,基因工程概论,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术质粒 DNA的小量制备
① 将含有质粒 DNA的大肠杆菌接种到 LB培养基中 （ 含有相应抗生素 ）,在 37℃ 下震荡培养过夜,这样质粒 DNA便随着细菌的繁殖而得到了大量的扩增 。 当细菌培养物生长到对数晚期时,我们就可获得很高产量的质粒 DNA。
② 通过离心收集细菌,用碱性溶液处理使得细菌细胞裂解,
释放出其中的质粒 DNA分子 。 在碱性条件下,宿主的线状染色体 DNA发生变性,但是闭环质粒 DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开,所以当条件恢复正常时,质粒 DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子 。
③ 通过离心去掉细胞碎片,染色体 DNA和其它杂质,并将水相的质粒 DNA分子用乙醇沉淀出来,最后溶于 TE缓冲液或纯水中备用 。
SDS法小量制备植物基因组 DNA的的原理在含有去污剂 SDS的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组 DNA，通过氯仿 /异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组 DNA分配在水相中。
然后用乙醇将水相的 DNA分子沉淀出来，最后溶于
TE缓冲液或纯水中备用。
1,剪取新鲜的植物叶片约 20mg,剪碎置于 1.5ml离心管中；
2,向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；
3,在液氮蒸发去 2/3时,用自制研杵迅速磨碎叶片；
4,立即加入 300uL 65℃ 预热的提取液摇匀,于 65℃ 水浴约 1hr，
其间摇动数次；
5,加等体积氯仿 /异戊醇 （ 24:1） 混匀,于 12000 rpm离心 5分；
6,转移上清液到另一干净 1.5ml离心管中,加入 2倍体积预冷的无水乙醇,混匀后静置 2min,14000rpm离心 5min；
7,倾去上清液并用 200uL预冷乙醇 （ 70%） 清洗 DNA沉淀,
14000rpm离心 5min；
8,用枪头小心吸去乙醇,自然风干 DNA后溶于 50uL ddH2O中,
置 -20℃ 保存备用 。
植物基因组 DNA的小量快速制备方案
DNA提取液的配方
Ingredient of the genomic DNA extracting solution
成 分
Ingredient
工作浓度
working concentration
Tris·Cl（ pH8.0） 100mM
EDTA（ pH8.0） 5mM
NaCl 500mM
SDS 1.25%
PVP 1%
DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
+
-
仪器电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；
药品
Agarose,loading buffer,TAE buffer、
EB（溴化乙锭）、
上样缓冲液（ 6X）配方
0.25% 溴酚蓝,0.25%二甲苯氰醇,40%蔗糖；水溶液 4℃ 保存。
第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应（ PCR）
第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术
Polymerase Chain Reaction（ PCR）
94
72
56
PCR 扩增过程中片段增殖的计算
PCR反应体系的确立
Water Buffer（ 10× ） Mg++（ 25mM） dNTPs（ 10mM） Primer1（ 10uM） Primer2（ 10uM） Taq（ 5U/uL） Templets
12.8 2 1.6 0.4 1 1 0.2 1
128 20 16 4 10 10 2 …
20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量
PCR扩增程序举例
Tem,94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃
Time 00:08:00 00:00:30 00:00:40 00:01:00 00:07:00
Cycles ―― 35 ――
PCR扩增结果分析举例
M 1 2 3 4 5 6 7 M
M,marker;1-2,PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4,PCR for 35S
Promoter; 5-6,PCR for lectin gene; 7,Negtive control.
