基因工程原理牛颜冰
niuniugood@yahoo.com.cn
,基因工程原理,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
引 言基因克隆的本质 是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达,而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于,载体” 及其,寄主细胞” 来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性：
A,能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；
B,具有 1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；
C,具备多克隆位点（ MCS），而且可携带外源 DNA片段的长度范围较宽。
D,自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和
DNA的制备。
Characteristics of vectors for gene
cloning
MCS
Marker
Foreign gene
第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第一节 质粒载体
（ plasimid vectors）
1、质粒载体的生物学特性
2、质粒载体相关知识介绍
1.质粒载体的生物学特性
（ 1） 质粒 是 一种广泛从在于细菌细胞中 染色体以外 的能 自主的复制的裸露的 环状双链
DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。
1.质粒载体的生物学特性
（ 2） 质粒的大小 差异很大,最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大的达到
200kb。
（ 3） 质粒的生存 在寄主细胞中,友好,地,借居,,离开了寄主它本身无法复制,它可以赋予 寄主一些非染色体控制的遗传性状,以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。
1.质粒载体的生物学特性
（ 4） 质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的 拷贝数 。 据拷贝数将质粒分为两种复制型：,严紧型,质粒 （ stigent plasmid）,
拷贝数为 1-3；,松弛型,质粒 （ relaxed plasmid）,
拷贝数为 10-60。 不过,即使是同一质粒,其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化 。
（ 5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出 25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。
1.质粒载体的生物学特性
（ 6） 质粒的存在形式 有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，
双螺旋共价闭合环（超螺旋）
开环双螺旋
（一个裂口）
线状双螺旋
（两个裂口）
第一节 质粒载体
（ plasimid vectors）
1、质粒载体的生物学特性
2、质粒载体相关知识介绍质粒,是一种裸露的双链闭环 DNA分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，
质粒至少应该具备 复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点 等部分。
多克隆位点,克隆载体中的一段用于插入外源 DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。
选择标记基因,在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。
2,质粒载体相关知识介绍
Plasmids are double-stranded closed circular DNA molecules.
They are self-replicating and,therefore,propagate in the host
cell,They do not insert themselves into the host chromosome.
In order to be a useful vector in genetic engineering,a
plasmid must have an origin of replication,a dominant
selectable marker and one or (preferably) more cloning sites.
The origin of replication allows the plasmid to replicate
within an E,coli cell,Commercial vectors have origins of
replication that allow the plasmid to replicate even if the host
chromosomal replication and cell division is inhibited with
protein synthesis inhibitors such as chloramphenicol(氯霉素 ).
This allows a convenient way of increasing the plasmid copy
number per cell,a useful procedure if the plasmid is to be
extracted from the cell.
The selectable marker usually used is an antibiotic
resistance gene,This means that bacterial cells carrying the
plasmid will be resistant to an antibiotic incorporated into
the growth medium,Non-plasmid bearing cells will be killed
off,Common antibiotic resistance markers include ampicillin,
tetracycline,chloramphenicol and kanamycin,
In order to insert a fragment of DNA into a plasmid,it
must contain a recognition site for a restriction endonuclease,
To be useful,the site must only occur once in the vector
sequence,In most commercial vectors,this is achieved by use
of a polylinker,This is a length of DNA which is engineered
to have a series of restriction sites next to each other.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 1）?-互补 (alpha-complementation)
大肠杆菌?-半乳糖苷酶 可以和其底物 X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质,当该酶的?-片段 和?-片段 分开时就失去了这种显色的功能 。 通常将编码该酶
-片段 的 LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中,而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的?片段 。 这样一来,含有功能性完整的
LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时,载体编码的?-片段 就能和寄主编码的?片段 发生互补并具有了对底物 X-gal的作用功能 （ 发生显色反应 ）,这种现象被成为是 alpha-complementation.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 1） alpha-complementation(?-互补 )
The E,coli beta-galactosidase(?-半乳糖苷酶 ) can
interact with substrate X-Gal and release blue
substance,The LacZ gene encodes the alpha
fragment(?片段 ) of the enzyme was flanked by the
polylinker in some vectors and some host strain of E.
coli produce the omega fragment(?片段 )of the enzyme.
