冲液100(l作为空白对照。
↓
加入标有辣根过氧化物酶的羊(或兔)抗鼠IgG，37℃孵育60min
↓
甩去酶标二抗液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min
↓
加入100(l邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应30min
↓
每孔加入1滴2mol/L H2SO4以终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测
（呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验）
(二) 双相扩散法
1,用含有0.01%NaN3和1%琼脂的磷酸缓冲液倒平板,每块9cm培养皿加18ml。
2,用打孔器在倒好的琼脂平板上均匀打7个孔，中央一孔的孔经为4mm，周围6孔的孔经为6mm中央孔与周围孔的间距为8~10mm。
3,中央孔加入待测的杂交瘤培养上清液至孔满，周围孔也分别加入羊(或兔)抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的标准抗体制品至孔满。吸干待测孔中的液体后将培养皿倒置。
4,40℃放置5~7h或37℃过夜。
5,取出琼脂板观察结果，出现沉淀线可初步判定为免疫反应呈阳性,另外还可根据沉淀线的位置来确定所含抗体的类型。
6,有阳性免疫反应的培养上清液原来所在的培养孔即为阳性孔,可进行克隆化实验。
四、克隆化 (在无菌条件下操作)
对阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆化培养的方法一般有有限稀释法、软琼脂平板法和显微操作法等。软琼脂平板法操作比较繁琐，特别是在大量克隆化培养时需要制备很多平板，费时费力。而显微操作法需要使用显微操纵仪，价格昂贵，而且不适于大量样品克隆化。但有稀释法却具有简便快速且适于大规模操作等优点，因此在杂交瘤细胞的克隆化操作中常常使用这种方法。有限稀释法的具体方法如下；
1,将阳性孔中的杂交瘤细胞吹打均匀悬液，取0.1ml进行活细胞计数。
2,用含有腹腔巨噬细胞的RPMI 1640完成全培养液对杂交瘤细胞进行梯度稀释,使其浓度分别为每毫升50个、15个、5个细胞。
3,把三种稀释度的杂交瘤细胞悬液分种于三块孔培养板孔中(0.2ml/孔)。
4,置37℃ 50%CO2孵箱中培养。
5,培养到第五天便可看到较小的细胞克隆,待单细胞克隆长满孔底面积的1/2~1/3时，再进行抗体检测。阳性孔中的单克隆杂交细胞即为阳性克隆，所分泌的抗体即为单克隆抗体。
获得单克隆杂交瘤细胞后，可通过免疫交叉实验来确定其所分泌的单克隆抗体是不是人轮状病毒所特有的。没有交叉反应的单克隆抗体即可用于人轮状病毒的临床论断和治疗。有必要时可进行再克隆实验，以建立能稳定分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实 验 结 果
一、免疫效果的初步观察在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果,用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所莸。
二、融合结果的观察细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞,有未融合的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中,有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。
在融合后第3~5天。便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，以换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于在融合后第14天左右开始大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。
在融合后第5天左右便有杂交瘤细胞开始分裂,从而出现一些的较小的细胞克隆,一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。
三、克隆化结果的观察在克隆化后第5天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。
作 业
1,细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微镜下形态如何?
2,单细胞克隆有何形态特征? 如何判定一个细胞团是不是单克隆细胞?
思 考 题
1,骨髓瘤细胞和脾细胞分别于融合后什么时间开始大量死亡? 为什么?
答：骨髓瘤细胞和脾细胞在融合后第3~5天开始大量死亡，原因是HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活,但B淋巴细胞是正常细胞,故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型,缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。
实验十二 联会复合体的染色与观察
Mose(1956) 最早在研究精喇姑精母细胞减数分裂前期的超微结构时发现联会复合体(synaptonemal complex,S.C)，1977年他又证明使用光学显微镜可以检查联会复合体。其后发展了许多适用于光学显微镜检查用的S.C染色法。依靠光学显微镜显示联会复合体的技术，不仅对于联会复合体的结构和功能的研究有用，而且在临床细胞遗传学中对染色体异常、遗传性疾病的病因和病理研究，以及环境诱变剂的检测等均不失为一种新的有效研究手段。
实 验 目 的
1,学习光学显微镜下显示联会复合体的实验技术
2,观察光镜下联会复合体的形态结构
实 验 原 理
联会复合体是减数分裂前期同源染色体配对形成的非永久性核内特殊结构，典型的联会复合体由三股平行的线状结构组成，即两条平行侧线和一条纤细的中央轴组成。一般开始于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。它与减数分裂三个重要环节同源染色体联会、交换以及分离有着密切关系。大量工作表明，联会复合体在真核生物的减数分裂过程中是普遍存在的。
实 验 用 品
一、材料 雄性小白鼠二、器材离心机、显微镜、水浴、培养皿、镊子、剪刀、吸管、烧杯、量筒、离心管(10ml)、酒精灯。
三、试剂 (所用试剂均为AR级)
1、0.7%柠檬酸钠(柠檬酸三钠)溶液。
2、3%中性福尔马林(甲醛溶液):甲醛8.3ml，醋酸钠() 1.1g，加蒸馏水91.7ml。
3、50%硝酸银溶液
4、明胶显影液,称取2g明胶(gelatin)粉末溶解于99ml蒸馏水中，加1ml甲酸。
5、甲醇-冰醋酸
实 验 方 法
脱颈处死动物取睾丸
↓
放2ml 0.7%柠檬酸钠培养皿中
↓
释放曲细精管内容物（剪开白膜，用解剖针和小弯镊挟出曲细精管并剪碎，用吸管轻轻吹打）
↓移至刻度离心管中加8ml 0.7%柠檬酸钠溶液制成细胞悬液
↓
室温下低渗45~60min
↓
低渗终止前10min，加3%中性甲醛溶液0.3ml，至最终浓度为0.1%，混匀
↓
常规离心(1000r/min)
↓弃上清甲醇和冰醋酸(3:1)混合液固定
↓
空气干燥法制片（关键是长时间的低渗液处理和添加福尔马林溶液）
↓
银染
[附] 银染方法
(1)在培养皿底部放一用少量蒸馏水润湿的滤纸，上放2根小玻棒(或竹杆)，置水浴内保温(80℃)。(2)玻片标本细胞面朝上平放其上，加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显影液，复以盖玻片(或擦镜纸)，直到玻片标本呈金褐色为止，一般为3-4min。(3)移除盖片，并用蒸馏水快速漂洗，晾干。(4)观察或摄影，分析。
实 验 结 果
银染后的联会复合体呈金黄或黄褐色，两条同源染色体联会较紧，但端部仍可见联会复合体结构的双股性。可见Y染色体的大部分和X染色体的一部分局部配对，形成短而清晰的联会复合体。
作 业
1,总结出利用银染法显示联会复合体的实验原理；
2,绘制光学显微镜下联会复合体的形态模式图。
实验一 透射电子显微镜的原理与演示
解剖、观察和分析历来是生物学研究的基本手段。用于细胞解剖观察的主要工具就是显微镜，它是我们观察细胞形态最常用的工具。但其分辨率的最小数值不会小于0.2(m(紫外光显微镜的分辨率也只能达到0.1(m),这一数值是光学显微镜分辨率的极限。限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应)，显微镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,一般显微镜设计的最大放大倍数为1000~1500倍,因为将0.2(m的质点放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨认清楚。如果分辨率不再提高,只提高放大倍数毫无意义，并不能增加图像的清晰度。
在光学显微镜下小于0.2(m的一些细微结构，即便是再提高放大倍数也无法看清，这些结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultramicroscopic structure; ultrastructure)要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。于是，德国柏林大学的E,Ruska等便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，终于在1938年研制出了世界上第一台实用透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)。目前所使用的显微镜,根据光源不同，可分为光学显微镜(简称光镜)和电子显微镜(简称电镜)两大类。前者以可见光(紫外光显微镜以紫外光)为光源,后者则以电子束为光源。电镜的问世，为细胞生物学的研究打开了局面。尤其是1953年瑞典学者成功制造出的超薄切片机以及随后相继出现的各种电子染色技术，使超薄切片技术得到快速发展和完善，从而大大推动了电镜在生物学研究领域中的广泛使用。
目前，电镜技术在细胞生物学研究领域中已由细胞水平发展到了分子和原子水平。英国学者A,Klug博士已将高分辨电镜技术应用到了生物大分子的结构测定上，在核酸-蛋白质复合体的晶体结构研究中做出了突出成就，在1982年他也因此获得了诺贝尔化学奖。现在，电镜已经成为细胞生物学、分子生物学和分子遗传学等不可缺少的重要研究手段之一，仍然将为细胞生物学等生物学领域的研究做出应有的贡献。
实 验 目 的
1,通过对透射电镜的结构和成像原理的讲解,了解透射电镜的工作原理和结构。
2,通过对电镜演示，了解电镜的操作方法及其在细胞生物学领域中的应用情况。
实 验 用 品
透射与扫描电镜、超薄切片机、幻灯机、投影仪、超薄切片示教片，以及各种细胞超微结构照片等。
实 验 原 理
一、电镜与光镜的对比
1,电镜出现的必然性普通光镜虽然仍是我们观察细胞形态最常用的工具，但由于其所用光源为可见光(或紫外光)，故其分辨率(Resolution)存在有一个无法突破的限制。分辨率是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力,通常是用相邻两点间的距离(D)来表示B其公式如下：
分辨率的数值越小，显微镜的分辨能力就越大，反之越小。由上述公式可以看出，分辨率的数值与波长成正比，与镜口率成反比。因此,要想得到高分辨率必须要缩短波长和加大镜口率，在普通光镜中我们使用的光源为可见光，波长为400~700nm (平均值为550nm),这个数值无法改变,唯一可改变的数值为镜口率(N.A.),N.A.的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率(refraction coefficient)的大小。其计算公式如下：
由此可见，镜口率与n及sin (/2成正比。制作镜头所用的光学玻璃的折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃越理想。空气的折射率为1，水为1.33，香柏油为1.515，(-溴萘为1.66。镜口角总是小于180°,所以sin (/2的最大值必然小于1。对于干燥物镜来说，介质为空气,镜口率一般为0.05~0.95; 而油镜用香柏油为介质,镜口率可接近1.5,如果用溴萘则可达1.66。而就目前看来,光镜镜口率的最大值也只有1.78。根据计算，光镜分辨率的最小数值不会小于0.2(m(将1.6代入分辨率公式求得),约等于光波的一半，紫外光显微镜的分辨率也只能达到0.1(m,这一数值是光学分辨率的极限。限制光镜分辨率的关键因素是光的波长(光的衍射效应),光镜无论制作得如何精密都无法突破这一极限,所以一般光镜设计的最大放大倍数为1,000~1,500(,因为将0.2(m的质点放大到0.2~0.3mm(人肉眼的分辨率)就可以辨认清楚。
但在一般想象中,似乎显微镜的放大倍数越大,观察到的物体应该越清楚。然而事实并不然，因为在这里涉及到有效放大和无效放大两个概念。有效放大是指本来用肉眼看不清楚的物体经显微镜放大成像后可以分辨清楚的放大; 而无效放大则是指本来用肉眼能看清楚的物体经放大镜、幻灯机或投影仪等放大成像后可以分辨得更清楚的放大。此外,我们所看到的物象是否清楚不仅决定于放大倍数，而且还要受到一些物理因素和透镜质量的影响(例如球差和色差等),但归根到底,影响显微镜成像清晰度最关键的因素是显微镜的分辨率。如果分辨率不再提高，只提高放大倍数毫无意义,并不能增加图像的清晰度。
在光镜下即便是再提高放大倍数也无法看清亚显微结构(或超微结构)。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多(表1),电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。于是，德国柏林大学的E.Ruska等便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，终于在1938年发明了世界上第一台实用透射电镜。由此可见，电镜的问世是研究细胞超微结构的必然需要。
2,电镜与光镜的异同点电镜在结构上与光镜相同，均是由照明光源和透镜构成。所不同的是，(1)电镜所用照明光源为电子枪发射的高压电子束，而光镜为卤灯(或汞灯)产生的可见光(或紫外光)。(2)电镜所用透镜为电透镜，聚焦方式为电聚焦; 而光镜所用透镜为光学透镜,聚焦方式为机械聚焦。(3)电镜所用介质必须是真空，而光镜则为空气(详细区别见表2)。
电镜与光镜的成像原理也基本相同，但由于二者所用照明光源的不同，其成像机理又有着本质的区别。光镜的成像过程是对可见光的反射与吸收; 而电镜的成像过程则是通过对电子束的散射(图1)。
图1 电子显微镜与光学显微镜结构的对比图解
二、透射电镜的结构与成像原理