第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术双脱氧末端终止法 DNA序列分析的原理在用 DNA聚合酶复制核苷酸链时,如果在反应物中加入一定量的某一种 2’,3’-双脱氧核苷酸,如 ddTTP,就会在应当掺入
dT的位置掺入 ddT。 由于 ddT核苷酸的 3’碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的 5’碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键,
所以 DNA链就不能继续向后延伸 。
Sanger据上述原理设计了 DNA测序的末端终止法 。 测序时要进行 4个独立的反应,每个反应中有一种 dNTP用 32P标记,并且在 4个反应中分别加入一定比例的 ddATP,ddTTP,ddGTP和
ddCTP。 这样反应一段时间后,每个反应中都会生成一系列由对应的那种 ddNTP结尾的长短不一的 DNA片段,而且这些片段的 5’端序列是相同的 。 最后,将反应物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,经放射自显影后就可以读出 DNA的碱基顺序 。
5’3’
5’
A G C T
ATCAGCGAAT
末端终止法 DNA序列的分析原理示意图第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术质粒 DNA的小量制备
① 将含有质粒 DNA的大肠杆菌接种到 LB培养基中 （ 含有相应抗生素 ）,在 37℃ 下震荡培养过夜,这样质粒 DNA便随着细菌的繁殖而得到了大量的扩增 。 当细菌培养物生长到对数晚期时,我们就可获得很高产量的质粒 DNA。
② 通过离心收集细菌,用碱性溶液处理使得细菌细胞裂解,
释放出其中的质粒 DNA分子 。 在碱性条件下,宿主的线状染色体 DNA发生变性,但是闭环质粒 DNA双链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开,所以当条件恢复正常时,质粒 DNA链迅速得到准确复位成为超螺旋分子 。
③ 通过离心去掉细胞碎片,染色体 DNA和其它杂质,并将水相的质粒 DNA分子用乙醇沉淀出来,最后溶于 TE缓冲液或纯水中备用 。
SDS法小量制备植物基因组 DNA的的原理在含有去污剂 SDS的溶液中，植物细胞会被裂解释放出细胞核中的基因组 DNA，通过氯仿 /异戊醇的抽提和离心去除掉裂解液中的细胞碎片、蛋白质以及其它杂质，这时的基因组 DNA分配在水相中。
然后用乙醇将水相的 DNA分子沉淀出来，最后溶于
TE缓冲液或纯水中备用。
1,剪取新鲜的植物叶片约 20mg,剪碎置于 1.5ml离心管中；
2,向离心管中缓慢加入液氮冷冻植物叶片；
3,在液氮蒸发去 2/3时,用自制研杵迅速磨碎叶片；
4,立即加入 300uL 65℃ 预热的提取液摇匀,于 65℃ 水浴约 1hr，
其间摇动数次；
5,加等体积氯仿 /异戊醇 （ 24:1） 混匀,于 12000 rpm离心 5分；
6,转移上清液到另一干净 1.5ml离心管中,加入 2倍体积预冷的无水乙醇,混匀后静置 2min,14000rpm离心 5min；
7,倾去上清液并用 200uL预冷乙醇 （ 70%） 清洗 DNA沉淀,
14000rpm离心 5min；
8,用枪头小心吸去乙醇,自然风干 DNA后溶于 50uL ddH2O中,
置 -20℃ 保存备用 。
植物基因组 DNA的小量快速制备方案
DNA提取液的配方
Ingredient of the genomic DNA extracting solution
成 分
Ingredient
工作浓度
working concentration
Tris·Cl（ pH8.0） 100mM
EDTA（ pH8.0） 5mM
NaCl 500mM
SDS 1.25%
PVP 1%
DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
+
-
仪器电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、移液枪；
药品
Agarose,loading buffer,TAE buffer、
EB（溴化乙锭）、
上样缓冲液（ 6X）配方
0.25% 溴酚蓝,0.25%二甲苯氰醇,40%蔗糖；水溶液 4℃ 保存。
第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应（ PCR）
第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术
Polymerase Chain Reaction（ PCR）
94
72
56
PCR 扩增过程中片段增殖的计算
PCR反应体系的确立
Water Buffer（ 10× ） Mg++（ 25mM） dNTPs（ 10mM） Primer1（ 10uM） Primer2（ 10uM） Taq（ 5U/uL） Templets
12.8 2 1.6 0.4 1 1 0.2 1
128 20 16 4 10 10 2 …
20uL反应体系中各成分的母液浓度及加入量
PCR扩增程序举例
Tem,94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃
Time 00:08:00 00:00:30 00:00:40 00:01:00 00:07:00
Cycles ―― 35 ――
PCR扩增结果分析举例
M 1 2 3 4 5 6 7 M
M,marker;1-2,PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4,PCR for 35S
Promoter; 5-6,PCR for lectin gene; 7,Negtive control.
第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术双脱氧末端终止法 DNA序列分析的原理在用 DNA聚合酶复制核苷酸链时,如果在反应物中加入一定量的某一种 2’,3’-双脱氧核苷酸,如 ddTTP,就会在应当掺入
dT的位置掺入 ddT。 由于 ddT核苷酸的 3’碳原子不含有羟基而不能和下一个核苷酸的 5’碳原子上的磷酸根结合形成磷酸二脂键,
所以 DNA链就不能继续向后延伸 。
Sanger据上述原理设计了 DNA测序的末端终止法 。 测序时要进行 4个独立的反应,每个反应中有一种 dNTP用 32P标记,并且在 4个反应中分别加入一定比例的 ddATP,ddTTP,ddGTP和
ddCTP。 这样反应一段时间后,每个反应中都会生成一系列由对应的那种 ddNTP结尾的长短不一的 DNA片段,而且这些片段的 5’端序列是相同的 。 最后,将反应物变性后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,经放射自显影后就可以读出 DNA的碱基顺序 。
5’3’
5’
A G C T
ATCAGCGAAT
末端终止法 DNA序列的分析原理示意图第六章 基因工程的基本技术第一节 DNA的分离和检测第二节 DNA聚合酶链式反应第三节 DNA的序列分析第四节 植物转基因技术
