,基因工程概论,
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定引 言基因克隆的本质是把某一目标 DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。
一般而言，基因克隆包括四部分工作,1、目标
DNA片段的获得； 2、克隆载体的构建； 3、寄主细胞的转化； 4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。
大肠杆菌作为寄主进行 DNA克隆的实验方案
DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化 机械切割双链 cDNA
的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体
DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第一节 目的 DNA片段的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因所谓 基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。
1977年,K,Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。
早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运 RNA
-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素
-干扰素大小（ bp）
126
542
81
162
453
合成年代
1978
1979
1981
1982
1982
1984
基因视紫红质前脑菲肽
ATP酶溶菌酶
RNA酶 T1
RNA酶Ａ
大小（ bp）
1057
77
170
385
324
375
合成年代
1985
1985
1985
1985
1986
1987
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成首先，将一个 5′端保护了的核苷酸和另一个 3 ′端保护了的核苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。
为了定向形成 5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应的基团保护起来。
1、化学法直接合成基因反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉，
这样一个 5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个 3 ′端保护了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。
如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。
基因的组装过程通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到 150-200bp的长度,
而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。
基因组装常用的有两种方法,一种方法是 先将寡核苷酸片段激活，带上 5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。 第二种方法是 将两条具有 3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产生的单链区段可在 Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸，
这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便可得到合成的基因片段。
1、化学法直接合成基因基因的组装过程
1、化学法直接合成基因方法 1 方法 1
ligase Klenow fragments
MCS
第一节 目的 DNA片段的获得
1、化学法直接合成
2、从基因组文库中钓取
3、从 cDNA文库中钓取
4、通过 PCR直接扩增
2、从基因组文库中钓取基因文库（ gene library） 是指汇集了某一生物基因组
DNA全部序列的重组体 DNA群体（转化子群）。
基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基因组本身的大小和克隆 DNA片段的平均大小有关。
基因组的大小（ bp）
2× 106（细菌） 2× 107 （真菌） 3× 109 （动物）
理论数 实际数 理论数 实际数 理论数 实际数克隆片段的平均大小（ bp）
5× 103 400 1831 4000 18 418 600 000 27 631 109
10× 103 200 919 2000 9 208 300 000 1 381 550
20× 103 100 458 1000 4 603 150 000 690 774
40× 103 50 278 500 2 300 75 000 354 386
2、从基因组文库中钓取因为基因组 DNA片段是随即克隆的，所以基因组大小除以克隆片段大小得到的只是 克隆数的理论值,从统计学的角度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有
50%。当克隆数增加到这一理论值的 2倍时，克隆到特定 DNA
片段的几率就上升到 75%。所以为了达到一种合理的几率以克隆到目的基因,一个完整的基因组文库就必须含有 3-10
倍于最低重组克隆数的克隆。
1975年,L,Clarke和 J,Carbon提出了一个 计算完全基因组文库所需实际克隆数的公式,N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中,N代表实际克隆数； p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一般的期望值都为 99%）； f代表限制性片段的平均大小与相应生物体基因组大小的比值。
2、从基因组文库中钓取目的基因
1981年 Ish-Horowics
和 Burke设计的特殊的基因组克隆方案，选用
MboI或 Sau3A进行基因组 DNA的酶切。不仅是因为它们是 4碱基识别位点的酶，而且它们和
BamHI是同尾酶。
cos
HindIIIBamHI
Sal I
Sal IHindIII
磷酸化酶
Sal I BamHI BamHIHindIII
BamHI BamHI
Sal I HindIII
Sau 3A
磷酸 化酶
32-47 kb
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因从真核生物基因组文库中直接分离到目的基因十分困难，
这主要是因为,真核生物的基因组太大，而其中非编码区占的比例很大； 另外,真核基因大都有很大的内含子，很难从基因组文库中直接分离到目的基因。
克隆真核生物的基因往往是从 cDNA
文库的建立开始的。
主要步骤包括：总
RNA的提取和纯化；
cDNA的合成；
cDNA文库的构建。
A,文库的构建
5’ TTTTTTTTT
DNA聚合酶
I
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
多聚 T引物反转录酶
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
碱降解 RNA
S1核酸酶加接头 插入载体并导入寄主细胞重组克隆
cDNA文库的构建过程
A,文库的构建
A,文库的构建构建好文库后就需要从众多的克隆中筛选出含有目的 DNA片段的克隆,这时一般要用到菌落原位杂交技术,