Transformation of the host with these vectors,which
coded alpha fragment,then allows production of a
functional beta-galactosidase,a phenomenon known as
alpha-complementation.
2,质粒载体相关知识介绍所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物 X-
Gal和诱导物 IPTG的平板上分辨出来 。 因为这类菌落中释放出的 蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色,
非常容易辨别 。
2,质粒载体相关知识介绍
Colonies containing plasmid can then be identified
by growth on plates containing X-Gal and an inducer of
the enzyme
IPTG,
Plasmid
containing
colonies
release the
chromophore
from the X-
Gal and are
coloured blue.
2,质粒载体相关知识介绍
However,Cloning of DNA inserts into one of the
unique sites in the polylinker can inactivates the lacZ
gene and leads
to colourless
colonies on X-
Gal/IPTG
plates,
allowing for
ready
detection of
colonies
carrying
cloned DNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 2） PBR322 This is one of the earliest general
purpose cloning vectors to be developed,It is a 4363 bp
plasmid with two antibiotic resistance genes,for
ampicillin and tetracycline,There are several unique
restriction sites,pBR322 generally does not give such a
high yield of plasmid DNA as modern vectors such as
pUC,pGEM and pBluescript
2,质粒载体相关知识介绍
pBR322
4363
连接加反应液
Tet or Amp Tet + Amp CK+
2,质粒载体相关知识介绍
（ 3） pUC
The pUC series of
small (2.7 kb)
plasmids contain
the origin of
replication and
ampicillin
resistance gene
from pBR322 and
the E,coli lacZ
gene:
2,质粒载体相关知识介绍
（ 4） pGEM-3Z pGEM-3Z contains the LacZ gene
and allows alpha complementation,The vector is 2.9 kb
in size,ampicillin selectable and can be grown to high
copy number,It also
has two bacteriophage
promoters,SP6 and T7
in flanking the
polylinker,This allows
transcription of inserts
to produce either sense
or antisense RNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 5） pBluescript SK pBluescript SK is similar to
the pGEM vectors except that it also carries an origin of
replication for a filamentous phage,f1,f1 uses a single
stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
can be used to
generate ssDNA,If a
host cell carrying
such a plasmid,
superinfection with
phage f1 leads to
production of phage
containing plasmid
DNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 6） pET pET vectors are designed to allow the
expression of cloned genes to proteins,pET-5 has a region
encoding an eleven amino acid stretch of protein before
EcoRI and BamHI restriction sites,Cloning into these sites
results in expression of
the cloned insert as a
fusion protein,Use of
NdeI enzyme in cutting
vector and insert allows
existed codon to be
replaced by the initiation
codon of the insert,
resulting in expression of
the insert with no fusion.
2,质粒载体相关知识介绍第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
1,?噬菌体的生物学特性
The? Phage
consist of a linear
chromosome
enclosed in a
protein coat
(capsid,衣壳 ).
When the phage
infecting the host
cells,it injects its
DNA into the
host bacterium.
1,?噬菌体的生物学特性噬菌体的生长周期可分为 溶菌周期 和 溶源周期 两种类型。 前者指 噬菌体将 DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在 溶源周期 中，注入寄主细胞的噬菌体 DNA
是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
只有溶菌生长周期的噬菌体被称为 烈性噬菌体 。
只有溶源周期的噬菌体被称为 温和噬菌体 。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为 溶源性细菌 。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体 DNA被称为 原噬菌体 。
1,?噬菌体的生物学特性
Lytic cycle (溶菌周期 )of growth,The
injected DNA in host
bacterium replicated
many times,phage
structural proteins are
expressed and the new
phage chromosomes are
packaged into phage
heads,New phages are
then released by lysis
(溶胞 )of the host cell.
1,?噬菌体的生物学特性
Lysogenic cycle ( 溶源周期 ),Under certain
circumstances,however,the lambda DNA inserts itself into the
E,coli chromosome and is a stable part of the chromosome,The
Lambda DNA is replicated along With the E.coli chromosome.
If the host
cell becomes
damaged,
such as UV
treatment,
the prophage
DNA excises
itself and
undergoes
lytic growth.
