基因工程原理牛颜冰
niuniugood@yahoo.com.cn
,基因工程原理,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer.
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶及其应用
50年代初发现了由寄主控制的 限制和修饰现象大肠杆菌 B 大肠杆菌 K
1
1
4× 10 — 4
10 — 4 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
限制 — 修饰的酶学假说酶切位点不被修饰噬菌体 DNA
被切割酶切位点被修饰
Methylation
基因组 DNA
不被切割
1968年,Meselson 和 Yuan从大肠杆菌 K和 B中发现了 I型限制性核酸内切酶；
1970年,Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个 II型限制性核酸内切酶 Hind II，使得 DNA分子的体外精确切割成为可能。
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）,是一类能够识别双链 DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链 DNA分子的核酸内切酶。 已经从近 300中微生物中分离出了 500余种限制性核酸内切酶。
限制性核酸内切酶的分类
1,限制修饰活性
2,内切酶的蛋白质结构
3,限制辅助因子
4,切割位点
5,特异性切割
6,基因克隆中
I 型单一多功能的酶
3种不同亚基
ATP,Mg2+和 S-
腺苷甲硫氨酸距特异性位点
1000bp
不是无用
II 型限制酶和修饰酶分开单一成分
Mg2+
特异性位点及其附近是非常有用
III 型双功能酶
2种亚基
ATP,Mg2+和 S-
腺苷甲硫氨酸特异性位点 3‘端
24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名
1,寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌 Escherichia
coli 表示为 Eco,流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示为
Hin；
2,用一个正体字母表示菌株的类型，比如 EcoR,Hind；
3,如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如 Eco R I,Hind III。
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶
II型限制性核酸内切酶的 3大特点
1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的 DNA识别位点，通常是由 4,5,6或 7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
3、切割位点的规范性 双链 DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的 DNA分子）。
与 II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条 DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易 通过互补碱基的配对而重新 连接 起来。
平 末 端 Blunt end 因酶切位点在两条 DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端 不易 重新 连接 起来。
同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。
同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。
注 意,由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
几种 II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I Provindencia stuartii 164 CTGCAG
GACGTC
Haemophilus influenzae Rd
经同尾酶消化的 DNA末端连接示意图
5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’
BamH I
5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAG GXXXXXX 5’
5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
BglII
5’ XXXXA GATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAG AXXXXXX 5’
5’ XXXXA GATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAG GXXXXXX 5’
5’ XXXXAGATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAGGXXXXXX 5’
BamH I Bgl II
推测酶切割位点出现的频率对于推断 DNA酶切片段大小很有用。 假定 4
种核苷酸在 DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为 6个核苷酸的内切酶在每 46（ =4096） 个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条
4900bp长的 DNA中有 12个 6核苷酸识别序列的酶切位点（ 49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为 DNA分子中 4种碱基的出现频率并不均等。
识别位点在 DNA分子上出现的频率
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶一个酶单位 （ U） 指,在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为 37℃ ）下,50?L反应体系中完全降解 1?g? DNA所需要的酶量。
影响酶活性的因素很多，最重要的有：
A。 DNA的纯度和甲基化程度
B。 甘油的含量（不超过 5%）
C。 反应体系中的离子强度
D。 反应体系的 pH值
F。 反应的温度条件
（通常为 37℃ ）
酶单位的定义和影响酶活性的因素
Buffer (10X) 2.0?L
Water 16.5?L
DNA 1.0?L
Enzyme 0.5?L
Volume 20.0?L
酶 切 反 应 的 基 本 步 骤
＋
－
电泳 紫外分析37℃ 1h加反应液
CK M
Buffer (10X) 2.0?L
Water 16.5?L
DNA 1.0?L
Enzyme 0.5?L
Volume 20.0?L
1.0kb 1.0kb
0.4kb
0.5kb
0.6kb
CK MTT
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1,DNA连接酶作用的特点
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
DNA连接酶的发现环形 DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 Nick的酶存在。
1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在 2条
DNA链之间形成 磷酸二酯键 的酶 —— DNA连接酶（ ligase） 。
DNA连接酶 由大肠杆菌基因组 DNA编码，以 NAD+作为能源辅助因子 ；
T4DNA连接酶 由大肠杆菌 T4噬菌体 DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子。
（ 1970年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端 DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。
Nick
Nick
DNA连接酶作用的特点
A,连接的两条链必须分别具有 3′ 端自由羟基（ -OH）
和 5 ′ 端磷酸基团（ -P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B,在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即 ATP和 NAD+。