如果两条同原性很高的 DNA序列解链后混合,当条件恢复时来源于不同的 DNA的单链间可以通过碱基互补而发生紧密结合 （ 杂交 ） 。 所以我们可以将某种已知的 DNA序列制备成探针
（ Probe）,即将 DNA序列用同位素或地高辛标记,这样就可以同过探针的杂交来筛选出含有特定 DNA序列的克隆 。 用同位素标记后可以通过 X-光片的感光来探测到有杂交信号的克隆,用地高辛标记后可以通过结合在抗地高辛抗体上的碱性磷酸酶与显色底物的反应直接观察到发生了杂交的克隆 （ 对应位置显为紫色 ） 。
B,克隆的筛选
B,克隆的筛选
a,将克隆转移到一张硝酸纤维素膜或是尼龙膜上 。
b,用碱处理使的细胞中的 DNA释放出来并且发生解链 。
c,然后通过烘烤或紫 外 线 照 射 将
DNA固定在膜上 。
菌落原位杂交的基本流程是：
B,克隆的筛选
d,将转好的膜在含有探针的杂交液中杂交,使得探针与目标 DNA紧密结合 。 漂洗后将非特异结合的探针去掉 。
e,探针为地高辛标记时,可以通过抗体和地高辛的二次杂交和显色反应在含有特定 DNA片段的克隆对应位置出现紫色印记 。 如果探针为同位素标记时,可以通过放射自显影使得 X-
光片感光而在相应位置出现感光信号 。
C,目标 DNA片段的获得一般来说将筛选到的克隆提取其中质粒 DNA,通过酶切就可以获得所要的目标 DNA片段 。 但是,有时克隆到的片段还是比较大,
为了进一步获得更精确的 DNA片段,我们还要进一步的 DNA杂交 。
比如,我们可以将克隆到的 DNA片段用某一种或几中限制性内切酶消化,再通过电泳将不同分子的 DNA分开,然后通过毛细管法将 DNA从凝胶中转移到尼龙膜上,最后用探针杂交以确定含有特定片段的目的 DNA片段 。
Once a library has been established,it is neccessary to identify
which clone(s) contain the gene of interest,A more generally used
screening method is colony hybridisation.
Oligonucleotides such as oligo RNA and DNA molecules will
interact through base-pairing if they share significant sequence
homology,This means that a piece of DNA can be synthesised with
a sequence that is complementary to the gene of interest and
labelled in some way,This is usually done by radiolabeling,
although non-radioactive methods are increasing in popularity.
The labeling system we will use in the practical sessions will be the
"Dig" system,This uses a digoxygenin-labeled nucleotide
incorporated into DNA by nick-translation,The dig-labeled
oligonucleotide is detected by an anti-dig antibody that is
conjugated to the enzyme alkaline phosphatase,This enzyme
catalyses a reaction with a colorimetric substrate and results in
production of a purple colour.
B,克隆的筛选
B,克隆的筛选
a,Colonies are placed
on a nitrocellulose or
nylon membrane.
This can be done by
spotting samples or
by transfer from agar
plates,depending on
how the library is
stored.
b,Cells are degraded
to liberate DNA
which is then
denatured and fixed
to the membrane.
The procedure for colony hybridisation is as follows:
B,克隆的筛选
c,The membrane is
incubated with the
labeled oligobucleotide
probe,The membrane
is then washed to
remove any non-
specifically bound
probe.
d,Specific binding is
then detected by
autoradiography,X-ray
film is layed ontop of
the membrane and
signals detected after
developing the film.
C,目标 DNA片段的获得
Once a clone has been identified in a clone library,further analyses
can then be done to identify the gene of interest within the cloned DNA.
An important means of achieving this is Southern hybridisation of
fragments generated by restriction enzyme digestion,The technique
involves digestion of the DNA with restriction enzymes and separation
of the fragments by agarose gel electrophoresis,The fragments are then
transfered to a membrane by blotting,The fragments containing the
gene of interest are then detected by incubating the membrane with a
labeled probe followed by washing and autoradiography.
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因如果已经知道了某一基因家族中某一成员的序列，则可以根据该家族基因的保守序列设计特异性引物直接从该生物基因组 DNA中扩增获得该基因的特定区域，甚至是全基因。如果该基因很大是，可以分段进行克隆，然后再将获得的片段连接起来，最终得到目的基因的全序列。
第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入
1、载体的选择和分离
Selection of vector
The choice of vector will depend to a large degree on
what the desired outcome of the gene cloning experiment is.
Many times,a vector is needed to sub-clone a fragment from
a gene library,The pUC series and pGEM series are
examples of good general-purpose cloning vectors.