1,?噬菌体的生物学特性
DNA为线状双链 DNA分子,长度为 48502bp,在分子两端各有 12个碱基的单链互补粘性末端 。 当其注入到寄主细胞中后,可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形 DNA分子 。 上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为 cos位点 （ cohesive end site）,
DNA至少包括 61个基因,其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因,另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能 。
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
2,?噬菌体载体
（ 1） Insertion vectors
This kind of vectors can be used to clone inserts of
up to 10 kb in size,Lambda phage can not encapsidate
more than 105 % of its normal DNA size (48kb),so to
create extra room,several non-essential genes have
been removed from insertion vectors.
A common way of selecting for recombinant phage
is to use insertional inactivation of the cI gene results
in loss of the Lambda repressor protein,which switches
the life cycle to lysogeny rather than lysis,cI+ phage
produce many lysogens in appropriate host strains of
E,coli,and the resulting plaques are cloudy,cI- phage,
however,are lytic resulting in clear plaques.
（ 1） Insertion vectors
selecting recombinant phage via insertional
inactivation of the cI gene
cI+ cI-
Lysogenic
cycle
Lytic
cycle
clear
plaques
cloudy
plaques
（ 1） Insertion vectors
Lambda gt10
Lambda gt10 was designed for the cloning of
relatively short DNA fragments,especially cDNA.
The vector accepts EcoRI ended fragments up to
7.6 kb,Insertion of the DNA inactivates the lambda
repressor (gene i434) resulting in clear plaques,b527 is
a deletion of part of the Lambda genome,A,...,J are
structural genes.
（ 1） Insertion vectors
Lambda gt11
Lambda gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in
length in a unique EcoRI site near the end of the E,coli
LacZ gene,This allows production of fusion proteins
from the Lac promoter,Recombinant phage can then be
distinguished by detection of the product of the cloned
DNA using antibodies and also by detecting the
inactivation of the LacZ gene on plates containing X-
Gal/IPTG,nin5 is a deletion of the Lambda genome.
（ 1） Insertion vectors
Lambda ZAP
This vector was designed to construct cDNA libraries.
It can accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six
unique cloning sites.
Cloning in these sites results in insertional inactivation
of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates,It also
allows expression of the protein product under control of
the Lac promoter and detection by specific antibodies.
(续上一页 )
The vector contains the pBluescript plasmid,allowing
strand-specific transcription of insert DNA,A more
important feature,however,is that the pBluescript
plasmid insert is flanked on one side by the initiator
region of phage f1 promoter,and on the other side by the
terminator region of the f1 promoter,This means that
the pBluescript plasmid,complete with insert,can be
excised and packaged by superinfection(双重感染 ) with
phage f1,This can then be transferred to a suitable host
E,coli strain where the plasmid is maintained and can
be used for sequencing,This "automatic subcloning"
greatly speeds up the acquisition of a sequence from a
clone in a gene library.
（ 2） Replacement vectors
2,?噬菌体载体
（ 2） Replacement vectors
Another approach to the construction of vectors
from phage Lambda is to cut out a portion of the DNA
by virtue of （ 依靠 ） a pair of restriction sites,The 49
kb Lambda genome can lose 40 % of its content which
can be replaced by foreign DNA,This means that
inserts of up to 20-25 kb can be cloned,These vectors
are particularly useful for making gene libraries from
mammalian sources.
When such a vector is cut by a restriction
endonuclease,a "stuffer" fragment is removed,leaving
right and left arms,The stuffer is usually removed by
alcohol precipitation and the arms attached to a
foreign DNA insert prepared using the same restriction
endonuclease.
Lambda DNA has cohesive ends,These can attach
to each other to form the cos site of a concatomer.
This polymeric molecule can then be packaged
into phage using an in vitro packaging system,In
order to be packaged,the distance between the cos
sites must be greater than 40 kb and less than 52 kb.
续前一页
（ 2） Replacement vectors
EMBL 3 and 4
Lambda EMBL vectors are useful for cloning inserts
from 9 to 23 kb in length,Polylinkers are present either
side of the stuffer fragment,The order of the cloning
sites in the polylinker in EMBL 3 is reversed in EMBL 4.
Double digestion of the vector with,in the case of
EMBL 3,EcoRI and BamHI prevents the re-association
of the stuffer
fragment
(carrying EcoRI
ends) with the
arms (carrying
BamHI ends).
