,基因工程概论,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
1、基因表达的基本过程
1、基因表达的基本过程基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。
首先，目的基因通过转录 (transcription)形成 mRNA（信使
RNA,messenger RNA )；
然后,tRNA （ 转运
RNA,transfer RNA） 将各种氨基酸运送到核糖体并按照 mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列
(translation) 最终得到基因的表达产物 （ 蛋白质 ） 。
第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
Transcription(转录 ),making an RNA copy of a DNA sequence,
RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed,
Only one strand of DNA (the template strand,antisense strand)
is transcribed.
转录的具体过程转录的具体过程
Antisense strand
有效转录的基本条件
Groups of genes coding for related proteins are arranged in units
known as operons,An operon consists of an operator,promoter,
regulator,and structural genes,The regulator gene codes for a
repressor protein that binds to the operator,obstructing the
promoter of the structural genes,The regulator does not have to be
adjacent to other genes in the operon,If the repressor protein is
removed,transcription may occur.
半乳糖苷酶 渗透酶 转乙酰基酶
Operons are either
inducible or
repressible according
to the control
mechanism,Seventy-
five different operons
controlling 250
structural genes have
been identified for E.
coli,Both repression
and induction are
examples of negative
control since the
repressor proteins
turn off transcription.
启动子（ promoter）,在基因序列中，标志着转录起始的可被 RNA聚合酶识别的位点 (DNA区段 )，一般位于基因的上游。
终止子（ terminator）,位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的 RNA聚合酶识别位点。
有效转录的基本条件
Prokaryotic gene regulation differs from eukaryotic
regulation,but since prokaryotes are much easier to
work with,we focus on prokaryotes at this point.
Promoters are sequences of DNA that are the start
signals for the transcription of mRNA,Terminators
are the stop signals,mRNA molecules are long (500-
10,000 nucleotides).
第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
The Genetic Code
To code for the 20 essential amino acids a genetic code must
consist of at least a 3-base set (triplet) of the 4 bases,If one
considers the possibilities of arranging four things 3 at a time
(4X4X4),we get 64 possible code words,or codons (a 3-base
sequence on the mRNA that codes for either a specific amino acid
or a control word),The genetic code was broken by Marshall
Nirenberg and Heinrich Matthaei,a decade after Watson and
Crick's work,The genetic code consists of 61 amino-acid coding
codons and three termination codons,which stop the process of
translation,The genetic code is thus redundant (degenerate in the
sense of having multiple states amounting to the same thing),
with,for example,glycine coded for by GGU,GGC,GGA,and
GGG codons.
正确翻译的基本条件
The genetic code
Messenger RNA (mRNA) is the blueprint for construction of
a protein,Transfer RNA (tRNA) is the truck delivering the
proper amino acid to the site at the right time,tRNA will form a
"cloverleaf" structure due to complementary base pairing,At the
top of the large loop are three bases,the anticodon,which is the
complement of the codon,There are 61 different tRNAs,each
having a different binding site for the amino acid and a different
anticodon.
Ribosomes are the organelle (in all cells) where proteins
are synthesized,They consist of two-thirds rRNA and
one-third protein,Ribosomes consist of a small (in E.
coli,30S) and larger (50S) subunits,The length of rRNA
differs in each,The 30S unit
has 16S rRNA and 21
different proteins,The 50S
subunit consists of 5S and
23S rRNA and 34 different
proteins,The smaller
subunit has a binding site
for the mRNA,The larger
subunit has two binding
sites for tRNA
Translation is the process of converting the mRNA codon
sequences into an amino acid sequence,The initiator codon (AUG)
codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met),No
translation occurs without the AUG codon,f-Met is always the
first amino acid in a polypeptide chain,although frequently it is
removed after translation,The intitator tRNA/mRNA/small
ribosomal unit is called the initiation complex,The larger subunit
attaches to the initiation complex,After the initiation phase the
message gets longer during the elongation phase.
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the
ribosome/mRNA complex,forming a peptide bond between the
amino acids,The complex then shifts along the mRNA to the next
triplet,opening the A site,The new tRNA enters at the A site.