1,透射电镜的结构电镜的基本构造见图2。在结构上电镜主要由真空系统、供电及保护系统、电子照明系统、成象系统和观察记录系统五大部分构成，其中,电子照明系统、成象系统和观察记录系统又被称为透镜系统或电子光学系统。
(1) 真空系统 电镜所用“光”源为高压电子束，这就要求其介质必须处于真空状态。一般说来，抽真空的意义有三,①防止灯丝的氧化损伤；②确保电子束在运行过程中不受空气分子的干扰(因为电子在运行过程中一旦遇到空气分子便被散射或吸收,会严重干扰电子的运动轨迹); ③去除空气分子对样品的污染。
真空系统由机械泵、油扩散泵、真空管道、阀门、冷阱和储气罐等装置构成。机械泵可从大气状态(1 Pa)抽到1.3(10-5~10-6Pa; 油扩散泵可从1.3(10-6Pa抽到1.3(10-7 ~10-9Pa；冷阱中加入液氮后还可以从1.3(10-9Pa抽到1.3(10-10Pa。对于一般的电镜，真空度达到1.3(10-9Pa便可安全使用。但对于高分辨率的超高压电镜，真空度必需达到1.3(10-12Pa才能安全使用，这就要求除上述抽真空装置外,还必须使用离子泵和真空涡流泵等来大大提高真空度。
(2) 供电及保护系统 一般的电镜均拥有两个电源,一个是高电压低电流的高压电源，主要作用是产生高速电子；另一个是低电压高电流的透镜电源，主要作用是控制高速电子束的运动轨迹。另外,为了保证电压和电流的高度稳定,电镜还配备有高精度的稳压和稳流等保护与控制系统; 而且一旦电镜的某一部分发生故障后,电镜的保护系统会让其自动紧急关机和断电,以免损伤电镜。
(3) 电子照明系统 由电子枪和两级聚光镜组成,电子枪可产生高压电子束，在灯丝前还有一栅板,栅板中央有一孔经可调的小孔，用来控制电子束流的粗细,以阻挡一些散射电子。极细的高压电子束还要经过两级聚光镜进行会聚。第一聚光镜将电子束的直径缩小20~60倍，第二聚光镜再将电子束的直径扩大1~2倍，以期得到极细而均匀的电子束流。
(4) 成象系统 成象系统包括样品室、成像和放大装置。样品室为放置样品的部位，样品放置在一金属样品托中(可同时放置两个不同的样品)，直接插入到样品室中。此外，还有一冷阱直接与样品室相连。冷阱由一液氮罐和一金属导杆组成，金属导杆直接插入到样品室中。液氮罐中的液氮(-196℃)将低温经金属导杆直接传递到样品室中,低温金属导杆通过直接吸附样品室中的少量空气分子以提高真空度，而且样品室内温度的降低还可防止电子的热漂移。
成像和放大部分分别由物镜、中间镜I、中间镜II和投影镜四级电磁透镜组成,透过样品的电子经过物镜后可被放大50倍，经中间镜I可被放大3倍,经中间镜II可被放大15倍，经投影镜可被放大200倍，共计可被放大约500,000倍。
(5) 观察记录系统 由观察室、放大镜和照相装置构成。观察室又包括荧光屏和铅玻璃窗。透过样品的电子打到荧光屏上可显示出反映样品真实结构的图像。由于电子对人眼有害，故需要通过一个铅玻璃窗来观察，为了观察得更加清晰，在观察室外还配有一放大镜。鉴于电子形成的荧光图像衰减速度很快，所以一旦观察到理想的结构图像就需要尽快利用照相装置进行照相。值得注意的是，电镜照相与普通照相不同，图像的反衬度最低时才是正聚焦，且底片还必须要经过预干燥处理。
2,透镜电镜的成像原理透射电镜之所以能获得高分辨率的图像,主要是因为它解决了两个关键问题,一是用电子枪发射出了波长极短的电子波,二是利用电磁透镜可控制电子的运动轨迹,即可对电子束进行聚焦、放大和成像。故透射电镜的有效放大倍数可高达数百万倍。
电子枪发射出的高速电子束在磁场中聚焦，从而被会聚到待观察的样品上；电子束在通过样品时会发生散射，但由于样品不同部位的质量厚度不同,即物质的组成结构不同，电子束发生散射的程度就不同；透过样品后的电子束撞击到荧光屏上，由电能转变成光能，形成了浓淡不同的图像。此图像各处浓淡的不同真实反映了样品不同部位的物质结构，因而可用来分析和研究样品的超微结构。
由此可见，在透射电镜中，被观察粒子的大小一定要大于电子束的波长才能被分辨出来,否则，电子束就会发生绕射，无法看到粒子。这也是电镜的分辨率由电子束波长所决定的原因之所在。
另外，用于透射电镜的标本须制成厚度仅有0.05(m的超薄切片，而且由于电子束不能透过玻璃,因此这种切片需要用用特制的样品托，而不能用普通光镜所用的载玻片。
图2 光镜、透射电镜及扫描电镜的成像光路图解三、电镜的分类由于不同种类的电镜在结构和使用方法上或多或少都有一定程度的交叉或重叠,因此要试图把所有各种各样的电镜进行完全合理的分类是十分困难的,但就目前来讲,根据电子束和样品之间作用方式的不同对电镜进行分类是相对比较合理的一种方法,总的看来，电子束和样品之间的作用方式有如下四种,1) 物体透射电子；2) 物体发射电子；3) 物体反射电子；4)物体吸收电子。常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的表面图像,其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。其它两种作用方式的电镜由于与我们细胞生物学研究关系不大,在此就不再一一向大家介绍了。
四、电镜的操作演示与示教
1,电镜操作的演示学生参观分两组交叉进行，一组参观透射电镜，一组参观扫描电镜，然后再交换参观内容。
2,电镜照片的展示挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞结构的超微结构特征。
作 业
1,通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的区别。
2,区分细胞的超微结构和显微结构,写出各种示教细胞器的名称及其结构特征。
思 考 题
1,通过本实验的学习，比较光镜与电镜的主要异同点。
答,电子显微镜与光学显微镜的主要异同点
光学显微镜
电子显微镜
照 射 光
光 束
电子束
波长(nm)
长：200~750
短：0.003~0.008
介 质
空 气
真 空
透 镜
光学透镜
电磁透镜
分 辨 力
0.2~0.1(m
0.1nm
放大倍数
1,000
1,000,000
聚焦方式
机械聚焦
电聚焦
反 衬 度
吸收、反射
散射、吸收、衍射、相位
2,总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点。
答：常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构; 是当今世界上所用电镜中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的表面图像,其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。
[ 附 ] 扫描电镜的结构与成像原理在Oatley等学者的努力下，于1965年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发射出的次级电子，由带样电荷的栅极收集后,即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号,可用于电子成像。
1,扫描电镜的基本结构扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理及显示系统，以及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中,电子枪、电磁透镜、扫描线圈又被称为电子光学系统。
其电子枪所发射电子的波长一般为1~10nm，使用的电压范围为1~10KV。扫描线圈为扫描电镜所特有的结构，可作光栅状扫描，以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样品室较大，样品有专用的样品托，可在样品室内进行各不同方向的平移和倾转；另外，在样品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系统包括次级电子探测器、光电倍增管和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成，主要作用是收集由标本表面发射出的次级电子，并将其转变成光子；光电倍增管可将光子信号放大后，又将其转换成电压信号；而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像。
2,扫描电镜的成像原理电子枪发射出的电子束，经电磁透镜会聚成极细的电子束，并进而聚焦在待测样品表面；由于样品各不同部位的表面形貌不同，入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用后所产生的次级电子信号也不同; 此次级电子信号为探测器接受后,被转变成光子，传递给光电倍增管进行放大和转换；转换成的电压信号经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏上。
由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描，再加上显象管的偏转线圈电流与扫描线圈电流高度同步，因此，显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的次级电子数均是一一对应的，因此，显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。
综上所述，扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品的制备方法简便,不需经过超薄切片，经固定、干燥和喷金后即可；(2)扫描电镜采用的是次级电子成像; (3)扫描电镜所观察到图像景深长,图像富有立体感,但只能反映出样品的表面形貌; (4)图像的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×);(5)样品的辐射损伤及污染程度小等。但与透射电镜相比，扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性，如(1)分辨率还不够高; (2)无法显示样品内部的详细结构等。为此，近年来出现了一种新的电镜技术-冰冻蚀刻技术(freeze etching)，利用“复膜(replica)”在透射电镜下进行观察,既可观察到样品的内部结构,又可观察到富有立体感的图像,还提高了分辨率。
实验二 孚尔根反应（Feulgen Reaction）
Feulgen反应(Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应，为学者Feulgen和Rossenbeck于1924年发明，简称为Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性，故常被用来显示细胞内DNA的分布情况。
实 验 目 的
1,熟悉并掌握Feulgen反应的原理及其实验操作方法
2,对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识
实 验 原 理
自Feulgen等发明该显示DNA的Feulgen反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团，故可呈现出紫红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示。
2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3
实 验 用 品
一、器材 显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台。
二、材料 香柏油5瓶，擦镜纸5本，镊子5把，盖玻片20片，用carnoy's固定液固定的肝脏和精巢切片20片。
三、试剂
1,schiff氏试剂 将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸5min使之充分溶解，冷却至50℃时过滤，加入10ml 1mol/L HCl，冷至25℃时，加入0.5g偏重亚硫酸钠(Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天)，使其颜色退至淡黄色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳,摇1min,用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。
2,亚硫酸水(洗涤剂) 用200ml普通自来水(不要用蒸馏水,以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫酸钠水溶液和10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。
3,1mol/L HCl(水解用) 取82.5ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入水中)。
4,1%亮绿(light green) 亮绿1g，溶于100ml蒸馏水中。
5,30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。
实 验 方 法
Carnoy液固定
↓
95%酒精（2次）每次20-30min
↓
100%酒精2次(30 min,40 min)
↓
二甲苯透明
↓
石腊包埋
↓
切片贴片
↓
二甲苯I(20 min)
↓
二甲苯II(10 min)
↓
100%酒精5min
↓
95%酒精5min
↓
85%酒精5min
↓
70%酒精5min
↓
50%酒精5min
↓
30%酒精5min
↓
蒸馏水5-10min
↓
1 mol/L HCl的染色缸内（清洗一下）
↓
温浴至60℃的1 mol/L HCl溶液中水解8 min
↓
取出标本，放入室温1 mol/L HCl溶液
（注意,这个步骤非常重要，必须用1 mol/L稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂）
↓
蒸馏水冲洗3次（使水解停止）
↓
Schiff试剂中染色40min
↓
用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料)
↓
流水冲洗5 min
↓
蒸馏水洗片刻
↓
1%亮绿复染数秒钟
（注意,复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）
↓
水洗脱水封片
实 验 结 果
细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞质中，DNA也会出现阳性反应。
作 业
1,绘图表示Feulgen反应的染色结果,并验交Feulgen反应的永久切片1张。
2,总结Feulgen反应染色结果的影响因素。
思 考 题
1,Feulgen反应的实验原理是什么？
答：DNA经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示出DNA的分布。
2,在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？