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
M13是线状的大肠杆菌噬菌体,颗粒内含有 6047个核苷酸的闭合环状单链 DNA基因组,其 单链的基因组
DNA经改造后可作为单链的 DNA载体 。
因为 M13单链 DNA的 复制型 （ RF,replicative form）
是 呈双链环形,此时的 DNA可以象质粒 DNA一样进行提取和体外操作 。 不论是双链还是单链的 M13 DNA均能感染寄主细胞 。 而且 M13的颗粒不受包装的限制,根据 DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小 。
M13噬菌体将 DNA正链注入寄主细胞后与单链 DNA
结合蛋白结合,随后以小 RNA链为引物合成负链而转变成 RF。
正链和负链出现不对称性积累,当 RF积累到 100-
200个拷贝后,噬菌体 DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成,但以负链为模板的正链合成并未受到影响 。 大量游离的正链 DNA很快参入到外壳蛋白中形成新了大量新的噬菌体颗粒 。
新组装的噬菌体颗粒 并不会发生溶菌现象,只是从寄主细胞中挤压出去 。 但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长,所以仍可产生 模糊的噬菌斑 。
在 M13基因组中由一段 507bp的基因间隔区,该区可以接受外源 DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力 。
这是该噬菌体能用于单链 DNA载体的重要前提 。
3,M13噬菌体的生物学特性
3,M13噬菌体的生物学特性
＋ －
SS RF 1-1′
RF RF 1-20′RF SS ～ 20′以上
The typical life cycle of M13
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
4,M13噬菌体载体后表现不稳定,在噬菌体增殖过程中容易发生缺失 。
所以 一般克隆的片段在 1kb
之内,克隆 300-400bp的片段十分稳定 。
载体中含有 LacZ基因及位于其中的多克隆位点,所以 能通过?互补在 X-Gal/
IPTG平板上 识别重组体 。
这类载体包括了 M13mp8、
9 和 M13mp18,19等 。
这类载体的 突出优点 在于其既可以提供单链 DNA，也可以提供双链的 DNA。其 最大的不足在于 插入大的 DNA片段第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有?DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,cosmid是
cos site carrying plasmid的缩写。
柯斯质粒的大小为 4-6kb，
由 3部分组成：
A.多克隆位点区
B,含有 cos位点的?DNA区
C,复制起始位点和抗性标记区
pHC79
Ori
Marker
MCS
cos
DNA
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的特点
1、具有?噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源 DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的 DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和 cos位点等构成，所以其克隆上限可达 45kb
左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到 30kb。
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的应用
噬菌体的位点特异切割体系 —— 末端酶（ terminase）体系要求两个 cos
位点间要保持 38-54kb的距离。
下面的操作中缺点是,cosmid自我重组、外源 DNA片段串联后重组。
Ori
Marker
MCS
cos
DNA
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的应用
1981年,Ish-Horowics
和 Burke设计了一种特殊的克隆方案，在所用的质粒上的 BamHI位点的两侧各有一个 EcoRI
位点包围着。这样在
BamHI位点克隆的 DNA片段可以用 EcoRI重新切割下来。
cos
HindIIIBamHI
Sal I
Sal IHindIII
磷酸化酶
Sal I BamHI BamHIHindIII
BamHI BamHI
Sal I HindIII
Sau 3A
磷酸 化酶
32-47 kb
第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
小 结第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞
niuniugood@yahoo.com.cn
,基因工程原理,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
引 言基因克隆的本质 是使目的基因在特定的条件下得到 扩增和表达,而目的基因本身无法进行复制，所以就必须借助于,载体” 及其,寄主细胞” 来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性：
A,能在寄主细胞中进行独立的复制和表达；
B,具有 1-2个选择标记基因，如对抗生素的抗性基因等；
C,具备多克隆位点（ MCS），而且可携带外源 DNA片段的长度范围较宽。
D,自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和
DNA的制备。
Characteristics of vectors for gene
cloning
MCS
Marker
Foreign gene
第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第一节 质粒载体
（ plasimid vectors）
1、质粒载体的生物学特性
2、质粒载体相关知识介绍
1.质粒载体的生物学特性
（ 1） 质粒 是 一种广泛从在于细菌细胞中 染色体以外 的能 自主的复制的裸露的 环状双链
DNA分子，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。
1.质粒载体的生物学特性
（ 2） 质粒的大小 差异很大,最小的只有 1kb,只能编码中等大小的 2-3种蛋白质分子，最大的达到
200kb。
（ 3） 质粒的生存 在寄主细胞中,友好,地,借居,,离开了寄主它本身无法复制,它可以赋予 寄主一些非染色体控制的遗传性状,以利于寄主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属的抗性等。