OK
NO
载体去磷防止自连的应用示例
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
DNA连接反应的条件连接反应最佳温度为 37℃,但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如,EcoRI 粘性末端连接部位只有 4个碱基对，很容易断开。所以 通常在 4-15℃ 连接。
影响连接效率的因素有：
A,温度（最主要的因素）
B,ATP的浓度 ( 10?M - 1?M )
C,连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）
D,反应时间（通常连接过夜）
E,插入片段和载体片段的摩尔比转化
4℃ 过夜加反应液
CK- 重组菌落CK+
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用粘性末端 DNA片段的连接
Nick
Nick
平末端 DNA片段的末端加尾连接法
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶 和
T4DNA连接酶平末端 DNA片段加接头连接法衔接物 (linker)，也叫接头,是有人工化学合成的一段 10-
12个核苷酸的 DNA双链，其中包含有 1个或几个限制性酶切位点。
使用时只须将衔接物和目的片段的 5′ 端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用 T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的 DNA片段。
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
磷酸化 CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH
OH
P
P
POH
OH
T4连接酶
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH P
OH
EcoR I
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
AATTCGG
GCC
CCG
GGCTTAA
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ E。 Coli DNA pol I）是 Kornberg
A,1956年首先从大肠杆菌 E。 Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：
A,5′- 3′聚合酶活性 以双链 DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的 3′末端，并不断延伸。
B,5′- 3′外切酶活性 将双链 DNA中游离的 5′末端逐个切去。
C,3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链 DNA的 3′端降解。不过对于双链的降解可被 5′-3′的多聚活性所抑制。
CCG
GGCTATCGGA
CCG
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
ATAGCCT
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
CCGATAGCCT
GGCTA
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
CCGATAGCCT
GGCTA
Pol I + Mg2+
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的三种用途
A,制备高比活度的 DNA探针利用其 5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
B,用于 DNA连接后的大缺口填充利用 5′--3′的聚合酶活性。
C,用于 DNA的序列分析利用 5′--3′的聚合酶活性。
大肠杆菌聚合酶 I的应用示例
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
缺口转移
(Nick translation)
CCG
GGCTATCGGA
CCG
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
ATAGCCT
缺口转移 (Nick translation)
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
Klenow片段的主要用途
Klenow片段 大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性，但失去了 5′→3′ 的外切酶活性。
Klenow片段的主要用途
A,修补限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隐蔽末端
B,标记 DNA片段的末端
C,cDNA克隆中第二链 cDNA的合成
D,DNA序列的测定
GAA
CTTAA
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
T4DNA聚合酶的特点
T4DNA聚合酶是 从 T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，
它和 Klenow片段一样具有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3 ′→ 5 ′
的核酸外切酶活性。 其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高 200倍。
特别是,T4DNA聚合酶还有第三种活力 — 取代反应：
如果反应体系中仅存在一种 dNTP，这时 T4DNA聚合酶就会表现出
3 ′→ 5 ′ 外切酶活力，从双链 DNA的 3′ 开始降解，直到露出和缺乏的那中 dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。
CGTCGC
GCAGCG
CGT
GCAGCGdTTP
Mg++ CG
GCAGCG dTTP
Mg++
T4DNA聚合酶的用途
1、以填充反应标记有 5′ 端延伸的双链
DNA片段
2、以取代反应标记延伸末端或平头末端的双链 DNA片段
3、用于 DNA序列分析
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用逆转录酶 — Reverse transcriptase
逆转录酶是 一种可以有效地将 mRNA转录成为 DNA的酶，其产物称为 cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种 RNA依赖的
DNA聚合酶。
逆转录酶首先是 1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。
这两个课题组的论文都发在了同一期的,Nature,杂志上。
主要用途是 将 mRNA转录成 cDNA以制备基因片段。
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
4、碱性磷酸化酶第四节 修饰性工具酶末端转移酶的特性
末端转移酶是一类不依赖于 DNA模板的 DNA聚合酶 。
该类酶可以在没有模板链存在的情况下,将核苷酸连接到 DNA的在 3‘ 羟基,特别是对于平末端的双链 DNA末端加尾十分有效 。
最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端 。
Characters of the polymerase
Terminal transferase is the common name of
template-independant DNA polymerase,This enzyme is
isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3'
hydroxyl groups of DNA without the need for a
template,The best primer is double stranded DNA
(dsDNA) with blunt ends,Purine bases require
magnesium ions and pyrimidine bases require cobalt
ions,The enzyme builds up homopolymer chains if
supplied with appropriate dNTPs.