答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用schiff剂染色时所残留的碱性品红反应掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。
[ 附 ] Feulgen方法应注意的几个问题：
1,对照切片的制做进行Feulgen反应时,一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假的正反应。
2,固定剂的选择以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于Feulgen反应。如Bhampy固定剂、Helly固定剂、Flemming固定剂、OsO4固定剂、Carnoy固定剂、zenker固定剂和Bouin-Aller固定剂。
但在上述固定剂中，以OsO4和Carnoy效果较好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反应的理想固定剂，只是因OsO4价钱较贵，故一般多采用Carnoy固定液。在Feulgen反应中，不能单独使用Bouin定液，因为它是Feulgen反应的最坏固定剂，但经Aller改进后的Bouin-Aller固定液效果却较好。
3,水解时间
Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。
4,Schiff试剂的作用
Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。
实验三 染色体的标本制作及其组型实验
长期以来，在真核生物中,染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体,对生物的遗传、变异、进化和个体发生,以及细胞的增殖和生理过程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型(karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者A.Levan合作,利用低渗法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条，而不是前人所主张的48条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。
实 验 目 的
1,通过实验，初步掌握染色体标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理
2,通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法
实 验 原 理
自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)处理后处于分裂状态的组织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为实验材料。
对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点,1,用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处; 2,用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3,空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。
染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以下几个参数,1,相对长度(relative length),指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2,臂指数(arm index),指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3,着丝粒指数(centromere index),指短臂占整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%,该比率决定了着丝粒在染色体中的相对位置。4,染色体的臂数,对于端部着丝粒染色体，臂数为1，其它为2。根据Levan(1964)所制定的人类染色体标准，臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体，在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色体，在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体，大于7.0为端部着丝粒染色体；着丝粒指数在50.0~37.5之间的染色体为中央着丝粒染色体，在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体，在25.0~12.5之间为亚端部着丝粒染色体，小于12.5为端部着丝粒染色体。
实 验 用 品
一、材料 小白鼠，蟾蜍二、器材普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各20把，100ml量筒5个，滴管20支，10ml小烧杯5个，10ml刻度离心管20支，试管架5个，染色用玻璃板5块,载、盖片各20片；显微镜20台,香柏油5瓶，擦镜纸5本，直尺20把，复印的染色体标本图20页。
三、试剂
1,秋水仙素,称取秋水仙素10mg加10ml的注射用水，即得0.1%的秋水仙素液,以此作为原液。在使用时，需将原液稀释50倍，即取0.1ml原液，加4.9ml注射用水，稀释后秋水仙素的浓度为 20蔳/ml。
2,生理盐水,哺乳动物及人类为0.9%的NaCl溶液，两栖类为0.7%的NaCl溶液。
3,Carnoy's固定液；甲醇:冰醋酸为3:1,必须现用现配。
4,Giemsa染液的配制；
吉姆萨粉(Giemsa stain)
l.0g
甘油(AR)
66ml
甲醇(AR)
66ml
将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。
5,磷酸缓冲液；
1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O,2.39g 溶于100ml双蒸水中。
1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于100ml双蒸水中。
取1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O液80ml、1/15 mol/L KH2PO4液 20ml混合即为pH=7.38之磷酸缓冲液。
如用无水Na2HPO4配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制；
A液:
Na2HPO4 9.47g
双蒸水 1000ml
B液:
KH2PO4 9.06g
双蒸水 1000ml
根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液。
表1 磷酸缓冲液配制比例
pH值
A液(ml)
B液(ml)
5.8
7.8
92.2
6.0
12.0
88.0
6.4
26.5
73.5
6.6
37.5
62.5
6.8
50.0
50.0
7.0
61.1
38.9
7.2
71.5
28.5
7.4
80.4
19.6
6,0.3% KCl水溶液（低渗液）。
实 验 方 法
染色体标本的制做取小白鼠注射秋水仙素
↓14~16h后断头法杀死，取睾丸洗净血污
↓
移入KCl的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色)
↓铜网过滤至刻度离心管中加入KCl低渗溶液于37℃水浴中低渗处理30min（使细胞膨胀）
↓
800~1000r/min离心8min
↓轻轻地去除上清液加入新配制的Carnoy's固定液，立即用吸管轻轻将细胞吹散
↓
室温固定8min
↓
800~1000r/min离心8min
↓弃去上清液加入新制Carnoy's固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液
↓
取出预冷的干净载玻片，以10~15cm高度滴加细胞悬液（细胞胀破）
↓
立即吹打载玻片
↓
多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥
↓
稀释Giemsa原液
Giemsa染色（倒置染色法，后有说明）30min
↓
用流水冲洗标本载玻片
↓
文火烤干显微观察
↓
选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相
[附]：倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架,使标本载玻片的标本面向下放置到支架上,在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。
二、染色体的组型实验
1,选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大10倍的清晰照片。
2,将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。
3,根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。
4,把相对长度与臂指数相近者配成一对。
5,参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。
6,用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。
实 验 结 果
在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体,其间相互散开,短臂收缩适中,二条姐妹染色单体大致平行分离,着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40条，多为端部和亚端部染色体，只有2对亚中部着丝粒染色体。
人类染色体为46条，可分为A、B、C、D、E、F、G七个群，其各自的基本特征见表2。
表2 人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征类别
包括染色体的序号
主 要 特 征
A群
第1~3对
体积大，中部着丝粒。第2对着丝粒略偏离中央
B群
第4~5对
体积大，中部着丝粒。彼此间不易区分
C群
第6~12对，X
中等大小,亚中部着丝粒。第6对的着丝粒靠近中央,X染色体大小介于第6与7对之间,第9对的长臂上有一次缢痕,第11对的短臂较长,第12对的短臂较短,彼此间不易区分
D群
第13~15对
中等大小，近端部着丝粒，有随体。彼此间不易区分
E群
第16~18对
中等大小。第16对为中央着丝粒，长臂上有一次缢痕；第17、18对为亚中央着丝粒，后者的短臂较短
F群
第19~20对
体积小，中部着丝粒。彼此间不易区分
G群
第21~22对，Y
第21、22对体积小,近端着丝粒,有随体,长臂常呈分叉状；Y染色体较前者略大,近端着丝粒,无随体,长臂常彼此平行
作 业
1,通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。
2,对于分散好的染色体，进行染色体计数。
3,对于呈非整倍性的染色体标本，分析其形成原因。
4,认真做好小鼠的染色体组型图。
思 考 题
1,请你分析一下在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些？
答： 秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体形态不正常，甚至被破坏或溶解。
低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染色体在一起，分散不开。
离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。
固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。
载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。
用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。
滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体的准确数量。
2,本实验中，对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时,发现染色体数有的为40条，而有的则为20条，为什么？拥有20条染色体的单倍体细胞会是什么细胞？
答：有40条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞、精母细胞。有20条染色体的可能是已完成第一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现40条和20条染色体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。
3,从一般意义上讲，染色体标本制做的四大要点是什么？
答：A、植物血球凝集素（PHA）处理获得活跃分裂的细胞；
B、秋水仙素处理可使细胞分裂停止在中期；
C、低渗处理可使染色体分散；
D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上。
实验四 染色体G-带的分带技术
60年代以来，染色体分带技术有了突飞猛进的发展，特别是1970年以来，许多人类染色体分带技术的出现在细胞遗传学的科学研究中开创了一个新的时期。染色体分带技术可使我们准确无误地识别每一条染色体，使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变，这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定，特殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法，有助于染色体研究的发展，在临床上有着重要意义。
染色体分带技术最早(1968年)开始于瑞典科学家Caspersson及他的同事的开拓性工作，他们用氮芥喹丫因使染色体不同部位分化染色，显示出清晰的带纹。1971年，Pardue等又提出了吉姆萨(Giemsa)显带技术。在前人研究的基础上，人们引用不同的物理、化学方法处理染色体标本，并用一定的染料染色，可使每条染色体上出现明暗相间或深浅不同的带纹，称为染色体带。根据染色方法的不同可分为Q、G、C、R、N、T及Cd等几种类型的带，同时对显带机理进行了探讨。本实验重点介绍在动物细胞染色体中常用的G-小带产生的机理及方法。