When the codon in the A site is a termination codon,a releasing
factor binds to the site,stopping translation and releasing the
ribosomal complex and mRNA,Often many ribosomes will read
the same message,a structure known as a polysome forms,In this
way a cell may rapidly make many proteins.
正确翻译的基本条件
1、具备起始密码子
2、具备终止密码子
3、具有正确的阅读框基因表达的基本过程第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
4、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度,DNA的转录其始序列、
密码子的选择,mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。
a,启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即 -10区 (位于转录其始位点上游 5-10bp，故称为 -10区，序列为 5’--
TTGACA)和 -35区 (位于转录起始位点上游 25bp处，一般有 10bp组成，故称为 -35区,5’--TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于 17bp，启动子的活性就越强。
b,翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的 mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子 AUG和其上游的 SD序列。所谓 SD序列 就是由 Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般 SD序列的长度约为 3-9bp，位于起始密码子上游 3-11碱基的位置，它与 16S核糖体
RNA的 3‘端互补，控制了翻译的起始。
５’ --AGGAGGUXXXAUG--- mRNA
３’ AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
c,启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。
Promoter SD ATG Gene TerminatorTAA
mRNA
第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第二节 原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子一、原核表达真核基因的困难
1,细菌的 RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；
2,真核基因转录的 mRNA缺乏 SD序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；
3,真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以 mRNA
中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的
RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；
4,表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。
二、构建原核表达载体的策略
1,将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和 SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。
2,采用真核基因的 cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有 RNA剪接功能的问题。
3,构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。
三、常用于原核表达的启动子
1,Lac启动子 是 β-半乳糖苷酶编码基因 LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被 IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
2,Trp启动子 是编码参与色氨酸生物合成的几种酶的基因簇的上游调控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被 β-
吲哚丙烯酸（ β- IAA）诱导。
3,Tac启动子 是一种由 Lac和 Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被 IPTG诱导表达。
4,λPL启动子 是负责 λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。
第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化真核基因表达的特点
1,一条成熟的 mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；
2,基因转录调节区很大,而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基,它们并不直接影响 RNA聚合酶与启动子区的结合,而是通过改变基因 5’上游区
DNA的构型来影响 RNA聚合酶与启动子区的结合；
3,mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；
4,基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
真核基因转录起始位点上游序列的特点特点起始位点上游调控区其它调控区原核生物嘌呤和嘧啶都能起始转录范围小,-10区,-30
到 -70区为正调控区，
+10到 -20区为负调控区；
有 TTGACA区 (-30~
-40）参与调控。
真核生物有“帽子”结构专一性
（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（ A为主）才能起始转录范围大,TATAA/TA区位于
-20到 -30,-40到 -110区为上游激活区；
除了有对应的 CAAT区外，
还有 GC区和增强子。
基因转录起始位点上游序列的比较
TTGACA TATAAT Pu>Py
-35区
-30-70 正调控区 -20 负调控区 +1
-10区
GC区 ….CAAT 区
TATAAA
T PuAPy
-40-110 +1-20-30
增强子
CCGCCC或 GGGCGG或 GGCCAATCT
T A
原核真核第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化驱动转基因表达的启动子类型天然诱导型启动子组织特异性表达 诱导型表达化学诱导型调控体系组织特异型启动子组成型表达花椰采花叶病毒
(CaMV)
35S启动子水稻肌动蛋白 1
(actin 1)
act1启动子表达组织 启动子来源 目的植物 作者花药 烟草 Ta29 烟草 油菜 Mariani （ 1990）
种子 菜豆植物凝集素基因 PHA-L tobacco Altabella （ 1990）
叶片 PEPC （ Pepcarboxylase Gene of Maize） maize Kozial （ 1993）
韧皮部 水稻蔗糖合酶基因 RSs1 tobacco Shi （ 1994）
果实 ovary tissue （ patent） tomato Martineau （ 1995）
胚乳 玉米淀粉合酶基因 GBS maize Russell （ 1997）
根系 发根农杆菌的 rolD启动子 番茄 Varvara （ 2001）
髓部 玉米 pGL2 rice Datta （ 1998）
部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子
RSuS1启动子的组织特异性表达
35S-GusRSP1/2-Gus
化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。
作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，
化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二，对环境友好，且造价不高；第三，诱导效率要高，其工作浓度低且不是常用的化学物质；第四，方便于喷洒或蘸根处理。
化学诱导型表达调控系统的原理用于转基因表达诱导物的分子式
Molecules used for the chemical induction of
transgene expression in plants.