1.质粒载体的生物学特性
（ 4） 质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的 拷贝数 。 据拷贝数将质粒分为两种复制型：,严紧型,质粒 （ stigent plasmid）,
拷贝数为 1-3；,松弛型,质粒 （ relaxed plasmid）,
拷贝数为 10-60。 不过,即使是同一质粒,其拷贝数在不同的寄主细胞间也可能有很大的变化 。
（ 5） 质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出 25个以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。
1.质粒载体的生物学特性
（ 6） 质粒的存在形式 有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种，
双螺旋共价闭合环（超螺旋）
开环双螺旋
（一个裂口）
线状双螺旋
（两个裂口）
第一节 质粒载体
（ plasimid vectors）
1、质粒载体的生物学特性
2、质粒载体相关知识介绍质粒,是一种裸露的双链闭环 DNA分子，它们在寄主细胞中能够独立地自我复制从而得到不断的繁殖。作为基因工程载体，
质粒至少应该具备 复制的起始区、选择标记基因区、多克隆位点 等部分。
多克隆位点,克隆载体中的一段用于插入外源 DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点应该在整个载体中是唯一的。
选择标记基因,在基因工程中的一类用于选择转化细胞（菌）的抗性基因，通常是一些抗生素抗性基因，比如对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素以及潮霉素等具有抗性的基因。这样，通过在培养基中加入特定的抗生素就可以选自得到转化的细胞（菌）。
2,质粒载体相关知识介绍
Plasmids are double-stranded closed circular DNA molecules.
They are self-replicating and,therefore,propagate in the host
cell,They do not insert themselves into the host chromosome.
In order to be a useful vector in genetic engineering,a
plasmid must have an origin of replication,a dominant
selectable marker and one or (preferably) more cloning sites.
The origin of replication allows the plasmid to replicate
within an E,coli cell,Commercial vectors have origins of
replication that allow the plasmid to replicate even if the host
chromosomal replication and cell division is inhibited with
protein synthesis inhibitors such as chloramphenicol(氯霉素 ).
This allows a convenient way of increasing the plasmid copy
number per cell,a useful procedure if the plasmid is to be
extracted from the cell.
The selectable marker usually used is an antibiotic
resistance gene,This means that bacterial cells carrying the
plasmid will be resistant to an antibiotic incorporated into
the growth medium,Non-plasmid bearing cells will be killed
off,Common antibiotic resistance markers include ampicillin,
tetracycline,chloramphenicol and kanamycin,
In order to insert a fragment of DNA into a plasmid,it
must contain a recognition site for a restriction endonuclease,
To be useful,the site must only occur once in the vector
sequence,In most commercial vectors,this is achieved by use
of a polylinker,This is a length of DNA which is engineered
to have a series of restriction sites next to each other.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 1）?-互补 (alpha-complementation)
大肠杆菌?-半乳糖苷酶 可以和其底物 X-Gal 相互作用并且释放出一种蓝色物质,当该酶的?-片段 和?-片段 分开时就失去了这种显色的功能 。 通常将编码该酶
-片段 的 LacZ 基因插入到载体的多克隆位点的侧翼序列中,而在一些人工构建的大肠杆菌株系中却只能编码产生该酶的?片段 。 这样一来,含有功能性完整的
LacZ 基因的载体导入到这类寄主细胞中时,载体编码的?-片段 就能和寄主编码的?片段 发生互补并具有了对底物 X-gal的作用功能 （ 发生显色反应 ）,这种现象被成为是 alpha-complementation.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 1） alpha-complementation(?-互补 )
The E,coli beta-galactosidase(?-半乳糖苷酶 ) can
interact with substrate X-Gal and release blue
substance,The LacZ gene encodes the alpha
fragment(?片段 ) of the enzyme was flanked by the
polylinker in some vectors and some host strain of E.
coli produce the omega fragment(?片段 )of the enzyme.