实 验 目 的
1,学习染色体的G-带显示方法；
2,了解G-带染色体在细胞遗传学分析中的重要意义。
实 验 原 理
关于G-带形成的机理，到目前为止还没有完全定论，但有人提出了以蛋白质构象改变为基础的显带机理。此机理认为，带纹所反映的是蛋白质结构的差异，这种差异与DNA的功能活动相适应。G-带的形成与Giemsa染料的组成及染色特性分不开。Giemsa染料是由亚甲蓝(美蓝)、天蓝和曙红组成的复合染料，除曙红外，均为噻臻类染料，它只与DNA中的PO43-基结合而不与蛋白质结合，所以染色体着色首先是两个噻臻分子与DNA的结合，在此基础上结合一个曙红分子；形成2:1噻臻-曙红沉淀物。其次要有一个有助于染料沉淀物积累的疏水环境。染色体上含有高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻臻-曙红沉淀物的形成，这些区域相当于含高比例二硫键的氧化态蛋白质区域，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域(明带区)则为含疏基的还原态蛋白质，为亲水性蛋白质，对染料亲合力低，所以不显色。这表明，在G-带形成的过程中，蛋白质状态是一个主要因素。这与染色体的功能有关。如果染色体上某一区域的DNA为重复序列，转录活性低，相应地包装它们的蛋白质也较稳定，可能通过较强的二硫键形成很稳定的疏水的(-螺旋结构，成为染料沉淀物积累的环境，从而显示出阳带(暗带)。反之，如果染色体上某一区域的DNA富含具转录活性的结构基因，则功能上相对活跃，包装它们的蛋白质也较疏松，构象上类似(-折叠结构，经处理后二硫键断裂，还原为巯基，成为亲水性蛋白，不利于染料沉淀物的积累，所以着色浅，显示阴带(明带)。关于G-带形成的机理还有待进一步探讨。G-带有许多优点,染色是永久性的，以较长时间保存；带纹分析通常较好；用普通光学显微镜可观察等。
实 验 用 品
一、试剂,2mol/L NaCl溶液，5mol/L尿素溶液，Giemsa染液，磷酸缓冲液(pH6.8)。
二、器材,显微镜，恒温水浴箱，染色缸，滤纸，冰箱。
三、材料,小鼠染色体标本
实 验 方 法
老化3~7天的染色体标本
↓
置于37℃，pH7.0的NaCl和尿素的混合液中处理60min
↓
蒸馏水冲洗
↓
2% Giemsa染液(pH7.0)染色60min
↓
水冲洗
↓
晾干，二甲苯透明2~3min
↓
中性树胶封片
实 验 结 果
在显微镜下，可见分布在小鼠染色体全长上的宽窄不同的相间条带。带纹的多少随染色体的不同而异，另外还同染色体所处的时期不同而有差异，一般中期染色体带纹较少，早中期与晚前期染色体的带纹较多，前期染色体多呈颗粒状。
作 业
1,绘制2~3条小鼠染色体的G-带模式图。
2,解释早中期与晚前期染色体的带纹较多、而中期染色体带纹较少的原因。
思 考 题
1,染色体G-带的含义是什么？
答：将染色体标本用热、碱、胰酶、尿素、去垢剂或某些盐溶预先处理，再用Giemsa染料染色，可以显示类似带纹，称为G显带，G带显示的是染色体上富含AT的区域。
2,染色体G-带有何应用价值与应用前景？
答：G-带有许多优点,染色是永久性的，以较长时间保存；带纹分析通常较好；用普通光学显微镜可观察等。根据这一技术可识别出染色体的微小变化，如染色体的丢失、移位等。许多细胞系保留多个染色体标志亦用此法加以识别，从而可以特异的和确切的鉴别待测细胞。同时，G-带可使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变，这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定，特殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法，有助于染色体研究的发展。
实验五 PEG介导的动物细胞融合技术
细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)是指真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程。人工的细胞融合开始于20世纪50年代,60年代到70代作为一门新兴的技术,发展非常快,应用范围也极为广泛,除了同种类细胞间可以融合,种间远缘细胞也能融合,细胞与组织不同,不排斥异类、异种细胞,动物细胞如此，植物细胞也是如此。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体(homokaryon)；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体(heterokaryon)。
目前,诱导细胞融合的方法有三种：病毒(Okada,1958)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)(Pontecorvo,1975)和电激(Zimermann,1980s)。副粘病毒科的病毒，如副流感病毒(Sendai virus)和新城鸡瘟病毒，在其被膜中目前发现了两种糖蛋白。较大的一种具有粘附细胞和凝血的作用；较小的一种可介导病毒同宿主细胞融合,也可诱导细胞与细胞融合，称为融合蛋白(fusion protein)。人工利用病毒诱导细胞融合即是利用病毒的这一特性,使用时先用紫外线将病毒灭活,稀释到一定浓度加入到细胞悬液中,诱导细胞融合。但病毒介导细胞融合方法在使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。后两种方法则是利用化学和物理手段，暂时使质膜脂类分子的有序排列发生改变，待去掉作用因素之后，质膜恢复原有的有序结构，在恢复过程中便有可诱导相接触的细胞发生融合。总之，这3种方法都是在相互接触的两细胞进行自我修复过程中融合的。
细胞融合不仅可用于生物学的基础理论研究，而且在生产实践上还有重要的应用价值，如目前在单克隆抗体的制备,核质关系,体细胞的遗传和发育,新品种的培养,免疫作用,疾病的治疗和性状的改良,潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。
实 验 目 的
1,通过PEG介导的鸡血细胞融合实验,对体细胞融合有一个清楚的概念
2,并初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术
实 验 原 理
利用PEG介导的动物细胞融合，其实验原理到目前为止还没有完全定论。学者们一般认为，PEG改变各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散、进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相临的重排质膜在修复时相互合并在一起,使两细胞的胞质沟通,从而造成相互接触的细胞之间发生融合。
利用PEG介导细胞融合,其融合效果受以下几种因素的影响。1,PEG的分子量与浓度,细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2,PEG的pH值,经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3,PEG的处理时间,处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4,融合时的温度,由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为38~40℃。
本实验所用材料为鸡的血细胞，这是因为,1,鸡血细胞具有细胞核，便于对融合细胞进行鉴别；2,实验材料便宜、易得。细胞融合与否，可通过观察细胞内核的数目来进行鉴别。细胞内只有一个核，定为未融合细胞；有二至多个核，定为融合细胞。
实 验 用 品
一、器材
1,主要设备,普通离心机、普通光学显微镜
2,小型器材,100ml量筒2个,滴管10支,10ml刻度离心管20支,载、盖片各20片二、材料 新鲜鸡血三、试剂
1,Alsever液制备葡萄糖(Glucose)
2.05g
枸椽酸钠
0.8g
氯化钠(NaCl)
0.42g
重蒸水
至100ml
2,0.85%生理盐水液
3,GKN液氯化钠
8g
氯化钾(KCl)
0.4g
Na2HPO4?2H2O
1.77g
NaH2PO4?H2O
0.69g
葡萄糖
2g
酚红(phenolred)
0.01g
溶于1000ml重蒸水中。
4,50% PEG液 (现用现配)
根据实验需要，称取适量PEG(Mr.4000)放入刻度离心管内，在酒精灯上将其加热熔化，待冷却至50℃，加入等体积的已预热至50℃的GKN液并充分混匀。
实 验 方 法
将Alsever液与活鸡翼下鸡血混成1:4悬液 （抗凝效果最佳）
↓
4度冰箱保存
↓
取上述悬液加入生理盐水混匀
↓
1200r/min离心5分钟
↓弃上清上述离心速率重复离心两次(5min,10min)
（以达到去除细胞表面粘附物质的目的）
↓弃上清
加入适量GKN液，配成细胞悬液
↓
取悬液以血球计数法计数
↓
再用GKN液将红细胞的浓度稀释
↓
加入 50%的PEG液混匀
↓
吸取1~2滴镜检并计算出融合率
实 验 结 果
经PEG处理后，在显微镜下，可观察到未融合的单核细胞、融合后的双核细胞和融合后的多核细胞。
细胞的融合率指在显微镜的视野内，已发生融合的细胞的核的总数与此视野内所有细胞的细胞核总数之比。可用如下公式表示：
在实验中统计融合率时,要进行多个视野计数，然后再加以平均，以使计算更为准确。
作 业
1,绘出你所观察到的融合细胞的形态，并计算出细胞融合率。
2,请你写出细胞融合实验操作中应该注意的有关事项。
思 考 题
1,细胞融合方法主要有哪几类？各有何优缺点？
答：几类细胞融合方法的优缺点如下：
病毒介导的细胞融合：优点是对细胞毒性较小，融合细胞易于存活；缺点为使用前需要病毒的繁殖与灭活，操作繁琐，如灭活不完全则易对实验人员造成伤害，因此现在一般不使用此方法。
化学介导的细胞融合：优点是操作简便、快速省时且融合效果好；缺点为PEG对细胞有毒性，处理不好则会直接影响融合细胞的存活率。
电激法：优点是对细胞无毒性，且操作简单；缺点为它除需要电融合仪外，还要求实验人员接受一定的技术训练。
2,PEG法细胞融合的影响因素有哪些？
答：1,PEG的分子量与浓度,细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高,对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2,PEG的pH值,经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3,PEG的处理时间,处理时间越长，融合效果越好,但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养,故处理时间可适当放宽至数分钟。4,融合时的温度,由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果,在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细,一般采用的温度为38~40℃。
3,本实验中所用的PEG融合方法能否用于植物细胞？为什么？
答：本实验所用PEG融合方法不能直接用于未脱壁植物细胞的融合，因为植物细胞具有细胞壁，PEG无法介导其细胞融合；但是，如果将植物细胞进行脱壁处理后，则可使用PEG融合方法进行融合实验。
实验六 线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。
根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体内活体染色是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus green B)和中性红(neutral red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。
实 验 目 的
1,观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；
2,学习一些细胞器的超活染色技术。
实 验 原 理
线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态(即有色状态)，呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基(即无色状态)。
中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。
实 验 用 品
一、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。
二、试剂
1,Ringer溶液：
氯化钠 0.85g (变温动物用0.65g)
氯化钾 0.25g
氯化钾 0.25g
氯化钙 0.03g
蒸馏水 100ml
2,10%、1/3000中性红溶液：
称取0.5g中性红溶于50ml Ringer液，稍加热 (30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。
3,1%、1/5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液l ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。
三、材料人口腔上皮细胞，小麦种子或黄豆幼根根尖。
实 验 方 法
人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上
↓
滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液
↓
用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞
↓
刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中
↓
染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)
↓
盖上盖玻片,显微镜下观察
二、植物细胞液泡系的超活染色与观察取豆芽的根尖
↓用刀片纵切根尖放入中性红染液滴中，染色5~10min。
↓
吸去染液，滴一滴Ringer液
↓
盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)
实 验 结 果
在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。
作 业
1,绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布
2,绘蟾蜍胸骨剑突软骨细胞示液泡系的形态与分布
思 考 题
1,用一种活体染色剂对细胞进行超活染色，为什么不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器?