If the sequence of the gene is the object of the exercise,
then a vector which gives rise to single-stranded DNA is
required such as one of the M13 series,If expression of the
protein product is needed then a vector optimized for this
purpose such as the pET series should be chosen.
质粒 DNA的分离方法很多，但其中共同的步骤是：
a,用溶菌酶处理含有载体的寄主细胞培养物，以破坏细胞壁；
b,加入 SDS（ sodium dodecylsulfate,十二烷基硫酸钠）之类的去污剂使寄主细胞发生温和的溶菌作用。这时，细胞内的环状质粒 DNA、多聚核糖体、可溶性蛋
c,白质等生物大分子放出来，而核染色体仍然附着在细胞的碎片上。
d,通过离心将细胞碎片及附着于其上的染色体 DNA等物质去除，这时质粒 DNA分布在上清液中。
e,用酚、酚 /氯仿 /异戊醇处理去除上清液中的蛋白质，最终获得质粒。
1、载体的选择和分离第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的片段与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入
2、目的基因与载体的连接
Generation of recombinant molecules
In order to generate a recombinant molecule,both
vector and source DNA shuold be cut with compatible
restriction enzymes,That is to say the ends liberated by the
enzymes should be mutually cohesive,This is achieved by
using one enzyme or by cutting the two molecules with two
enzymes that liberate the same cohesive ends,such as
BamHI and Sau3A.
After digestion of both DNA and vector,the molecules
are mixed and ligated using DNA ligase,This is best
achieved with overlapping cohesive ends,but can occur
using blunt ends,albeit [?:l’bi:t] with much lower
efficiency.
互补粘性末端分子间的连接用同一可产生粘性末端的限制性内切酶去切割外源 DNA分子和载体时，所产生的粘末端 DNA分子间很容易进行连接。当然，通过同尾酶切割后的 DNA片段也具有这种特性。
除了尽量选用粘性末端连接外，构建载体还应注意：
A,实验步骤要尽量简单易行，并设法提高连接的效率（如防止载体的自连）；
B,连接到载体上的外源片段应该能重新切割下来，以便于回收克隆的 DNA片段。
C,如果是要求实现基因表达的序列，还要注意转录和翻译的密码子结构的正确性。
D,要注意插入片段的方向性。
2、目的基因与载体的连接载体去磷防止连接反应中的载体自连
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等
2、目的基因与载体的连接外源 DNA片段的定向插入当两个末端具有相同得粘性末端的 DNA分子或是平末端的
DNA分子插入到载体中时，会出现正向和反向插入两种情况。
一方面，我们可以通过对重组质粒的酶切鉴定来选择正向插入的克隆或反向插入的克隆；
另一方面，通过选用两种合适的限制性内切酶分别对载体和外源 DNA进行切割也可以实现外源 DNA分子的 定向插入 。
2、目的基因与载体的连接
HindIII
BamHI
HindIII BamHI
HindIII
BamHI
平末端 DNA片段加接头在实际操作中，往往会出现找不到合适酶切位点，或是所产生的外源 DNA只能是平末端的情况，这时就需要对平末端的
DNA分子进行连接。对于这种连接实验，我们可以采用加接头法，
也可以采用末端转移酶加尾法，当然用平末端直接连接也是可以的，只是连接效率要低得多。
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
磷酸化 CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH
OH
P
P
POH
OH
T4连接酶
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH P
OH
EcoR I
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
AATTCGG
GCC
CCG
GGCTTAA
2、目的基因与载体的连接
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶 和
T4DNA连接酶平末端 DNA片段末端加尾法连接
2、目的基因与载体的连接第二节 重组载体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组载体向寄主细胞的导入
3、重组载体向寄主细胞的导入重组 DNA分子构建好后必须转移到适当的受体细胞中才能得到扩增和表达 。 将普通的质粒分子导入受体细胞的过程称为 转化 （ tranformation） ; 将具有感染能力的噬菌体 DNA分子导入受体细胞的过程称为 转染 （ transfection） ；
而噬菌体主动将其 DNA注入受体细胞得过程称为 感染
（ infection）,
1970年,Mandel和 Higa等发现,用 CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌细胞比较容易获得?噬菌体的 DNA； 1972年,