Tetracycline Dexamethasone
Ethanol RH-5992
化学诱导型表达调控系统的原理一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为 35S启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；
第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的 35S
启动子）和目的基因串联而成。
A去抑制型 B失活型第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病,
该病在法国,东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生 。 1907年
Smith和 Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。
农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化
1974年 Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒 （ 大于 200kb）,称为 Ti
质粒 。
1977年 Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时,用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌 Ti质粒的一个片段,称为 T-DNA（ Transfer-
DNA） 。 实验表明,T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达,从而导致了冠瘿瘤的发生 。 进一步研究发现,整合到植物基因组中的 T-
DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代,Ti
质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础 。
Ti质粒 为根癌农杆菌核外的一种环状双链 DNA
分子,长约 200Kb。 其中含有一段称为 T-DNA的可转移区段,当农杆菌侵染寄主细胞后,T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中 。 Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础 。
T-DNA的长约 23Kb,在其两端各有一个 25bp
左右的正向重复序列,称之为 T-DNA的边界序列 。
在不同的农杆菌 Ti质粒上该序列高度保守,一般认为右端重复序列对 T-DNA的转移起决定性作用 。
农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化农杆菌介导的植物遗传转化分子机理示意图影响农杆菌介导法水稻转基因的因素共培养的条件（温度、激素和时间等）
植物愈伤组织的生理状态受体作物的基因型用于转化的受体组织农杆菌的活化状态农杆菌的菌种类型愈伤组织诱导和植株再生的效率转基因载体的类型农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略生理状态来源（盾片）
植物愈伤组织的诱导农杆菌的活化愈伤组织 农杆菌的共培养抗性愈伤组织获得及植株再生菌 种活化状态培养基成分缩短组培时间提高再生频率
2N6诱导愈伤 7-10d
N6 -BA 预培养 2-3d
种子优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系
AB-AS 诱导 12h
AB培养基活化 12h
YEP平板单菌落液体 MS浸泡 15min
无生长素 N6-AS共培养 3d N6-H选择培养 20d
抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d
62d~70d
1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程
4
植株再生第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素第二节 原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
1、基因表达的基本过程
1、基因表达的基本过程基因的表达主要涉及到两个过程：转录和翻译。
首先，目的基因通过转录 (transcription)形成 mRNA（信使
RNA,messenger RNA )；
然后,tRNA （ 转运
RNA,transfer RNA） 将各种氨基酸运送到核糖体并按照 mRNA的密码子顺序将各种氨基酸连接成特定的氨基酸序列
(translation) 最终得到基因的表达产物 （ 蛋白质 ） 。
第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
Transcription(转录 ),making an RNA copy of a DNA sequence,
RNA polymerase opens the part of the DNA to be transcribed,
Only one strand of DNA (the template strand,antisense strand)
is transcribed.
转录的具体过程转录的具体过程
Antisense strand
有效转录的基本条件
Groups of genes coding for related proteins are arranged in units
known as operons,An operon consists of an operator,promoter,
regulator,and structural genes,The regulator gene codes for a
repressor protein that binds to the operator,obstructing the
promoter of the structural genes,The regulator does not have to be
adjacent to other genes in the operon,If the repressor protein is
removed,transcription may occur.
半乳糖苷酶 渗透酶 转乙酰基酶
Operons are either
inducible or
repressible according
to the control
mechanism,Seventy-
five different operons
controlling 250
structural genes have
been identified for E.
coli,Both repression
and induction are
examples of negative
control since the
repressor proteins
turn off transcription.