答：不同的活体染色剂对不同的细胞器有染色专一性。詹纳斯绿B(Janus green B) 仅对线粒体具有专一性，而对液泡系没有专一性；中性红(neutral red)则对液泡系具有专一性，而对线粒体没有专一性。因此，用一种活体染色剂对细胞进行超活染色时，不能同时观察到线粒体、液泡系等多种细胞器。
2,小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延长区细胞中液泡数量变少，染色浅?
答：因为生长点处的细胞分裂旺盛，且较小，处于新生阶段，故液泡数量多、染色深；而延长区的细胞已经成熟，细胞分裂能力下降，且细胞较大，因此细胞中液泡数量变少、染色变浅。
3,高等动物和高等植物细胞中的液泡系(高尔基体)分布上有何不同?
答：高等动物中高尔基复合体一般都位于细胞核附近；而高等植物中高尔基体弥散于整个细胞中，不集中。
实验七 叶绿体的分离与荧光观察
叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的,由于具有这一重要功能，所以叶绿体一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。
实 验 目 的
1,通过植物细胞叶绿体的分离,了解细胞器分离的一般原理和方法。
2,观察叶绿体的自发荧光和次生荧光,并熟悉荧光显微镜的使用方法。
实 验 原 理
分离细胞器的常用方法是将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将匀浆液1000r/min的条件下离心2min,以去除其中的组织残渣和未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5min，即可获得沉淀的叶绿体(混有部分细胞核)。分离过程最好在0~5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间,有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油。
实 验 用 品
一、器材
1.主要设备,普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。
2.小型器材,500ml烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。
二、材料 新鲜菠菜。
三、试剂 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
实 验 方 法
一、叶绿体的分离与观察
新鲜的嫩菠菜叶
↓
洗净擦干去除叶梗脉
↓
取30克放入150ml氯化钠溶液
↓
入组织捣碎机匀浆
↓
低速匀浆（5000r/min）3~5min（破碎细胞）
↓
匀浆液
↓6层纱布过滤，取4ml
1000r/min离心2min（去除组织残渣和未被破碎的细胞）
↓取上清
3000r/min离心5min
↓保留沉淀（即混有部分细胞核的叶绿体）
用氯化钠溶液悬浮
↓
光学显微镜下观察
二、菠菜叶手切片观察新鲜菠菜叶
↓
刀片切出一斜面置于载玻片上
↓
滴加1~2d氯化钠溶液
↓
盖上盖片显微镜下观察
实 验 结 果
一、叶绿体的分离和观察
1,普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。
2,以Olympus荧光显微镜为例，在先用B(bule)激发滤片、B双色镜和O530(orange)阴断滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。
3,加入吖啶橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧光。
二、菠菜叶手切片观察
1,在普通光镜下可以看到三种细胞 (1)表皮细胞,为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞; (2)保卫细胞,为构成气孔的成对存在的肾形细胞；(3)叶肉细胞,为排列成栅状的长形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。
2,在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱,气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少。
3,用吖啶橙染色后，叶绿体则发出桔红色荧光，细胞核可发出绿色荧光,气孔仍为绿色。
作 业
1,根据荧光观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。
2,概述滤镜系统的选用原则。
思 考 题
1,叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？
答：一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。
在分离叶绿体时应注意操作要迅速，控制好离心速度和时间。同时弃上清时不要把沉淀荡起，再次加氯化钠溶液时应用胶头滴管吹匀混合液，力气不能过大，以免造成叶绿体破碎。最后一次加氯化钠溶液时应少加，以免所得叶绿体的浓度太小，不易观察到。
2,普通光学显微镜与荧光显微镜有何异同点？
答：相同点：1）均为光学显微镜；2）均可对生物样品进行定性和定量分析。
不同点：1）二者所用光源不同：普通光学显微镜用的是自然光，而荧光显微镜则多为紫外光；2）荧光显微镜含有一套特殊的滤镜系统；3）荧光显微镜还具有灵敏度高、特异性强等特点；4）荧光显微镜只能使用无荧光载玻片和无荧光油等。
实验八 细胞凝集反应
细胞质膜是由蛋白质不同程度镶嵌在脂双层中所形成的动态流动结构，蛋白质和脂类分子又与寡糖链结合为糖蛋白和糖脂分子，糖蛋白和糖脂分子伸至细胞表面的分枝状寡糖链在质膜表面形成细胞外被（又称为糖萼）。许多研究结果表明：细胞间的分子识别、细胞的生长和分化、免疫反应和肿瘤发生等均与细胞外被（分枝状寡糖链）有关。凝集素能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”，从而达到细胞凝集的效果。
实验目的
1、观察血细胞的凝集现象；
2、掌握凝集素促使细胞凝集的原理。
实验原理
凝集素（1ectin）是一类含糖的（少数凝集素例外）并能与糖进行专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集素促使细胞凝集主要是由于它能与细胞外被的糖分子相连接、在细胞间形成“桥”的结果，且加入与凝集素互补的糖分子可以抑制细胞间的凝集反应。
实验用品
一、器材显微镜、托盘天平、载玻片若干、滴管2支、离心管2支。
二、试剂
PBS缓冲液：称取NaCl 7.2g、NazHP04 1.48g、KH2P04 0.43g、加蒸馏水，定容至l000 mL，调pH值到7.2。
三、实验材料
1．土豆块茎。
2．2％的红细胞以无菌方法抽取兔子静脉血液（加抗凝剂），用生理盐水洗5次，每次2000 r/min，离心5 min，最后按沉淀压积的红细胞体积用生理盐水配成2％红细胞悬液
实验方法
称取土豆去皮块茎2g
↓
加10 mL PBS缓冲液，浸泡2h（浸出的粗提液中含有可溶性土豆凝集素）
↓
载玻片上滴一滴土豆凝集素
↓
再滴一滴2％红细胞液
↓充分混匀静置20 min
↓
低倍显微镜下观察血球凝集现象
↓
以PBS液加2％血细胞悬液作为对照实验
实验作业
1．绘制简图，表示血细胞的凝集过程；
2．图示血细胞凝集的原理。
实验九 腹腔巨噬细胞吞噬功能检测方法
在机体的免疫过程中，巨噬细胞（M(）承担着噬菌、杀菌、清除机体内被损伤和衰老的细胞，以及传递抗原信息；M(将捕获的抗原进行加工处理后，把降解的抗原信息传递给T、B淋巴细胞。M(又是天然杀伤细胞(NK细胞)的激活剂，且对B淋巴细胞的激活、增殖和分化具有调节作用。
实 验 目 的
掌握巨噬细胞(M()体外吞噬异物能力的测定方法，观察机体的非特异性免疫现象。
实 验 原 理
巨噬细胞(M()在机体的非特异性免疫中具有重要作用，其吞噬异物的能力在一定程度上反映了机体免疫水平的高低。本实验采用测定小鼠腹腔M(吞噬鸡红细胞的吞噬百分率和吞噬指数，来评价免疫抑制剂环磷酰胺(CYP)对机体免疫状态的抑制作用。
实 验 用 品
一、材料
1,小白鼠6~10只，随机分为二组。
2,5%鸡红细胞悬液：用已灭菌的注射器，自健康鸡的翼下静脉采血1ml，放置于5倍体积的Alsever's溶液中。4℃条件下可保存一周。使用时用灭菌的生理盐水洗涤3遍(2000r/min，每次5min)，然后用生理盐水配成5%的浓度。
二、试剂
1,Alsever's溶液葡萄糖 2.05g
柠檬酸三钠(Na3C6H5O7·2H2O) 0.89g
氯化钠 0.42g
溶解后加蒸馏水至100ml，用柠檬酸(C6H8O7·H2O)调pH至7.2，超滤除菌或6.6(104Pa(10磅)灭菌20min，保存4℃冰箱备用。
2,Hank’s液
(1)贮存液(药品全部用AR试剂)，
甲液,①NaCl 80g,MgSO4·7H2O 1g,MgCl2·6H2O 1g，用双蒸馏水定容至450ml。
②CaCl2 1.4g双蒸馏水定容至50ml。
将①、②液混合，加氯仿1ml。
乙液,Na2HPO4·l2H2O 1.52g，KH2PO4 0.6g,酚红0.2g,葡萄糖l0g,用双蒸馏水定容至500ml,加氯仿lml。
(2)应用液:
贮存液甲:贮存液乙:双蒸馏水=1:1:18。6.6(104Pa (10磅)灭菌20min。4℃保存可使用1个月。临用前，用3.5%的NaHCO3调pH至7.2。
3,0.9%生理盐水(灭菌)
4,Giemsa染液