Cohen等也发现用 CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌能被环状的质粒 DNA分子所转化 。 这种经过处理能够接受外源 DNA的细胞成为 感受态细胞 （ copetent cell）,
3、重组体向寄主细胞的导入大肠杆菌感受态细胞的制备
a) 在不含抗生素的 LB平板上涂布大肠杆菌 DH5α，于 37℃ 培养过夜 (16-20h)；
b) 挑一个单菌落接种于 25mL无菌的 LB 培养液中,37℃ 中速震荡培养 3h；
c) 将上述菌液在冰浴 5分钟,然后在 4 ℃,4000rpm 离心 10分钟 ;
d) 将细菌沉淀用 5mL 预冷的 CaCl2（ 0.1M）重悬，冰浴一会后于 4 ℃ 4000rpm离心 10分钟；
e) 将细菌沉淀用 1mL 预冷的 CaCl2（ 0.1M）重悬，取 200uL用于细菌转化,其余菌液加入 20%的无菌甘油,摇匀后于 -20℃ 保存备用 ;
质粒 DNA转化大肠杆菌的程序
3、重组体向寄主细胞的导入
a) 用冷的无菌枪头吸取 200uL感受态细胞到一新的离心管中,加入质粒 DNA后冰浴 30分钟；
b) 立即将转化用的离心管置入 42℃ 水浴中静置 90秒 ；
c) 迅速将离心管移入冰水混合物中冰浴 1-2分钟 ;
d) 加入 800uL的 LB培养基,混匀后于 37℃ 水浴 5分钟 ；
e) 将离心管侧向固定在摇床上,37℃ 缓慢震荡培养 45分钟 ;
f) 于室温 1000rpm离心 5分钟,弃取约 800uL的培养液,再将剩余的培养液和细菌重悬,然后涂布到含有抗生素的 LB平板上 37℃ 选择培养过夜 (16h);
g) 检测选择平板上的抗性菌落,并提取质粒 DNA进行鉴定,
第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第三节 重组克隆的筛选和鉴定根据所使用克隆载体的特性不同,重组克隆的筛选方法也多种多样 。 比如,用噬菌体 DNA作为载体时就不需要筛选,所有正常的噬菌斑都是重组体； 当使用 pUC系列载体时,白色菌落一般都是重组体； 如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性,那么我们也可以利用 DNA的酶切分析进行直接鉴定 。 比如,从平板上随机挑选 10个菌落,然后提取其中的质粒 DNA分子,并对其进行酶切分析,同样可以准确地选择得到所要的重组克隆,而且同时可以鉴定外源片段插入的方向,选择得到所要的理想克隆 。
有时,我们不仅想知道哪些是重组体克隆,而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆 （ 比如在 cDNA文库的筛选中,我们就需要选择到含有目的基因克隆 ） 。 这时我们可以用比较复杂的 核酸杂交或免疫化学的方法 。
随机挑取提取质粒第三节 重组克隆的筛选和鉴定连接产物转化空载体转化酶切质粒
1.0 0.5 3.5kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
1.0 0.5
0.5
1.0
4.0
3.0
5.0
AA
第三节 重组克隆的筛选和鉴定第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组载体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入大肠杆菌作为寄主进行 DNA克隆的实验方案
DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化 机械切割双链 cDNA
的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体
DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞
第一章 导 论第二章 基因操作的工具酶第三章 基因克隆的载体第四章 基因克隆的策略第五章 克隆基因的表达第六章 基因工程的基本技术第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定引 言基因克隆的本质是把某一目标 DNA片段通过无性的方式进行扩增和表达，而这一过程往往是通过载体和寄主细胞来实现的。
一般而言，基因克隆包括四部分工作,1、目标
DNA片段的获得； 2、克隆载体的构建； 3、寄主细胞的转化； 4、重组体克隆的选择和鉴定。
目前，以大肠杆菌为寄主，以质粒和噬菌体等为载体的基因克隆体系已经相当的成熟，本章将以这种克隆模式为主体对基因克隆的策略展开讨论和分析。
大肠杆菌作为寄主进行 DNA克隆的实验方案
DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化 机械切割双链 cDNA
的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体
DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第一节 目的 DNA片段的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
1、化学法直接合成基因所谓 基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。
1977年,K,Itakura利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。
早期通过化学合成的部分基因基因人胰岛素转运 RNA
-干扰素肠促胰液肽尿抑胃激素
-干扰素大小（ bp）
126
542
81
162
453
合成年代
1978
1979
1981
1982
1982
1984
基因视紫红质前脑菲肽
ATP酶溶菌酶
RNA酶 T1
RNA酶Ａ
大小（ bp）
1057
77
170
385
324
375
合成年代
1985
1985
1985
1985
1986
1987
磷酸二酯法寡核苷酸片段的合成首先，将一个 5′端保护了的核苷酸和另一个 3 ′端保护了的核苷酸通过缩合反应形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。