Transformation of the host with these vectors,which
coded alpha fragment,then allows production of a
functional beta-galactosidase,a phenomenon known as
alpha-complementation.
2,质粒载体相关知识介绍所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物 X-
Gal和诱导物 IPTG的平板上分辨出来 。 因为这类菌落中释放出的 蓝色物质可以将整个菌落染成蓝色,
非常容易辨别 。
2,质粒载体相关知识介绍
Colonies containing plasmid can then be identified
by growth on plates containing X-Gal and an inducer of
the enzyme
IPTG,
Plasmid
containing
colonies
release the
chromophore
from the X-
Gal and are
coloured blue.
2,质粒载体相关知识介绍
However,Cloning of DNA inserts into one of the
unique sites in the polylinker can inactivates the lacZ
gene and leads
to colourless
colonies on X-
Gal/IPTG
plates,
allowing for
ready
detection of
colonies
carrying
cloned DNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 2） PBR322 This is one of the earliest general
purpose cloning vectors to be developed,It is a 4363 bp
plasmid with two antibiotic resistance genes,for
ampicillin and tetracycline,There are several unique
restriction sites,pBR322 generally does not give such a
high yield of plasmid DNA as modern vectors such as
pUC,pGEM and pBluescript
2,质粒载体相关知识介绍
pBR322
4363
连接加反应液
Tet or Amp Tet + Amp CK+
2,质粒载体相关知识介绍
（ 3） pUC
The pUC series of
small (2.7 kb)
plasmids contain
the origin of
replication and
ampicillin
resistance gene
from pBR322 and
the E,coli lacZ
gene:
2,质粒载体相关知识介绍
（ 4） pGEM-3Z pGEM-3Z contains the LacZ gene
and allows alpha complementation,The vector is 2.9 kb
in size,ampicillin selectable and can be grown to high
copy number,It also
has two bacteriophage
promoters,SP6 and T7
in flanking the
polylinker,This allows
transcription of inserts
to produce either sense
or antisense RNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 5） pBluescript SK pBluescript SK is similar to
the pGEM vectors except that it also carries an origin of
replication for a filamentous phage,f1,f1 uses a single
stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
can be used to
generate ssDNA,If a
host cell carrying
such a plasmid,
superinfection with
phage f1 leads to
production of phage
containing plasmid
DNA.
2,质粒载体相关知识介绍
（ 6） pET pET vectors are designed to allow the
expression of cloned genes to proteins,pET-5 has a region
encoding an eleven amino acid stretch of protein before
EcoRI and BamHI restriction sites,Cloning into these sites
results in expression of
the cloned insert as a
fusion protein,Use of
NdeI enzyme in cutting
vector and insert allows
existed codon to be
replaced by the initiation
codon of the insert,
resulting in expression of
the insert with no fusion.
2,质粒载体相关知识介绍第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
1,?噬菌体的生物学特性
The? Phage
consist of a linear
chromosome
enclosed in a
protein coat
(capsid,衣壳 ).
When the phage
infecting the host
cells,it injects its
DNA into the
host bacterium.
1,?噬菌体的生物学特性噬菌体的生长周期可分为 溶菌周期 和 溶源周期 两种类型。 前者指 噬菌体将 DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。在 溶源周期 中，注入寄主细胞的噬菌体 DNA
是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
只有溶菌生长周期的噬菌体被称为 烈性噬菌体 。
只有溶源周期的噬菌体被称为 温和噬菌体 。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为 溶源性细菌 。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体 DNA被称为 原噬菌体 。
1,?噬菌体的生物学特性
Lytic cycle (溶菌周期 )of growth,The
injected DNA in host
bacterium replicated
many times,phage
structural proteins are
expressed and the new
phage chromosomes are
packaged into phage
heads,New phages are
then released by lysis
(溶胞 )of the host cell.
1,?噬菌体的生物学特性
Lysogenic cycle ( 溶源周期 ),Under certain
circumstances,however,the lambda DNA inserts itself into the
E,coli chromosome and is a stable part of the chromosome,The
Lambda DNA is replicated along With the E.coli chromosome.
If the host
cell becomes
damaged,
such as UV
treatment,
the prophage
DNA excises
itself and
undergoes
lytic growth.