(1)贮存液:
称取Giemsa粉0.5g研细，再将33ml甘油逐滴加入，继续研磨至无颗粒。80℃水浴过夜，然后加入33ml甲醇。置棕色瓶中，于56℃放置24h后即可使用。
(2)应用液:
临用时取贮存液lml加l0ml pH7.4磷酸缓冲液，混匀后过滤。
5,甲醇
6,肝素钠溶液,用灭菌生理盐水配制。每20IU 0.1ml可抗凝1ml全血。
7,0.6%环磷酰胺溶液,用灭菌生理盐水配制。
三、设备保温箱、显微镜、带盖解剖盘．医用剪刀、镊子、刻度离心管及试管架、载玻片、滴管、酒精及碘酒棉球、擦镜纸、称量纸及滤纸。
实 验 方 法
实验前二天，给实验组小鼠腹腔注射0.6%的环磷酰胺(0.2ml/只)
对照组小鼠注射灭菌生理盐水
↓
每只小鼠注射pH7.2 的Hank液 2m1
(腹腔注射时进针切忌过深，针头方向最好向后，以免伤其内脏，使血管破损出血，影响实验取材)
↓
实验当天给小鼠腹腔注射5%鸡红细胞0.5ml/只
↓2~3h后脱颈法处死小鼠立即由腹腔注入lml生理盐水
↓轻揉小鼠腹部约lmin，剪开腹部皮肤,肌肉层上开口滴管伸入腹腔吸出腹腔液，置于滴有肝素钠的离心管中混匀
↓
把腹腔液滴加在洁净的载玻片上
↓
将载玻片置于带盖解剖盘中(盘底部放2~3盒湿沙布)
↓37℃培养箱孵育30min
取出玻片，漂洗去上清液和末粘附在玻片上的细胞
(漂洗标准,在显微镜下检查无重叠细胞层，且水流不要过急以免将贴附在玻片上的M(冲掉)
↓室温下晾干或用吹风机吹干载玻片
Giemsa染液染色5~l0min
↓
冲洗去多余染液，晾干
↓
高倍镜或油镜下观察并计数计算出吞噬百分率和吞噬指数
[附]：吞噬百分率 = 吞噬鸡红细胞的M(数/M(总数(l00
吞噬指数 = M(吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的M(总数
作 业
根据你的观察和计数，计算M(的吞噬百分率和吞噬指数。
实验十 动物细胞微丝束的光学显微镜观察
细胞骨架(cytoskeleton)是指真核细胞胞质中错综复杂的纤维状网络结构，主要包括微管（microtubule，MT，20~25 nm）和纤丝（filament）两大类；另外，胞质中还散布着一些3~6 nm的细小纤维。按纤维的直径、组成成分以及组装结构的不同，纤丝又可分为微丝（microfilament，MF）、中间丝（intermediate filament，IF）和粗丝（thick filament，TF）三类。微丝是肌动蛋白亚单位组成的螺旋状纤维（F-actin），直径为6~7 nm，又名肌动蛋白丝，其长度不定，多分布在近细胞膜的下方。微丝在不同种类的细胞中，它们又与某些结合蛋白一起形成不同的亚细胞结构，如张力纤维（stress fiber）、肌肉细丝、肠上皮绒毛轴心等。现在观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段。本实验用考马斯亮蓝R250（coomassie brilliant blue R250）显示微丝组成的张力纤维。张力纤维在体外培养细胞中普遍存在，于活体内哪些细胞具有张力纤维研究得还比较少，比较明确的是，一些迅速运动的细胞如巨噬细胞、变形虫等缺乏张力纤维。张力纤维的组成除了肌动蛋白外，还有肌动蛋白结合蛋白如α-辅肌动蛋白、肌球蛋白和原肌球蛋白等沿着张力纤维的轴向进行周期性地分布，类似于肌原纤维的组织分布，并具有收缩功能。
实 验 目 的
1,掌握考马斯亮蓝R250染动物细胞胞质微丝的方法。
2,对细胞内微丝的分布有一个整体上的认识。
实 验 原 理
考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。观察微丝可以用电镜、组织化学、免疫细胞化学等手段，本实验主要介绍用考马斯亮蓝R250显示由微丝组成的张力纤维的实验方法。
染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。
实 验 用 品
一、材料 体外培养的动物细胞。
二、试剂
1,0.01 mol/L 磷酸盐缓冲生物盐水(PBS)配法
0.2mol/L Na2HPO4/KH2PO4缓冲液(pH7.3)
50 ml
NaCl
0.15 mol/L
重蒸馏水
至1000 ml
其中PB的配法,0.2mo1/L Na2HPO4 77 ml
0.2mo1/L NaH2PO4 23 ml
2,M-缓冲液咪唑(imidazole,pH6.7)
50 mmol/L
KC1
50 mmol/L
MgCl2
0.5 mmol/L
EGTA
l mmol/L
EDTA
0.l mmol/L
巯基乙醇(mercaptoethanol)
l mmol/L
甘油
4 mmol/L
用1 mol/L HCl调pH至7.2。
3,1%的Triton X-l00/M-缓冲液
4,0.2%考马斯亮蓝R250染液，溶剂是:
甲醇
46.5 ml
冰醋酸
7 ml
蒸馏水
46.5 ml
5,30%戊二醛-PB溶液，pH7.2
三、器材 显微镜、载玻片、35mm小染缸。
实 验 方 法
细胞培养在盖玻片上，生长密度达++~+++时取出
↓
PBS液轻轻涮洗
↓
l% TritonX-l00/M-缓冲液处理l5min（室温或37℃）
（Triton X-l00是非离子型表面活性剂(去污剂)，能增加细胞膜通透性并抽提部分杂蛋白质，使骨架图像更清晰）
↓
M-缓冲液轻轻洗细胞3次（稳定细胞骨架）
↓
3%戊二醛-PB液固定细胞5~l5min
↓
PBS液洗细胞若干次
↓滤纸吸干
0.2%考马斯亮蓝R250染片30min
↓
小心地用水漂洗
↓
空气干燥
↓
直接观察或用树脂封片
实 验 结 果
用普通光学显微镜观察，可见到深蓝色的纤维束，粗细不等，基本上平行排布。在成纤维样细胞如CHO、包皮等细胞中，纤维沿细胞长轴排列:而在上皮样细胞，如HeLa等，因细胞呈多边形，张力纤维有交叉，沿不同方向跨越胞体伸向细胞突起处或粘着斑处。
图 细胞内骨架纤维的显微照片（考马斯亮蓝R250染色）
注意：张力纤维是一动态结构，在充分贴壁铺展的细胞中纤维挺直、丰富，形态比较典型；反之，张力纤维收敛略现弯曲；当将贴壁培养的细胞从基质表面除下时，细胞变圆，张力纤维随之消失。
作 业
描绘你所观察到的细胞张力纤维图像。
实验十一 杂交瘤技术
杂交瘤技术是1975年Kohler和Milstein用于制备单克隆抗体而创建的一项重要技术，被誉为“免疫学上的一次革命”。此技术被广泛用于各种单克隆抗体的制备。抗体是由B淋巴细胞分泌的，一个B淋巴细胞只能分泌一种抗体。把B淋巴细胞和骨髓细胞融合，即可形成在体外长期存活并分泌的杂交瘤细胞，如果把单个杂交瘤细胞克隆化，扩增传代，其分泌的抗体即为高度纯一的单克隆抗体。单克隆抗体具有高度专一性，一种单克隆抗体只能结合一种特定的抗原决定簇。正是由于其这种高度专一性，因此被广泛用于疾病的论断和治疗，生物大分子的鉴定、定位和分离纯化，以及一些细胞器，特定细胞或病毒的鉴定、定位和分离等方面,具有极其远大的应用前景,因此，用于制备单克隆抗体的杂交瘤技术也变得越来越重要，应用范围越来越广。
实 验 目 的
1,掌握杂交瘤技术的基本原理和基本操作方法
2,能运用杂交瘤技术来制备自己需要的单克隆抗体
实 验 原 理
杂交瘤技术的建立基于以下三种关键技术。
一、动物免疫动物体内的B淋巴细胞在特定外来抗原的刺激下，可以大量增殖变成浆细胞以分泌针对于该抗原的抗体。脾内不同的B淋巴细胞克隆可分泌针对不同抗原的抗体。当受到特定外来抗原刺激时，相应的B淋巴细胞克隆便大量增殖以分泌相应的特异性抗体。动物免疫的作用就是用特定外来抗原对动物进行一次或多次免疫，以刺激能分泌针对于该抗原抗体的B淋巴细胞大量增殖，从而得到大量产生专一的B淋巴细胞。
二、细胞融合
B淋巴细胞受外来抗原刺激后可以分泌抗体，但它在体外存活很短时间(最多两周)后即死亡；而骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白，却能在体外长期存活。如果能将这两种细胞的特性结合起来，我们就能得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。
脾脏是动物体内B淋巴细胞集中的最大免疫器官,取出脾细胞(B淋巴细胞)和骨髓瘤细胞融合后，能产生五种细胞类型；未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞,自身融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，以及脾细胞和骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。其中杂交瘤才是我们需要的，因此就要设法将此杂交瘤细胞从上述细胞混合液中挑选出来。
三、杂交瘤细胞的筛选在细胞融合后，要从上述五种细胞中筛选出杂交瘤细胞，一般使用HAT培养进行筛选，HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活,但B淋巴细胞是正常细胞,故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型,缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。杂交瘤细胞由于继承了B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成HGPRT酶和TK酶，故在HAT养基中能长期存活。因此将融合后的混合细胞在HAT培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活下来，成为制造单克隆抗体的细胞源。
实 验 用 品
一、器材