为了定向形成 5 ′- 3 ′磷酸二酯键，通常用化学物质将不参加反应的基团保护起来。
1、化学法直接合成基因反应结束后可以通过酸或碱的脱保护作用将保护基团去掉，
这样一个 5 ′保护了的合成的二核苷酸分子就又能和一个 3 ′端保护了的单核苷酸分子进行第二次缩合反应形成一个三核苷酸的分子。
如此反复进行缩合反应，就可以合成一条特定的寡核苷酸片段。
基因的组装过程通过化学合成的寡核苷酸片段只能达到 150-200bp的长度,
而一个基因的长度通常要大的多。所以必须通过一定的程序将寡核苷酸片段连接起来构建成一个完整的基因。这种将多个寡核苷酸片段装配成完整基因的过程称为基因的组装。
基因组装常用的有两种方法,一种方法是 先将寡核苷酸片段激活，带上 5′磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，最后通过连接酶将这些寡核苷酸片段逐个连接起来成为完整的基因。 第二种方法是 将两条具有 3 ′端互补的寡核苷酸单链进行退火，所产生的单链区段可在 Klenow酶的聚合作用下很快得到互补的延伸，
这样就可以得到一段连接好的双链寡核苷酸片段，以此类推便可得到合成的基因片段。
1、化学法直接合成基因基因的组装过程
1、化学法直接合成基因方法 1 方法 1
ligase Klenow fragments
MCS
第一节 目的 DNA片段的获得
1、化学法直接合成
2、从基因组文库中钓取
3、从 cDNA文库中钓取
4、通过 PCR直接扩增
2、从基因组文库中钓取基因文库（ gene library） 是指汇集了某一生物基因组
DNA全部序列的重组体 DNA群体（转化子群）。
基因组文库的大小（即应该包含多少个独立的克隆）与基因组本身的大小和克隆 DNA片段的平均大小有关。
基因组的大小（ bp）
2× 106（细菌） 2× 107 （真菌） 3× 109 （动物）
理论数 实际数 理论数 实际数 理论数 实际数克隆片段的平均大小（ bp）
5× 103 400 1831 4000 18 418 600 000 27 631 109
10× 103 200 919 2000 9 208 300 000 1 381 550
20× 103 100 458 1000 4 603 150 000 690 774
40× 103 50 278 500 2 300 75 000 354 386
2、从基因组文库中钓取因为基因组 DNA片段是随即克隆的，所以基因组大小除以克隆片段大小得到的只是 克隆数的理论值,从统计学的角度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率只有
50%。当克隆数增加到这一理论值的 2倍时，克隆到特定 DNA
片段的几率就上升到 75%。所以为了达到一种合理的几率以克隆到目的基因,一个完整的基因组文库就必须含有 3-10
倍于最低重组克隆数的克隆。
1975年,L,Clarke和 J,Carbon提出了一个 计算完全基因组文库所需实际克隆数的公式,N=ln(1-p)/ln(1-f)。其中,N代表实际克隆数； p代表在重组群体中出现特定基因的几率（一般的期望值都为 99%）； f代表限制性片段的平均大小与相应生物体基因组大小的比值。
2、从基因组文库中钓取目的基因
1981年 Ish-Horowics
和 Burke设计的特殊的基因组克隆方案，选用
MboI或 Sau3A进行基因组 DNA的酶切。不仅是因为它们是 4碱基识别位点的酶，而且它们和
BamHI是同尾酶。
cos
HindIIIBamHI
Sal I
Sal IHindIII
磷酸化酶
Sal I BamHI BamHIHindIII
BamHI BamHI
Sal I HindIII
Sau 3A
磷酸 化酶
32-47 kb
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因从真核生物基因组文库中直接分离到目的基因十分困难，
这主要是因为,真核生物的基因组太大，而其中非编码区占的比例很大； 另外,真核基因大都有很大的内含子，很难从基因组文库中直接分离到目的基因。
克隆真核生物的基因往往是从 cDNA
文库的建立开始的。
主要步骤包括：总
RNA的提取和纯化；
cDNA的合成；
cDNA文库的构建。
A,文库的构建
5’ TTTTTTTTT
DNA聚合酶
I
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
3’ AAAAAAAA AAAAAAAA5’ TTTTTTTTT
3’ AAAAAAAA
多聚 T引物反转录酶
AAAAAAAA
TTTTTTTTT
碱降解 RNA
S1核酸酶加接头 插入载体并导入寄主细胞重组克隆
cDNA文库的构建过程
A,文库的构建
A,文库的构建构建好文库后就需要从众多的克隆中筛选出含有目的 DNA片段的克隆,这时一般要用到菌落原位杂交技术,
如果两条同原性很高的 DNA序列解链后混合,当条件恢复时来源于不同的 DNA的单链间可以通过碱基互补而发生紧密结合 （ 杂交 ） 。 所以我们可以将某种已知的 DNA序列制备成探针
（ Probe）,即将 DNA序列用同位素或地高辛标记,这样就可以同过探针的杂交来筛选出含有特定 DNA序列的克隆 。 用同位素标记后可以通过 X-光片的感光来探测到有杂交信号的克隆,用地高辛标记后可以通过结合在抗地高辛抗体上的碱性磷酸酶与显色底物的反应直接观察到发生了杂交的克隆 （ 对应位置显为紫色 ） 。
B,克隆的筛选
B,克隆的筛选
a,将克隆转移到一张硝酸纤维素膜或是尼龙膜上 。
b,用碱处理使的细胞中的 DNA释放出来并且发生解链 。
c,然后通过烘烤或紫 外 线 照 射 将
DNA固定在膜上 。
菌落原位杂交的基本流程是：
B,克隆的筛选
d,将转好的膜在含有探针的杂交液中杂交,使得探针与目标 DNA紧密结合 。 漂洗后将非特异结合的探针去掉 。
e,探针为地高辛标记时,可以通过抗体和地高辛的二次杂交和显色反应在含有特定 DNA片段的克隆对应位置出现紫色印记 。 如果探针为同位素标记时,可以通过放射自显影使得 X-
光片感光而在相应位置出现感光信号 。
C,目标 DNA片段的获得一般来说将筛选到的克隆提取其中质粒 DNA,通过酶切就可以获得所要的目标 DNA片段 。 但是,有时克隆到的片段还是比较大,