1,?噬菌体的生物学特性
DNA为线状双链 DNA分子,长度为 48502bp,在分子两端各有 12个碱基的单链互补粘性末端 。 当其注入到寄主细胞中后,可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形 DNA分子 。 上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为 cos位点 （ cohesive end site）,
DNA至少包括 61个基因,其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因,另一部分可以被外源基因取代而不会影响到噬菌体的正常功能 。
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
2,?噬菌体载体
（ 1） Insertion vectors
This kind of vectors can be used to clone inserts of
up to 10 kb in size,Lambda phage can not encapsidate
more than 105 % of its normal DNA size (48kb),so to
create extra room,several non-essential genes have
been removed from insertion vectors.
A common way of selecting for recombinant phage
is to use insertional inactivation of the cI gene results
in loss of the Lambda repressor protein,which switches
the life cycle to lysogeny rather than lysis,cI+ phage
produce many lysogens in appropriate host strains of
E,coli,and the resulting plaques are cloudy,cI- phage,
however,are lytic resulting in clear plaques.
（ 1） Insertion vectors
selecting recombinant phage via insertional
inactivation of the cI gene
cI+ cI-
Lysogenic
cycle
Lytic
cycle
clear
plaques
cloudy
plaques
（ 1） Insertion vectors
Lambda gt10
Lambda gt10 was designed for the cloning of
relatively short DNA fragments,especially cDNA.
The vector accepts EcoRI ended fragments up to
7.6 kb,Insertion of the DNA inactivates the lambda
repressor (gene i434) resulting in clear plaques,b527 is
a deletion of part of the Lambda genome,A,...,J are
structural genes.
（ 1） Insertion vectors
Lambda gt11
Lambda gt11 can accept fragments up to 7.2 kb in
length in a unique EcoRI site near the end of the E,coli
LacZ gene,This allows production of fusion proteins
from the Lac promoter,Recombinant phage can then be
distinguished by detection of the product of the cloned
DNA using antibodies and also by detecting the
inactivation of the LacZ gene on plates containing X-
Gal/IPTG,nin5 is a deletion of the Lambda genome.
（ 1） Insertion vectors
Lambda ZAP
This vector was designed to construct cDNA libraries.
It can accept up to 10 kb of foreign DNA in one of six
unique cloning sites.
Cloning in these sites results in insertional inactivation
of LacZ allowing detection on X-Gal/IPTG plates,It also
allows expression of the protein product under control of
the Lac promoter and detection by specific antibodies.
(续上一页 )
The vector contains the pBluescript plasmid,allowing
strand-specific transcription of insert DNA,A more
important feature,however,is that the pBluescript
plasmid insert is flanked on one side by the initiator
region of phage f1 promoter,and on the other side by the
terminator region of the f1 promoter,This means that
the pBluescript plasmid,complete with insert,can be
excised and packaged by superinfection(双重感染 ) with
phage f1,This can then be transferred to a suitable host
E,coli strain where the plasmid is maintained and can
be used for sequencing,This "automatic subcloning"
greatly speeds up the acquisition of a sequence from a
clone in a gene library.
（ 2） Replacement vectors
2,?噬菌体载体
（ 2） Replacement vectors
Another approach to the construction of vectors
from phage Lambda is to cut out a portion of the DNA
by virtue of （ 依靠 ） a pair of restriction sites,The 49
kb Lambda genome can lose 40 % of its content which
can be replaced by foreign DNA,This means that
inserts of up to 20-25 kb can be cloned,These vectors
are particularly useful for making gene libraries from
mammalian sources.
When such a vector is cut by a restriction
endonuclease,a "stuffer" fragment is removed,leaving
right and left arms,The stuffer is usually removed by
alcohol precipitation and the arms attached to a
foreign DNA insert prepared using the same restriction
endonuclease.
Lambda DNA has cohesive ends,These can attach
to each other to form the cos site of a concatomer.
This polymeric molecule can then be packaged
into phage using an in vitro packaging system,In
order to be packaged,the distance between the cos
sites must be greater than 40 kb and less than 52 kb.
续前一页
（ 2） Replacement vectors
EMBL 3 and 4
Lambda EMBL vectors are useful for cloning inserts
from 9 to 23 kb in length,Polylinkers are present either
side of the stuffer fragment,The order of the cloning
sites in the polylinker in EMBL 3 is reversed in EMBL 4.