启动子（ promoter）,在基因序列中，标志着转录起始的可被 RNA聚合酶识别的位点 (DNA区段 )，一般位于基因的上游。
终止子（ terminator）,位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的 RNA聚合酶识别位点。
有效转录的基本条件
Prokaryotic gene regulation differs from eukaryotic
regulation,but since prokaryotes are much easier to
work with,we focus on prokaryotes at this point.
Promoters are sequences of DNA that are the start
signals for the transcription of mRNA,Terminators
are the stop signals,mRNA molecules are long (500-
10,000 nucleotides).
第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
The Genetic Code
To code for the 20 essential amino acids a genetic code must
consist of at least a 3-base set (triplet) of the 4 bases,If one
considers the possibilities of arranging four things 3 at a time
(4X4X4),we get 64 possible code words,or codons (a 3-base
sequence on the mRNA that codes for either a specific amino acid
or a control word),The genetic code was broken by Marshall
Nirenberg and Heinrich Matthaei,a decade after Watson and
Crick's work,The genetic code consists of 61 amino-acid coding
codons and three termination codons,which stop the process of
translation,The genetic code is thus redundant (degenerate in the
sense of having multiple states amounting to the same thing),
with,for example,glycine coded for by GGU,GGC,GGA,and
GGG codons.
正确翻译的基本条件
The genetic code
Messenger RNA (mRNA) is the blueprint for construction of
a protein,Transfer RNA (tRNA) is the truck delivering the
proper amino acid to the site at the right time,tRNA will form a
"cloverleaf" structure due to complementary base pairing,At the
top of the large loop are three bases,the anticodon,which is the
complement of the codon,There are 61 different tRNAs,each
having a different binding site for the amino acid and a different
anticodon.
Ribosomes are the organelle (in all cells) where proteins
are synthesized,They consist of two-thirds rRNA and
one-third protein,Ribosomes consist of a small (in E.
coli,30S) and larger (50S) subunits,The length of rRNA
differs in each,The 30S unit
has 16S rRNA and 21
different proteins,The 50S
subunit consists of 5S and
23S rRNA and 34 different
proteins,The smaller
subunit has a binding site
for the mRNA,The larger
subunit has two binding
sites for tRNA
Translation is the process of converting the mRNA codon
sequences into an amino acid sequence,The initiator codon (AUG)
codes for the amino acid N-formylmethionine (f-Met),No
translation occurs without the AUG codon,f-Met is always the
first amino acid in a polypeptide chain,although frequently it is
removed after translation,The intitator tRNA/mRNA/small
ribosomal unit is called the initiation complex,The larger subunit
attaches to the initiation complex,After the initiation phase the
message gets longer during the elongation phase.
New tRNAs bring their amino acids to the open binding site on the
ribosome/mRNA complex,forming a peptide bond between the
amino acids,The complex then shifts along the mRNA to the next
triplet,opening the A site,The new tRNA enters at the A site.
When the codon in the A site is a termination codon,a releasing
factor binds to the site,stopping translation and releasing the
ribosomal complex and mRNA,Often many ribosomes will read
the same message,a structure known as a polysome forms,In this
way a cell may rapidly make many proteins.
正确翻译的基本条件
1、具备起始密码子
2、具备终止密码子
3、具有正确的阅读框基因表达的基本过程第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素
4、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度,DNA的转录其始序列、
密码子的选择,mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。
a,启动子的结构对表达效率的影响大多数大肠杆菌启动子都含有两种保守区,即 -10区 (位于转录其始位点上游 5-10bp，故称为 -10区，序列为 5’--
TTGACA)和 -35区 (位于转录起始位点上游 25bp处，一般有 10bp组成，故称为 -35区,5’--TATAAT)。当然，实际的启动子中很少具备与上述序列完全一致的区域，但是研究表明，启动子的这两个区域与上述保守序列的相似程度越高，该启动子的表达能力也就越强。另外，这两个保守区间的距离也是影响启动子强度的重要因素，即这个间距越是接近于 17bp，启动子的活性就越强。
b,翻译起始序列对表达效率的影响
mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的 mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子 AUG和其上游的 SD序列。所谓 SD序列 就是由 Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般 SD序列的长度约为 3-9bp，位于起始密码子上游 3-11碱基的位置，它与 16S核糖体
RNA的 3‘端互补，控制了翻译的起始。
５’ --AGGAGGUXXXAUG--- mRNA
３’ AUUCCUCCACUAG----- 16S rRNA3’ 末端
c,启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这仪因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。
Promoter SD ATG Gene TerminatorTAA
mRNA
第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第二节 原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子一、原核表达真核基因的困难
1,细菌的 RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；
2,真核基因转录的 mRNA缺乏 SD序列，在原核细胞中不能结合到核糖体上；
3,真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以 mRNA
中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的
RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；
4,表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。
二、构建原核表达载体的策略
1,将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和 SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。
2,采用真核基因的 cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有 RNA剪接功能的问题。
3,构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。
三、常用于原核表达的启动子
1,Lac启动子 是 β-半乳糖苷酶编码基因 LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被 IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。
2,Trp启动子 是编码参与色氨酸生物合成的几种酶的基因簇的上游调控序列，可以被色氨酸抑制，但可以被 β-
吲哚丙烯酸（ β- IAA）诱导。
3,Tac启动子 是一种由 Lac和 Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被 IPTG诱导表达。
4,λPL启动子 是负责 λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。
第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化真核基因表达的特点
1,一条成熟的 mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；
2,基因转录调节区很大,而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基,它们并不直接影响 RNA聚合酶与启动子区的结合,而是通过改变基因 5’上游区
DNA的构型来影响 RNA聚合酶与启动子区的结合；
3,mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；
4,基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。
真核基因转录起始位点上游序列的特点特点起始位点上游调控区其它调控区原核生物嘌呤和嘧啶都能起始转录范围小,-10区,-30
到 -70区为正调控区，
+10到 -20区为负调控区；
有 TTGACA区 (-30~
-40）参与调控。
真核生物有“帽子”结构专一性
（嘧啶腺苷酸嘧啶），只有嘌呤（ A为主）才能起始转录范围大,TATAA/TA区位于
-20到 -30,-40到 -110区为上游激活区；
除了有对应的 CAAT区外，
还有 GC区和增强子。
基因转录起始位点上游序列的比较
TTGACA TATAAT Pu>Py
-35区
-30-70 正调控区 -20 负调控区 +1
-10区
GC区 ….CAAT 区
TATAAA
T PuAPy
-40-110 +1-20-30
增强子
CCGCCC或 GGGCGG或 GGCCAATCT
T A
原核真核第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化驱动转基因表达的启动子类型天然诱导型启动子组织特异性表达 诱导型表达化学诱导型调控体系组织特异型启动子组成型表达花椰采花叶病毒
(CaMV)
35S启动子水稻肌动蛋白 1
(actin 1)
act1启动子表达组织 启动子来源 目的植物 作者花药 烟草 Ta29 烟草 油菜 Mariani （ 1990）
种子 菜豆植物凝集素基因 PHA-L tobacco Altabella （ 1990）
叶片 PEPC （ Pepcarboxylase Gene of Maize） maize Kozial （ 1993）
韧皮部 水稻蔗糖合酶基因 RSs1 tobacco Shi （ 1994）
果实 ovary tissue （ patent） tomato Martineau （ 1995）
胚乳 玉米淀粉合酶基因 GBS maize Russell （ 1997）
根系 发根农杆菌的 rolD启动子 番茄 Varvara （ 2001）
髓部 玉米 pGL2 rice Datta （ 1998）
部分用于植物遗传转化的组织特异性启动子
RSuS1启动子的组织特异性表达
35S-GusRSP1/2-Gus
化学诱导型调控系统是指可被某些化学物质诱导而表达启动或表达关闭的转基因调控系统。和植物天然的诱导型启动子相比，该类系统的应用更加灵活和自由，人们可以根据需求在转基因作物生长的任何时期对转基因的表达进行调控。
作为理想的化学诱导物必须具备以下特性：第一，
化学诱导物要对转基因诱导的专一性高，在受体作物中其本身含量低且对受体作物无毒害作用；第二，对环境友好，且造价不高；第三，诱导效率要高，其工作浓度低且不是常用的化学物质；第四，方便于喷洒或蘸根处理。
化学诱导型表达调控系统的原理用于转基因表达诱导物的分子式
Molecules used for the chemical induction of
transgene expression in plants.