1,主要设备,无菌室一间(或超净台一台),普通离心机一台,倒置显微镜一架,酶联免疫检测仪一台,CO2恒温培养箱一台,恒温水浴一台,高压灭菌名锅一个。
2,小型器材,血细胞计数板二块,25ml和50ml培养瓶20个,96孔和24孔培养板各10块,40孔酶标板20块,50ml塑料离心管6支,10ml玻璃离心管10支,1ml、5ml和10ml吸管各4支,6cm培养皿2套,100ml和50ml培养液瓶各10个,1ml、5ml和10ml注射器各2支,小滴管8支,玻璃套管4,中、小型手术剪刀各2把,中、小型手术镊各2把,6号针头8个,L型6号针头2个,500ml和1000ml杯各2个,酒精灯一盏,不锈钢网(55cm 200目)2块,解剖盘2个,培养液抽滤灭菌装置一套,橡皮塞若干,70%酒精棉若干。
二、材料
8~12周龄BALB/c纯系小鼠10只；SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞；灭活人轮状病毒(用作抗原)。
三、试剂
RPMI 1640培养基,小牛血清(FCS),GKN液,50%PEG液,HT培养液,HAT培养液,0.5% 台盼蓝(trypan blue),1 mol/L NaOH,1 mol/L HCl,包被液,底物反应液,辣根过氧化物酶羊(或兔)抗鼠IgG,青霉素,链霉素。
[附] 各种试剂配方如下：
1,RPMI 1640基本培养液
RPMI 1640粉10g,青、链霉素各10万单位，加三蒸水最终至1000ml,用1 mol/L NaOH和1 mol/L HCl将pH调至7.0，用0.22(m滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
2,RPMI 1640完全培养液
RPMI 1640基本培养液 80ml
无菌的灭活小牛血清(FCS) 20ml
(新鲜小牛血清在56℃灭活30min后，抽滤除菌)
3,100×HT母液次黄嘌呤(H) 136.1mg
胸腺嘧啶(T) 38.8mg
三蒸水 100ml
于50℃溶解后，用0.22蕀滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
4,100×A母液氨基喋呤(A) 1.76g
三蒸水 90ml
滴加1mol/L NaOH至完全溶解，再用1mol/L HCl调pH至7.5，加三蒸水至1000ml,用0.22(m滤膜抽滤除菌，分装冻存备用。
5,HT培养液
RPMI 1640完全培养液 1000ml
100×HT母液 10ml
6,HAT 培养液
RPMI 1640完全培养液 1000ml
100×HT母液 10ml
100×A母液 10ml
7,GKN 液配方同实验三，所不同的是需用0.22(m滤膜抽滤除菌。
8,50% PEG(聚乙二醇)溶液取分子量1000Da的PEG 5g 用高压灭菌溶化，冷却50℃时加入等体积已预热至50℃的无菌GKN，充分混匀后分装冻存备用。在融合时用1mol/L NaOH调pH至8.0~8.2左右。
9,包被液
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
10,PBSS-Tween20缓冲液
NaCl 8.0g
Na2HPO4.12H2O 2.9g
KH2PO4 0.2g
KCl 0.2g
Tween 20 0.5ml
加蒸馏水至1000ml，完全溶解后置4℃保存备用。
11,底物缓冲液
A液,0.1mol/L 柠檬酸
B液,0.2mol/L Na2HPO4
取A液 24.3ml + B液 25.7ml，加入蒸馏水至100ml。
12,底物反应液(使用液)
底物缓冲液 100ml
邻苯二胺(OPD) 40mg
过氧化氢(H2O2) 150ml
实 验 方 法
杂交瘤的制备一般应包括动物免疫、细胞融合及HAT筛选、抗体的检测和克隆化几个基本操作步骤。
一、动物免疫动物免疫的方法很多，一般有常规免疫法、脾内一次性免疫法、短程免疫法和体外免疫法等。脾内一次性免疫法具有用量少、免疫程序短、不加佐剂且所得单克隆抗体的特异性较高等特点。
由于单次免疫抗原刺激后数日内就进行细胞融合，因此不存在所谓“优势克隆”的问题，从而更容易获得多种不同特异性的单克隆抗体，也能助于筛选出差别微小的两种抗原的单克隆抗体。但该方法的缺点是，其免疫效果要等杂交瘤筛选时才明了,因此在实验时有一定的随机性；此外对一些免疫原性较差的抗原决原簇的单克隆抗体的筛选较困难。常规免疫法比较可靠，由于在融合前能通过测定血清中的抗体滴度来证实免疫效果，因此实验成功的把握性较大。但由于免疫动物多次反复接受相同抗原的刺激,会使某些特定的淋巴细胞克隆大量增殖,易形成“优势克隆”,因此所产生单克隆抗体的种类较少,很可能多个克隆所产生的单克隆抗体都是针对于同一个抗原决定簇的。此外此法的免疫程序太长，费时费力。而短程免疫法和体外免疫法均各有其优缺点，在此不再介绍。在利用杂交瘤技术制备单克隆抗体时，一般采用常规免疫法。
在本实验中，我们使用人软状病毒脾内一次性免疫法来免疫动物，以达到快速简便的实验效果，也适于学生操作。具体方法如下。
1,纯化分离已灭活的人轮状病毒，并精确定量。
2,用戊巴比妥钠对2只10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉，按每克体重注射0.05g戊巴比妥馀的量对小鼠进行腹腔注射，5min后小鼠即进入昏迷状态。
3,无菌打开小鼠腹腔，暴露出脾脏，用1ml注射器将含有30ng的0.1ml抗原(人轮状病毒)液分别注射到两只小鼠脾脏内。
4,将脾脏轻轻复位，缝合伤口，饲养备用。
5,免疫三天后取脾细胞进行融合。
二、细胞融合及HAT筛选细胞融合方法一般有病毒介导的细胞融合、PEG介导细胞融合及电融合等。病毒介导的细胞融合方法要涉及仙台病毒的培养和灭活，尤其是仙台病毒的培养条件要求严格，过程比较复杂，因此现在一般不使用此方法。电融合为80年代刚刚兴起的一种融合方法，它除需要昂贵的电融合仪外，另外还需要特定的技术条件。目前最常使用的融合方法是PEG介导的细胞融合方法,该方法具有操作简便、快速省时且融合效果好等优点。本实验使用的是一种快速PEG融合方法，具体操作如下；
(一) 细胞悬液的制备(均在无菌条件下操作)
在杂交瘤技术中要使用三种细胞悬液；脾细胞悬液、SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞悬液和腹腔巨噬细胞(用作饲养细胞)悬液。
1,脾细胞悬液的制备取已免疫BALB/c小鼠，于免疫后第三天用眼球放血处死(收集流出血液制备阳性血清)，用70%精浸泡5min后，无菌打开腹腔，取出脾脏，去除多余的脂肪组织，用37GKN液清洗2-3次。向脾内注射0.2ml GKN液后(使脾脏膨胀以得于细胞散开)，放入培养皿中，加入5mlGKN，用L型6号针头将脾细胞轻轻挤出，用滴管吹打数次以使细胞散开成单细胞状态。用不锈钢网将此细胞悬液过滤到一个50ml塑料离心管中，再加入10ml GKN液，混匀后，1000r/min心与5min，弃上清，用10ml GKN液重新悬浮细胞，取0.1ml均匀细胞悬液进行活细胞计数，其余细胞悬液入37℃备用。
2,SP2/0-Ag14细胞悬液的制备将SP2/0-Ag14细胞用RPMI 1640完全培养液作增殖培养，每天传代一次，连续传代3天，使细胞在融合时达到对数生长期。取3~5瓶(50ml的培养瓶)SP2/0 Ag14细胞，倾去原来的培养上清液，每瓶加入37℃ GKN液4ml，将细胞悬浮起来，收集各瓶中细胞液放入一个50ml塑料离心管中1000r/min离心5min(为省时可同脾细胞一同离心)，弃去上清液，用10ml 37℃ GKN液将细胞悬浮均匀,取0.1ml用活细胞计数，其余悬液放37℃备用。
3,腹巨噬细胞悬液的制备杂交瘤细胞开始生长时,需要有饲养细胞,一般用腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。
取12周龄BALB/c小鼠，拉颈处死，浸入70%酒精中消毒5min。在解剖盘中无菌打开腹部皮肤，暴露出腹膜，向腹腔中注入10ml RPMI 1640完全培养液,按摩腹部1~2min后,用注射器抽出腹腔液(一般可抽出8~9ml)，放入一个50ml塑料离心管中,置37℃备用。一般一只小鼠取出的腹腔巨噬细胞可接种3~5块24孔或96孔培养板。可根据需要接种的培养板数来确定所使用饲养细胞的量。
(二) 细胞融合及HAT筛选(在无菌条件下操作)
已计数脾细胞和骨髓瘤细胞按6:1的数量比例混合于离心管
↓
1000r/min离心5min
↓弃上清轻弹离心管底部，使沉淀细胞松散
↓40℃预热1~2min
边摇边在45秒内匀速加工50% PEG溶液
↓
90秒内边摇边向管内加速加入37℃ GKN液
↓室温静置10min
1000r/min离心10分钟
↓
加入37℃的腹腔巨噬细胞悬液和40ml HAT培养液
↓
将细胞悬液分种于二块24孔板和96孔板
↓
37℃ 5% CO2孵箱中培养
↓
观察细胞的生长情况
↓
5天用HAT培养液半量换液10天用HT培养液半量换液
14天用HT培养液全量换液
↓
当杂交瘤细胞长满孔底面积的1/2~2/3时,即可取培养上清液进行抗体检测
三、抗体的检测杂交瘤技术所使用的抗体检测方法必须具有简便、快速、敏感而且能在短时间内检测大量样品的特点。常用的方法有酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IIF)、放射免疫法(radioimmunoassay,RIA)和双相扩散法等。间接免疫荧光法需要使用荧光显微镜，价格昂贵，灵敏度也较低，而且不能用于可溶性抗原的抗体检测，但其优点是能进行反应的定位。放射免疫法操作较复杂，所用的液体闪烁仪及制剂价格昂贵，但其灵敏度较高。而酶联免疫吸附法则操作简便快速、灵敏度高(0.5ng/ml)，且适于大规模操作,它需要酶联免疫检测仪,价格较便宜。双相扩散法操作简单，不需要昂贵仪器，实验周期也较短，但灵敏度较低，一般可用于抗体的初步检测。