The most common use for this enzyme is the generation
of complementary tails on DNA fragments and vectors
cut with restriction enzymes which generate blunt ends.
平末端 DNA片段的末端加尾连接法
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶和
T4DNA连接酶
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
3、碱性磷酸化酶（ Alkaline phosphatase）
第四节 修饰性工具酶核酸酶 SI的特性这是一种从米曲霉（ Aspergillus oryzae）
中分离的可以降解单链 DNA或 RNA的外切酶 。
其主要用途有：
A、在 cDNA合成过程中，切开 cDNA的发夹末端；
B、载体构建过程中，切去 DNA片段的单链尾巴，
形成平末端结构。
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
发夹结构的切除单链尾巴的切除
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
3、碱性磷酸化酶第四节 修饰性工具酶碱性磷酸化酶的特性从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称 BAP（ Bacterial
Alkaline Phosphatase），从小牛肠中分离的简称 CAP
（ Calf Alkaline Phosphatase）,其主要功能是将 DNA
或 RNA5′ 端的磷酸切除。
其主要用途有：
A、在用 P标记 DNA 5′端之前，去除 5′端的磷；
B、在 DNA重组技术中，去除 DNA片段的 5′磷酸，防止载体的自身环化。
载体去磷防止自连的应用示例
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等小 结第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶及其应用
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
4、碱性磷酸化酶（ Alkaline phosphatase）
第四节 修饰性工具酶基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞思考题
1,什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？
2,II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？
3,什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？
4,酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？
5,DNA连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用价值？
6,大肠杆菌 DNA聚合酶 I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。
7,Klenow片段和大肠杆菌 DNA聚合酶 I有何异同？
8,为什么说逆转录酶（ Reverse transcriptase）是一种特殊的 DNA聚合酶，其主要用途是什么？
9,举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。
10.为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？
niuniugood@yahoo.com.cn
,基因工程原理,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer.
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶及其应用
50年代初发现了由寄主控制的 限制和修饰现象大肠杆菌 B 大肠杆菌 K
1
1
4× 10 — 4
10 — 4 E.O.P 成斑率
efficiency of plating
限制 — 修饰的酶学假说酶切位点不被修饰噬菌体 DNA
被切割酶切位点被修饰
Methylation
基因组 DNA
不被切割
1968年,Meselson 和 Yuan从大肠杆菌 K和 B中发现了 I型限制性核酸内切酶；
1970年,Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个 II型限制性核酸内切酶 Hind II，使得 DNA分子的体外精确切割成为可能。
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶（ Restriction endonucleases）,是一类能够识别双链 DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链 DNA分子的核酸内切酶。 已经从近 300中微生物中分离出了 500余种限制性核酸内切酶。
限制性核酸内切酶的分类
1,限制修饰活性
2,内切酶的蛋白质结构
3,限制辅助因子
4,切割位点
5,特异性切割
6,基因克隆中
I 型单一多功能的酶
3种不同亚基
ATP,Mg2+和 S-
腺苷甲硫氨酸距特异性位点
1000bp
不是无用
II 型限制酶和修饰酶分开单一成分
Mg2+
特异性位点及其附近是非常有用
III 型双功能酶
2种亚基
ATP,Mg2+和 S-
腺苷甲硫氨酸特异性位点 3‘端
24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名
1,寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成 3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌 Escherichia
coli 表示为 Eco,流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示为
Hin；
2,用一个正体字母表示菌株的类型，比如 EcoR,Hind；
3,如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如 Eco R I,Hind III。
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶
II型限制性核酸内切酶的 3大特点
1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的 DNA识别位点，通常是由 4,5,6或 7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。
2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。