Tetracycline Dexamethasone
Ethanol RH-5992
化学诱导型表达调控系统的原理一般来说，化学诱导调控系统都包含两个转录单元。第一个转录单元由一个组成型启动子（通常为 35S启动子）驱动一个对特定化学成分敏感的转录调控因子构成；
第二个转录单元由多拷贝的转录因子结合位点、微型植物启动子（通常为截短的 35S
启动子）和目的基因串联而成。
A去抑制型 B失活型第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病,
该病在法国,东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生 。 1907年
Smith和 Townsent等首先发现这种冠瘿瘤病是由根癌农杆菌引发的。
农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化
1974年 Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒 （ 大于 200kb）,称为 Ti
质粒 。
1977年 Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时,用分子杂交发现在肿瘤细胞中存在着农杆菌 Ti质粒的一个片段,称为 T-DNA（ Transfer-
DNA） 。 实验表明,T-DNA转移到植物细胞后整合进植物基因组中并得以表达,从而导致了冠瘿瘤的发生 。 进一步研究发现,整合到植物基因组中的 T-
DNA可以通过减数分裂稳定地传给植物的后代,Ti
质粒的上述特性成为农杆菌介导法植物遗传转化的重要基础 。
Ti质粒 为根癌农杆菌核外的一种环状双链 DNA
分子,长约 200Kb。 其中含有一段称为 T-DNA的可转移区段,当农杆菌侵染寄主细胞后,T-DNA可以从农杆菌转移到寄主细胞内并整合到寄主细胞的基因组中 。 Ti质粒的这一特性为农杆菌介导法植物转基因奠定了基础 。
T-DNA的长约 23Kb,在其两端各有一个 25bp
左右的正向重复序列,称之为 T-DNA的边界序列 。
在不同的农杆菌 Ti质粒上该序列高度保守,一般认为右端重复序列对 T-DNA的转移起决定性作用 。
农杆菌的 Ti质粒与植物遗传转化农杆菌介导的植物遗传转化分子机理示意图影响农杆菌介导法水稻转基因的因素共培养的条件（温度、激素和时间等）
植物愈伤组织的生理状态受体作物的基因型用于转化的受体组织农杆菌的活化状态农杆菌的菌种类型愈伤组织诱导和植株再生的效率转基因载体的类型农杆菌介导法转基因的基本流程及优化策略生理状态来源（盾片）
植物愈伤组织的诱导农杆菌的活化愈伤组织 农杆菌的共培养抗性愈伤组织获得及植株再生菌 种活化状态培养基成分缩短组培时间提高再生频率
2N6诱导愈伤 7-10d
N6 -BA 预培养 2-3d
种子优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系
AB-AS 诱导 12h
AB培养基活化 12h
YEP平板单菌落液体 MS浸泡 15min
无生长素 N6-AS共培养 3d N6-H选择培养 20d
抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d
62d~70d
1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程
4
植株再生第五章 克隆基因的表达第一节 基因表达的基本条件第二节 原核表达载体的构建第三节 克隆基因在植物细胞中的表达第一节 基因表达的基本条件
1、基因表达的基本过程
2、有效转录的基本条件
3、正确翻译的基本条件
4、影响克隆基因表达效率的因素第二节 原核表达载体的构建一、原核表达真核基因的困难二、构建原核表达载体的策略三、常用于原核表达载体的启动子第三节 克隆基因在植物细胞中的表达一、真核基因表达的特点二、用于植物表达的启动子类型三,Ti质粒及农杆菌介导的植物遗传转化