为了进一步获得更精确的 DNA片段,我们还要进一步的 DNA杂交 。
比如,我们可以将克隆到的 DNA片段用某一种或几中限制性内切酶消化,再通过电泳将不同分子的 DNA分开,然后通过毛细管法将 DNA从凝胶中转移到尼龙膜上,最后用探针杂交以确定含有特定片段的目的 DNA片段 。
Once a library has been established,it is neccessary to identify
which clone(s) contain the gene of interest,A more generally used
screening method is colony hybridisation.
Oligonucleotides such as oligo RNA and DNA molecules will
interact through base-pairing if they share significant sequence
homology,This means that a piece of DNA can be synthesised with
a sequence that is complementary to the gene of interest and
labelled in some way,This is usually done by radiolabeling,
although non-radioactive methods are increasing in popularity.
The labeling system we will use in the practical sessions will be the
"Dig" system,This uses a digoxygenin-labeled nucleotide
incorporated into DNA by nick-translation,The dig-labeled
oligonucleotide is detected by an anti-dig antibody that is
conjugated to the enzyme alkaline phosphatase,This enzyme
catalyses a reaction with a colorimetric substrate and results in
production of a purple colour.
B,克隆的筛选
B,克隆的筛选
a,Colonies are placed
on a nitrocellulose or
nylon membrane.
This can be done by
spotting samples or
by transfer from agar
plates,depending on
how the library is
stored.
b,Cells are degraded
to liberate DNA
which is then
denatured and fixed
to the membrane.
The procedure for colony hybridisation is as follows:
B,克隆的筛选
c,The membrane is
incubated with the
labeled oligobucleotide
probe,The membrane
is then washed to
remove any non-
specifically bound
probe.
d,Specific binding is
then detected by
autoradiography,X-ray
film is layed ontop of
the membrane and
signals detected after
developing the film.
C,目标 DNA片段的获得
Once a clone has been identified in a clone library,further analyses
can then be done to identify the gene of interest within the cloned DNA.
An important means of achieving this is Southern hybridisation of
fragments generated by restriction enzyme digestion,The technique
involves digestion of the DNA with restriction enzymes and separation
of the fragments by agarose gel electrophoresis,The fragments are then
transfered to a membrane by blotting,The fragments containing the
gene of interest are then detected by incubating the membrane with a
labeled probe followed by washing and autoradiography.
第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因如果已经知道了某一基因家族中某一成员的序列，则可以根据该家族基因的保守序列设计特异性引物直接从该生物基因组 DNA中扩增获得该基因的特定区域，甚至是全基因。如果该基因很大是，可以分段进行克隆，然后再将获得的片段连接起来，最终得到目的基因的全序列。
第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入
1、载体的选择和分离
Selection of vector
The choice of vector will depend to a large degree on
what the desired outcome of the gene cloning experiment is.