3、切割位点的规范性 双链 DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的 DNA分子）。
与 II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端 cohesive ends 因酶切位点在两条 DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易 通过互补碱基的配对而重新 连接 起来。
平 末 端 Blunt end 因酶切位点在两条 DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端 不易 重新 连接 起来。
同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。
同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。
注 意,由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。
几种 II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I Provindencia stuartii 164 CTGCAG
GACGTC
Haemophilus influenzae Rd
经同尾酶消化的 DNA末端连接示意图
5’ XXXXGGATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAGGXXXXXX 5’
BamH I
5’ XXXXG GATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXCCTAG GXXXXXX 5’
5’ XXXXAGATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAGAXXXXXX 5’
BglII
5’ XXXXA GATCTXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAG AXXXXXX 5’
5’ XXXXA GATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAG GXXXXXX 5’
5’ XXXXAGATCCXXXXXX 3’
3’ XXXXTCTAGGXXXXXX 5’
BamH I Bgl II
推测酶切割位点出现的频率对于推断 DNA酶切片段大小很有用。 假定 4
种核苷酸在 DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为 6个核苷酸的内切酶在每 46（ =4096） 个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条
4900bp长的 DNA中有 12个 6核苷酸识别序列的酶切位点（ 49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为 DNA分子中 4种碱基的出现频率并不均等。
识别位点在 DNA分子上出现的频率
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶一个酶单位 （ U） 指,在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为 37℃ ）下,50?L反应体系中完全降解 1?g? DNA所需要的酶量。
影响酶活性的因素很多，最重要的有：
A。 DNA的纯度和甲基化程度
B。 甘油的含量（不超过 5%）
C。 反应体系中的离子强度
D。 反应体系的 pH值
F。 反应的温度条件
（通常为 37℃ ）
酶单位的定义和影响酶活性的因素
Buffer (10X) 2.0?L
Water 16.5?L
DNA 1.0?L
Enzyme 0.5?L
Volume 20.0?L
酶 切 反 应 的 基 本 步 骤
＋
－
电泳 紫外分析37℃ 1h加反应液
CK M
Buffer (10X) 2.0?L
Water 16.5?L
DNA 1.0?L
Enzyme 0.5?L
Volume 20.0?L
1.0kb 1.0kb
0.4kb
0.5kb
0.6kb
CK MTT
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1,DNA连接酶作用的特点
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
DNA连接酶的发现环形 DNA分子的发现使科学家相信一定有一种能连接这种 Nick的酶存在。
1967年，世界上几个实验室几乎同时发现了一种能够催化在 2条
DNA链之间形成 磷酸二酯键 的酶 —— DNA连接酶（ ligase） 。
DNA连接酶 由大肠杆菌基因组 DNA编码，以 NAD+作为能源辅助因子 ；
T4DNA连接酶 由大肠杆菌 T4噬菌体 DNA编码，以 ATP作为能源辅助因子。
（ 1970年） 容易制备，而且可以连接完全配对的平末端 DNA分子，所以在基因克隆中应用广泛。
Nick
Nick
DNA连接酶作用的特点
A,连接的两条链必须分别具有 3′ 端自由羟基（ -OH）
和 5 ′ 端磷酸基团（ -P），而且只有这两个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B,在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与，通常有两种能量分子，即 ATP和 NAD+。
OK
NO
载体去磷防止自连的应用示例
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
DNA连接反应的条件连接反应最佳温度为 37℃,但是此时粘性末端间氢键结合不够稳定，而且酶活性也会迅速降低。比如,EcoRI 粘性末端连接部位只有 4个碱基对，很容易断开。所以 通常在 4-15℃ 连接。
影响连接效率的因素有：
A,温度（最主要的因素）
B,ATP的浓度 ( 10?M - 1?M )
C,连接酶浓度（平末端较粘性末端要求高）
D,反应时间（通常连接过夜）
E,插入片段和载体片段的摩尔比转化
4℃ 过夜加反应液
CK- 重组菌落CK+
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用粘性末端 DNA片段的连接
Nick
Nick
平末端 DNA片段的末端加尾连接法
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶 和
T4DNA连接酶平末端 DNA片段加接头连接法衔接物 (linker)，也叫接头,是有人工化学合成的一段 10-
12个核苷酸的 DNA双链，其中包含有 1个或几个限制性酶切位点。
使用时只须将衔接物和目的片段的 5′ 端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后用 T4DNA连接酶进行连接，就可获得能产生粘性末端的 DNA片段。