在杂交瘤技术中常常使用酶联免疫吸附法和双相扩散法。下面分别介绍一下。
(一) 酶联免疫吸附法纯人轮状病毒用包被液稀释到10(g/100(l
↓
将此浓度抗原液按每孔100(l的量分别加入40孔酶标板孔中轻轻震荡使液体覆盖孔底
↓
4℃过夜
↓
倾去酶标板液体用PBSS-Tween20缓冲液洗涤每次洗3min共洗3次
↓
1%小牛血清白蛋白室温下封闭30min
↓
甩去封闭液用PBSS-Tween20缓冲液洗3次，每次3min
↓
每孔加入待测杂交瘤培养上清液100(l
留出4孔加入100(l阳性血清作为阳性对照
4孔加入100(l HT培养液作为阴性对照
4孔加入PBSS-Tween20缓冲液100(l作为空白对照。
↓
加入标有辣根过氧化物酶的羊(或兔)抗鼠IgG，37℃孵育60min
↓
甩去酶标二抗液，用PBSS-Tween20缓冲液清洗5次，每次3min
↓
加入100(l邻苯二胺底物反应液，室温暗处反应30min
↓
每孔加入1滴2mol/L H2SO4以终止反应，用酶联免疫检测仪进行结果检测
（呈现棕褐色反应者为阳性反应。检测出上清液为阳性的培养板孔即为阳性孔，可进行克隆化实验）
(二) 双相扩散法
1,用含有0.01%NaN3和1%琼脂的磷酸缓冲液倒平板,每块9cm培养皿加18ml。
2,用打孔器在倒好的琼脂平板上均匀打7个孔，中央一孔的孔经为4mm，周围6孔的孔经为6mm中央孔与周围孔的间距为8~10mm。
3,中央孔加入待测的杂交瘤培养上清液至孔满，周围孔也分别加入羊(或兔)抗鼠二抗IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM的标准抗体制品至孔满。吸干待测孔中的液体后将培养皿倒置。
4,40℃放置5~7h或37℃过夜。
5,取出琼脂板观察结果，出现沉淀线可初步判定为免疫反应呈阳性,另外还可根据沉淀线的位置来确定所含抗体的类型。
6,有阳性免疫反应的培养上清液原来所在的培养孔即为阳性孔,可进行克隆化实验。
四、克隆化 (在无菌条件下操作)
对阳性孔中的杂交瘤细胞进行克隆化培养的方法一般有有限稀释法、软琼脂平板法和显微操作法等。软琼脂平板法操作比较繁琐，特别是在大量克隆化培养时需要制备很多平板，费时费力。而显微操作法需要使用显微操纵仪，价格昂贵，而且不适于大量样品克隆化。但有稀释法却具有简便快速且适于大规模操作等优点，因此在杂交瘤细胞的克隆化操作中常常使用这种方法。有限稀释法的具体方法如下；
1,将阳性孔中的杂交瘤细胞吹打均匀悬液，取0.1ml进行活细胞计数。
2,用含有腹腔巨噬细胞的RPMI 1640完成全培养液对杂交瘤细胞进行梯度稀释,使其浓度分别为每毫升50个、15个、5个细胞。
3,把三种稀释度的杂交瘤细胞悬液分种于三块孔培养板孔中(0.2ml/孔)。
4,置37℃ 50%CO2孵箱中培养。
5,培养到第五天便可看到较小的细胞克隆,待单细胞克隆长满孔底面积的1/2~1/3时，再进行抗体检测。阳性孔中的单克隆杂交细胞即为阳性克隆，所分泌的抗体即为单克隆抗体。
获得单克隆杂交瘤细胞后，可通过免疫交叉实验来确定其所分泌的单克隆抗体是不是人轮状病毒所特有的。没有交叉反应的单克隆抗体即可用于人轮状病毒的临床论断和治疗。有必要时可进行再克隆实验，以建立能稳定分泌异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
实 验 结 果
一、免疫效果的初步观察在细胞融合前取出脾脏时，如果脾脏比正常状态明显膨大，则说明有免疫效果,用此脾脏的脾细胞进行细胞融合成功的可能性较大；如果脾脏无明显膨大则说明免疫效果不佳，可及时终止实验，以免浪费人力物力而一无所莸。
二、融合结果的观察细胞融合后，将培养板置倒置显微镜下观察，则可看到各种类型的细胞,有未融合的脾细胞和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞，也有融合细胞。在融合细胞中,有的已完成融合过程，变成了融合细胞，有的仍然呈哑铃形，在高倍镜下仔细观察即可分辨出细胞中有两个核，可以计算一下融合率来判定融合效果。
在融合后第3~5天。便可看到SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞大量死亡。死亡细胞逐渐变得不透明，最终解体，丧失贴壁性，从孔底脱落，以换液可清除部分死亡细胞以免影响活细胞的生长。培养孔中较大的透亮细胞为杂交瘤细胞。脾细胞较小，于在融合后第14天左右开始大量死亡，经换液可去除部分死亡细胞以减少对活细胞的毒害作用。
在融合后第5天左右便有杂交瘤细胞开始分裂,从而出现一些的较小的细胞克隆,一个培养孔往往会出现多个细胞克隆。
三、克隆化结果的观察在克隆化后第5天左右即可看到小的细胞克隆，检查培养板并标出含有单个细胞克隆的培养孔。单细胞克隆的外形应为圆形，形状非圆形的细胞团则可能不是单细胞克隆。
作 业
1,细胞融合后，各种类型的细胞在倒置显微镜下形态如何?
2,单细胞克隆有何形态特征? 如何判定一个细胞团是不是单克隆细胞?
思 考 题
1,骨髓瘤细胞和脾细胞分别于融合后什么时间开始大量死亡? 为什么?
答：骨髓瘤细胞和脾细胞在融合后第3~5天开始大量死亡，原因是HAT培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。细胞的DNA合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。内源性途径就是利用谷氨酰胺或单磷酸尿苷酸在二氢叶酸还原酶的催化下来合成DNA；而外源性途径则是利用次黄嘌呤或胸腺嘧啶在次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT)或胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)的催化下来补救合成DNA，HAT培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂,能有效地阻断DNA合成的内源性途径。B淋巴细胞具有HGPRTTK这两种酶,因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT培养基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶来合成DNA，可在HAT培养基中存活,但B淋巴细胞是正常细胞,故不能长期存活。杂交瘤技术中所使用和SP2/0-Ag14骨髓瘤细胞为HGPRT-的TK-缺陷型,缺乏HGPRT酶和TK酶在内源性途径被阻断后不能进行DNA的外源性合成，故不能在HAT培养基中存活。
实验十二 联会复合体的染色与观察
Mose(1956) 最早在研究精喇姑精母细胞减数分裂前期的超微结构时发现联会复合体(synaptonemal complex,S.C)，1977年他又证明使用光学显微镜可以检查联会复合体。其后发展了许多适用于光学显微镜检查用的S.C染色法。依靠光学显微镜显示联会复合体的技术，不仅对于联会复合体的结构和功能的研究有用，而且在临床细胞遗传学中对染色体异常、遗传性疾病的病因和病理研究，以及环境诱变剂的检测等均不失为一种新的有效研究手段。
实 验 目 的
1,学习光学显微镜下显示联会复合体的实验技术
2,观察光镜下联会复合体的形态结构
实 验 原 理
联会复合体是减数分裂前期同源染色体配对形成的非永久性核内特殊结构，典型的联会复合体由三股平行的线状结构组成，即两条平行侧线和一条纤细的中央轴组成。一般开始于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。它与减数分裂三个重要环节同源染色体联会、交换以及分离有着密切关系。大量工作表明，联会复合体在真核生物的减数分裂过程中是普遍存在的。
实 验 用 品
一、材料 雄性小白鼠二、器材离心机、显微镜、水浴、培养皿、镊子、剪刀、吸管、烧杯、量筒、离心管(10ml)、酒精灯。
三、试剂 (所用试剂均为AR级)
1、0.7%柠檬酸钠(柠檬酸三钠)溶液。
2、3%中性福尔马林(甲醛溶液):甲醛8.3ml，醋酸钠() 1.1g，加蒸馏水91.7ml。
3、50%硝酸银溶液
4、明胶显影液,称取2g明胶(gelatin)粉末溶解于99ml蒸馏水中，加1ml甲酸。
5、甲醇-冰醋酸
实 验 方 法
脱颈处死动物取睾丸
↓
放2ml 0.7%柠檬酸钠培养皿中
↓
释放曲细精管内容物（剪开白膜，用解剖针和小弯镊挟出曲细精管并剪碎，用吸管轻轻吹打）
↓移至刻度离心管中加8ml 0.7%柠檬酸钠溶液制成细胞悬液
↓
室温下低渗45~60min
↓
低渗终止前10min，加3%中性甲醛溶液0.3ml，至最终浓度为0.1%，混匀
↓
常规离心(1000r/min)
↓弃上清甲醇和冰醋酸(3:1)混合液固定
↓
空气干燥法制片（关键是长时间的低渗液处理和添加福尔马林溶液）
↓
银染
[附] 银染方法
(1)在培养皿底部放一用少量蒸馏水润湿的滤纸，上放2根小玻棒(或竹杆)，置水浴内保温(80℃)。(2)玻片标本细胞面朝上平放其上，加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显影液，复以盖玻片(或擦镜纸)，直到玻片标本呈金褐色为止，一般为3-4min。(3)移除盖片，并用蒸馏水快速漂洗，晾干。(4)观察或摄影，分析。
实 验 结 果
银染后的联会复合体呈金黄或黄褐色，两条同源染色体联会较紧，但端部仍可见联会复合体结构的双股性。可见Y染色体的大部分和X染色体的一部分局部配对，形成短而清晰的联会复合体。
作 业
1,总结出利用银染法显示联会复合体的实验原理；
2,绘制光学显微镜下联会复合体的形态模式图。