Many times,a vector is needed to sub-clone a fragment from
a gene library,The pUC series and pGEM series are
examples of good general-purpose cloning vectors.
If the sequence of the gene is the object of the exercise,
then a vector which gives rise to single-stranded DNA is
required such as one of the M13 series,If expression of the
protein product is needed then a vector optimized for this
purpose such as the pET series should be chosen.
质粒 DNA的分离方法很多，但其中共同的步骤是：
a,用溶菌酶处理含有载体的寄主细胞培养物，以破坏细胞壁；
b,加入 SDS（ sodium dodecylsulfate,十二烷基硫酸钠）之类的去污剂使寄主细胞发生温和的溶菌作用。这时，细胞内的环状质粒 DNA、多聚核糖体、可溶性蛋
c,白质等生物大分子放出来，而核染色体仍然附着在细胞的碎片上。
d,通过离心将细胞碎片及附着于其上的染色体 DNA等物质去除，这时质粒 DNA分布在上清液中。
e,用酚、酚 /氯仿 /异戊醇处理去除上清液中的蛋白质，最终获得质粒。
1、载体的选择和分离第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的片段与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入
2、目的基因与载体的连接
Generation of recombinant molecules
In order to generate a recombinant molecule,both
vector and source DNA shuold be cut with compatible
restriction enzymes,That is to say the ends liberated by the
enzymes should be mutually cohesive,This is achieved by
using one enzyme or by cutting the two molecules with two
enzymes that liberate the same cohesive ends,such as
BamHI and Sau3A.
After digestion of both DNA and vector,the molecules
are mixed and ligated using DNA ligase,This is best
achieved with overlapping cohesive ends,but can occur
using blunt ends,albeit [?:l’bi:t] with much lower
efficiency.
互补粘性末端分子间的连接用同一可产生粘性末端的限制性内切酶去切割外源 DNA分子和载体时，所产生的粘末端 DNA分子间很容易进行连接。当然，通过同尾酶切割后的 DNA片段也具有这种特性。
除了尽量选用粘性末端连接外，构建载体还应注意：
A,实验步骤要尽量简单易行，并设法提高连接的效率（如防止载体的自连）；
B,连接到载体上的外源片段应该能重新切割下来，以便于回收克隆的 DNA片段。
C,如果是要求实现基因表达的序列，还要注意转录和翻译的密码子结构的正确性。
D,要注意插入片段的方向性。
2、目的基因与载体的连接载体去磷防止连接反应中的载体自连
P
OH
POH
OHOH
OH OH
P
OH P
OH
OHOH
OHOH连接酶连接酶连接酶 碱性磷酸酶
2Pi
寄主修复缺口载体自连或产生二具体等
2、目的基因与载体的连接外源 DNA片段的定向插入当两个末端具有相同得粘性末端的 DNA分子或是平末端的
DNA分子插入到载体中时，会出现正向和反向插入两种情况。
一方面，我们可以通过对重组质粒的酶切鉴定来选择正向插入的克隆或反向插入的克隆；
另一方面，通过选用两种合适的限制性内切酶分别对载体和外源 DNA进行切割也可以实现外源 DNA分子的 定向插入 。
2、目的基因与载体的连接
HindIII
BamHI
HindIII BamHI
HindIII
BamHI
平末端 DNA片段加接头在实际操作中，往往会出现找不到合适酶切位点，或是所产生的外源 DNA只能是平末端的情况，这时就需要对平末端的
DNA分子进行连接。对于这种连接实验，我们可以采用加接头法，
也可以采用末端转移酶加尾法，当然用平末端直接连接也是可以的，只是连接效率要低得多。
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
磷酸化 CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH
OH
P
P
POH
OH
T4连接酶
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