Double digestion of the vector with,in the case of
EMBL 3,EcoRI and BamHI prevents the re-association
of the stuffer
fragment
(carrying EcoRI
ends) with the
arms (carrying
BamHI ends).
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
M13是线状的大肠杆菌噬菌体,颗粒内含有 6047个核苷酸的闭合环状单链 DNA基因组,其 单链的基因组
DNA经改造后可作为单链的 DNA载体 。
因为 M13单链 DNA的 复制型 （ RF,replicative form）
是 呈双链环形,此时的 DNA可以象质粒 DNA一样进行提取和体外操作 。 不论是双链还是单链的 M13 DNA均能感染寄主细胞 。 而且 M13的颗粒不受包装的限制,根据 DNA的多寡其噬菌体的颗粒可大可小 。
M13噬菌体将 DNA正链注入寄主细胞后与单链 DNA
结合蛋白结合,随后以小 RNA链为引物合成负链而转变成 RF。
正链和负链出现不对称性积累,当 RF积累到 100-
200个拷贝后,噬菌体 DNA编码的正链特异结合蛋白很快就阻止了负链的进一步生成,但以负链为模板的正链合成并未受到影响 。 大量游离的正链 DNA很快参入到外壳蛋白中形成新了大量新的噬菌体颗粒 。
新组装的噬菌体颗粒 并不会发生溶菌现象,只是从寄主细胞中挤压出去 。 但噬菌体的大量繁殖也干扰了寄主细菌的正常生长,所以仍可产生 模糊的噬菌斑 。
在 M13基因组中由一段 507bp的基因间隔区,该区可以接受外源 DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力 。
这是该噬菌体能用于单链 DNA载体的重要前提 。
3,M13噬菌体的生物学特性
3,M13噬菌体的生物学特性
＋ －
SS RF 1-1′
RF RF 1-20′RF SS ～ 20′以上
The typical life cycle of M13
第二节 噬菌体载体
（ phage vectors）
1,?噬菌体的生物学特性
2,?噬菌体载体
3,M13噬菌体的生物学特性
4,M13噬菌体载体
4,M13噬菌体载体后表现不稳定,在噬菌体增殖过程中容易发生缺失 。
所以 一般克隆的片段在 1kb
之内,克隆 300-400bp的片段十分稳定 。
载体中含有 LacZ基因及位于其中的多克隆位点,所以 能通过?互补在 X-Gal/
IPTG平板上 识别重组体 。
这类载体包括了 M13mp8、
9 和 M13mp18,19等 。
这类载体的 突出优点 在于其既可以提供单链 DNA，也可以提供双链的 DNA。其 最大的不足在于 插入大的 DNA片段第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的特点柯斯质粒是一类人工构建的含有?DNA的 cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,cosmid是
cos site carrying plasmid的缩写。
柯斯质粒的大小为 4-6kb，
由 3部分组成：
A.多克隆位点区
B,含有 cos位点的?DNA区
C,复制起始位点和抗性标记区
pHC79
Ori
Marker
MCS
cos
DNA
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的特点
1、具有?噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源 DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的 DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和 cos位点等构成，所以其克隆上限可达 45kb
左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到 30kb。
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的应用
噬菌体的位点特异切割体系 —— 末端酶（ terminase）体系要求两个 cos
位点间要保持 38-54kb的距离。
下面的操作中缺点是,cosmid自我重组、外源 DNA片段串联后重组。
Ori
Marker
MCS
cos
DNA
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
柯斯质粒载体的应用
1981年,Ish-Horowics
和 Burke设计了一种特殊的克隆方案，在所用的质粒上的 BamHI位点的两侧各有一个 EcoRI
位点包围着。这样在
BamHI位点克隆的 DNA片段可以用 EcoRI重新切割下来。
cos
HindIIIBamHI
Sal I
Sal IHindIII
磷酸化酶
Sal I BamHI BamHIHindIII
BamHI BamHI
Sal I HindIII
Sau 3A
磷酸 化酶
32-47 kb
第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
小 结第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第三章 基因克隆的载体引 言（ introduction）
第一节 质粒载体（ plasimid vectors）
第二节 噬菌体载体（ phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（ cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（ B/Y/HAC）
基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞