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
磷酸化 CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH
OH
P
P
POH
OH
T4连接酶
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH P
OH
EcoR I
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
AATTCGG
GCC
CCG
GGCTTAA
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用大肠杆菌 DNA聚合酶 I（ E。 Coli DNA pol I）是 Kornberg
A,1956年首先从大肠杆菌 E。 Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力：
A,5′- 3′聚合酶活性 以双链 DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的 3′末端，并不断延伸。
B,5′- 3′外切酶活性 将双链 DNA中游离的 5′末端逐个切去。
C,3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链 DNA的 3′端降解。不过对于双链的降解可被 5′-3′的多聚活性所抑制。
CCG
GGCTATCGGA
CCG
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
ATAGCCT
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
CCGATAGCCT
GGCTA
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
CCGATAGCCT
GGCTA
Pol I + Mg2+
大肠杆菌 DNA聚合酶 I 的三种用途
A,制备高比活度的 DNA探针利用其 5′--3′的外切酶活性及其聚合酶活性。
B,用于 DNA连接后的大缺口填充利用 5′--3′的聚合酶活性。
C,用于 DNA的序列分析利用 5′--3′的聚合酶活性。
大肠杆菌聚合酶 I的应用示例
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
CCGATAGCCT
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
缺口转移
(Nick translation)
CCG
GGCTATCGGA
CCG
GGCTATCGGA
Pol I + Mg2+
ATAGCCT
缺口转移 (Nick translation)
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
Klenow片段的主要用途
Klenow片段 大肠杆菌聚合酶 I 全酶经枯草杆菌蛋白酶处理后产生的大片段酶分子，它仍然有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性，但失去了 5′→3′ 的外切酶活性。
Klenow片段的主要用途
A,修补限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隐蔽末端
B,标记 DNA片段的末端
C,cDNA克隆中第二链 cDNA的合成
D,DNA序列的测定
GAA
CTTAA
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
T4DNA聚合酶的特点
T4DNA聚合酶是 从 T4噬菌体感染了的大肠杆菌中分离出来的，
它和 Klenow片段一样具有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3 ′→ 5 ′
的核酸外切酶活性。 其外切酶活性要比大肠杆菌聚合酶 I 的活性高 200倍。
特别是,T4DNA聚合酶还有第三种活力 — 取代反应：
如果反应体系中仅存在一种 dNTP，这时 T4DNA聚合酶就会表现出
3 ′→ 5 ′ 外切酶活力，从双链 DNA的 3′ 开始降解，直到露出和缺乏的那中 dNTP互补的碱基，然后就在此位置发生合成和取代反应。
CGTCGC
GCAGCG
CGT
GCAGCGdTTP
Mg++ CG
GCAGCG dTTP
Mg++
T4DNA聚合酶的用途
1、以填充反应标记有 5′ 端延伸的双链
DNA片段
2、以取代反应标记延伸末端或平头末端的双链 DNA片段
3、用于 DNA序列分析
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用逆转录酶 — Reverse transcriptase
逆转录酶是 一种可以有效地将 mRNA转录成为 DNA的酶，其产物称为 cDNA(complementary DNA).实际上，它也是一种 RNA依赖的
DNA聚合酶。
逆转录酶首先是 1970年从鼠白血病毒和劳氏肉瘤病毒中发现的。
这两个课题组的论文都发在了同一期的,Nature,杂志上。
主要用途是 将 mRNA转录成 cDNA以制备基因片段。
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
Genetic engineering is largely an exercise in carefully
controlled enzymology,A variety of enzymes form the
basic toolkit of the genetic engineer,
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
4、碱性磷酸化酶第四节 修饰性工具酶末端转移酶的特性
末端转移酶是一类不依赖于 DNA模板的 DNA聚合酶 。
该类酶可以在没有模板链存在的情况下,将核苷酸连接到 DNA的在 3‘ 羟基,特别是对于平末端的双链 DNA末端加尾十分有效 。
最常见的用途是在酶切产生的平末端加尾以便于创造粘性的互补末端 。
Characters of the polymerase
Terminal transferase is the common name of
template-independant DNA polymerase,This enzyme is
isolated from calf thymus and can add nucleotides to 3'
hydroxyl groups of DNA without the need for a
template,The best primer is double stranded DNA
(dsDNA) with blunt ends,Purine bases require
magnesium ions and pyrimidine bases require cobalt
ions,The enzyme builds up homopolymer chains if
supplied with appropriate dNTPs.
The most common use for this enzyme is the generation
of complementary tails on DNA fragments and vectors
cut with restriction enzymes which generate blunt ends.
平末端 DNA片段的末端加尾连接法
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶和
T4DNA连接酶
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
3、碱性磷酸化酶（ Alkaline phosphatase）
第四节 修饰性工具酶核酸酶 SI的特性这是一种从米曲霉（ Aspergillus oryzae）
中分离的可以降解单链 DNA或 RNA的外切酶 。
其主要用途有：
A、在 cDNA合成过程中，切开 cDNA的发夹末端；
B、载体构建过程中，切去 DNA片段的单链尾巴，
形成平末端结构。
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
发夹结构的切除单链尾巴的切除
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
3、碱性磷酸化酶第四节 修饰性工具酶碱性磷酸化酶的特性从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称 BAP（ Bacterial
Alkaline Phosphatase），从小牛肠中分离的简称 CAP
（ Calf Alkaline Phosphatase）,其主要功能是将 DNA
或 RNA5′ 端的磷酸切除。
其主要用途有：
A、在用 P标记 DNA 5′端之前，去除 5′端的磷；
B、在 DNA重组技术中，去除 DNA片段的 5′磷酸，防止载体的自身环化。
载体去磷防止自连的应用示例
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等小 结第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第二章 基因操作的工具酶第一节 限制性核酸内切酶及其应用第二节 DNA连接酶及其应用第三节 DNA聚合酶及其应用第四节 修饰性工具酶
1、限制性核酸内切酶的发现
2、限制性核酸内切酶的分类合命名
3,II型限制性核酸内切酶的基本特性
4、限制性核酸内切酶的消化反应第一节 限制性核酸内切酶及其应用
1,DNA连接酶作用的机理
2,DNA连接酶的反应条件
3,DNA连接的策略第二节 DNA连接酶及其应用
1、大肠杆菌 DNA聚合酶 I
2,Klenow片段
3,T4 DNA聚合酶
4、逆转录酶（反转录酶）
第三节 DNA聚合酶及其应用
1、末端转移酶（ terminal transferase）
2、核酸酶 SI（ SI nuclease）
4、碱性磷酸化酶（ Alkaline phosphatase）
第四节 修饰性工具酶基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞思考题
1,什么是限制性核酸内切酶，它们是怎样命名的？
2,II型限制性核酸内切酶的基本特性有哪些？
3,什么是粘性末端、平末端、同尾酶和同裂酶？
4,酶的单位是怎样定义的，影响酶活性的因素有哪些？
5,DNA连接酶的作用特点有哪些，了解这些特点有何使用价值？
6,大肠杆菌 DNA聚合酶 I 有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。
7,Klenow片段和大肠杆菌 DNA聚合酶 I有何异同？
8,为什么说逆转录酶（ Reverse transcriptase）是一种特殊的 DNA聚合酶，其主要用途是什么？
9,举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有重要的用途。
10.为什么说基因工程实际上是精细的酶学操作工程？