P
OH P
OH
EcoR I
CCGAATTCGG
GGCTTAAGCC
AATTCGG
GCC
CCG
GGCTTAA
2、目的基因与载体的连接
3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
5’
末端核苷酸转移酶+dATP +dTTP
3’
3’ 5’
5’
3’
3’ 5’
5’
AAAAA
TTTT
DNA聚合酶 和
T4DNA连接酶平末端 DNA片段末端加尾法连接
2、目的基因与载体的连接第二节 重组载体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组载体向寄主细胞的导入
3、重组载体向寄主细胞的导入重组 DNA分子构建好后必须转移到适当的受体细胞中才能得到扩增和表达 。 将普通的质粒分子导入受体细胞的过程称为 转化 （ tranformation） ; 将具有感染能力的噬菌体 DNA分子导入受体细胞的过程称为 转染 （ transfection） ；
而噬菌体主动将其 DNA注入受体细胞得过程称为 感染
（ infection）,
1970年,Mandel和 Higa等发现,用 CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌细胞比较容易获得?噬菌体的 DNA； 1972年,
Cohen等也发现用 CaCl2 溶液处理过的大肠杆菌能被环状的质粒 DNA分子所转化 。 这种经过处理能够接受外源 DNA的细胞成为 感受态细胞 （ copetent cell）,
3、重组体向寄主细胞的导入大肠杆菌感受态细胞的制备
a) 在不含抗生素的 LB平板上涂布大肠杆菌 DH5α，于 37℃ 培养过夜 (16-20h)；
b) 挑一个单菌落接种于 25mL无菌的 LB 培养液中,37℃ 中速震荡培养 3h；
c) 将上述菌液在冰浴 5分钟,然后在 4 ℃,4000rpm 离心 10分钟 ;
d) 将细菌沉淀用 5mL 预冷的 CaCl2（ 0.1M）重悬，冰浴一会后于 4 ℃ 4000rpm离心 10分钟；
e) 将细菌沉淀用 1mL 预冷的 CaCl2（ 0.1M）重悬，取 200uL用于细菌转化,其余菌液加入 20%的无菌甘油,摇匀后于 -20℃ 保存备用 ;
质粒 DNA转化大肠杆菌的程序
3、重组体向寄主细胞的导入
a) 用冷的无菌枪头吸取 200uL感受态细胞到一新的离心管中,加入质粒 DNA后冰浴 30分钟；
b) 立即将转化用的离心管置入 42℃ 水浴中静置 90秒 ；
c) 迅速将离心管移入冰水混合物中冰浴 1-2分钟 ;
d) 加入 800uL的 LB培养基,混匀后于 37℃ 水浴 5分钟 ；
e) 将离心管侧向固定在摇床上,37℃ 缓慢震荡培养 45分钟 ;
f) 于室温 1000rpm离心 5分钟,弃取约 800uL的培养液,再将剩余的培养液和细菌重悬,然后涂布到含有抗生素的 LB平板上 37℃ 选择培养过夜 (16h);
g) 检测选择平板上的抗性菌落,并提取质粒 DNA进行鉴定,
第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第三节 重组克隆的筛选和鉴定根据所使用克隆载体的特性不同,重组克隆的筛选方法也多种多样 。 比如,用噬菌体 DNA作为载体时就不需要筛选,所有正常的噬菌斑都是重组体； 当使用 pUC系列载体时,白色菌落一般都是重组体； 如果所用的质粒并不具备明显的鉴别特性,那么我们也可以利用 DNA的酶切分析进行直接鉴定 。 比如,从平板上随机挑选 10个菌落,然后提取其中的质粒 DNA分子,并对其进行酶切分析,同样可以准确地选择得到所要的重组克隆,而且同时可以鉴定外源片段插入的方向,选择得到所要的理想克隆 。
有时,我们不仅想知道哪些是重组体克隆,而且想知道重组体克隆中哪些是含有某个基因的克隆 （ 比如在 cDNA文库的筛选中,我们就需要选择到含有目的基因克隆 ） 。 这时我们可以用比较复杂的 核酸杂交或免疫化学的方法 。
随机挑取提取质粒第三节 重组克隆的筛选和鉴定连接产物转化空载体转化酶切质粒
1.0 0.5 3.5kb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 M
1.0 0.5
0.5
1.0
4.0
3.0
5.0
AA
第三节 重组克隆的筛选和鉴定第四章 基因克隆的策略引 言第一节 目的基因的获得第二节 重组载体的构建及细菌转化第三节 重组克隆的筛选和鉴定第一节 目的基因的获得
1、化学法直接合成基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从 cDNA文库中钓取目的基因
4、通过 PCR直接扩增出目的基因第二节 重组体的构建及细菌转化
1、载体的选择和分离
2、目的基因与载体的连接
3、重组体向寄主细胞的导入大肠杆菌作为寄主进行 DNA克隆的实验方案
DNA片段的获得载体构建细菌转化重组体的鉴定限制性内切酶消化 机械切割双链 cDNA
的合成化学法直接合成同聚物加尾粘性末端连接平末端连接加接头造成粘性末端重组噬菌体
DNA转染重组质粒的转化体外包装进行转导表型鉴定 核酸杂交 免疫学分析 酶切鉴定基因工程的基本步骤基因分离酶切载体酶切基因和载体连接导入细菌重组质粒繁殖重组克隆的选择序列分析和基因表达等研究导入植物细胞
