基因重组和基因工程
Genetic Recombination and Genetic
Engineering
第 十 四 章目 录目 录第 一 节
DNA的重组
DNA Recombination
目 录
DNA重组接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
转 座 (transposition)
同源重组 (homologous recombination)
位点特异的重组 (site-specific recombination)
目 录发生在同源序列间的重组称为 同源重组
(homologous recombination),又称 基本重组 。
是最基本的 DNA重组方式,通过链的断裂和再连接,在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 。
以 E.coli的同源重组为例,了解同源重组机制的 Holliday模型 。
一、同源重组目 录
Holliday模型中，同源重组主要 4个关键步骤
① 两个同源染色体 DNA排列整齐
②一个 DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA
对应的链连接，形成 Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链 DNA
④ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA，分别为：
片段重组体 (patch recombinant)
拼接重组体 (splice recombinant)
目 录片段重组体 （见模型图左边产物）：
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本
DNA。
拼接重组体 （见模型图右边产物）：
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本 DNA。
内切酶
(recBCD)
DNA侵扰
(recA)
分支迁移
(recA)
内切酶
(recBCD)
DNA
连接酶
5′ 3′
5′
3′5′
3′
5′3′
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′ 5′3′
5′ 3′
3′ 3′
5′3′
5′3′
3′5′
5′ 3′
5′3′
5′3′
Holiday中间体
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
目 录
Holiday中间体
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
5′
3′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′5′ 3′
3′
3′
3′
内切酶
(ruvC)内切酶
(ruvC)
DNA
连接酶
DNA
连接酶片段重组体拼接重组体 目 录目 录二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用当细胞与细胞,或细菌通过菌毛相互接触时,质粒 DNA从一个细胞 （ 细菌 ） 转移至另一细胞 （ 细菌 ） 的 DNA转移称为 接合作用
(conjugation)。
目 录可接合质粒如 F 因子 (F factor)
质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子目 录
（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源 DNA，
使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,
称为 转化作用 (transformation)。
目 录例,溶菌时，裂解的 DNA片段被另一细菌摄取。
目 录目 录
（三）转导作用当病毒从被感染的 （ 供体 ） 细胞释放出来,再次感染另一 （ 供体 ） 细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA转移及基因重组即为 转导作用 (transduction)。
λ噬菌体的生活史溶菌生长途径
(lysis pathway)
溶源菌生长途径
(lysogenic pathway)
例目 录目 录目 录三,位点特异重组位点特异重组 (site-specific recombination)
是由整合酶催化,在两个 DNA序列的特异位点间发生的整合 。
例 （ 一 ） λ噬菌体 DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒 整合酶 可特 异地识 别,整 合反转 录病毒
cDNA的 长末端重复序列 (long terminal repeat,
LTR)。
目 录例 （二）细菌的特异位点重组沙门氏菌 H片段倒位决定鞭毛相转变目 录
hix为反向重复序列,它们之间的 H片段可在 Hin控制下进行特异位点重组 (倒位 )。 H
片段上有两个启动子 P,其一驱动 hin基因表达,另一正向时驱动 H2和 rH1基因表达,反向 (倒位 )时 H2和 rH1不表达 。 rH1为 H1的阻遏蛋白基因 。
目 录
H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段
hin H2 I H1
H1鞭毛素
hin H2 I
DNA 启动序列
H1
启动序列沙门氏菌 H片段倒位决定鞭毛相转变目 录例 （三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白 (Ig),由两条轻链 (L链 )和两条重链 (H链 )组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链 (?和?),一个编码重链 。
轻链的基因片段：
重链的基因片段：
L V J C
L V D J C
目 录重链 (IgH)基因的 V-D-J重排和轻链 (IgL)基因的 V-J重排均发生在特异位点上 。 在 V片段的下游,J片段的上游以及 D片段的两侧均存在保守的重组信号序列 (recombination signal
sequence,RSS) 。 此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag
(recombination activating gene)共有两个,分别产生蛋白质 RAG1和 RAG2。
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC TGTTTTTGG
重组信号序列基因片段
V片段 J片段RSS RSS
间插 DNA
OH
OH
V J
单链切开 RAG1RAG2
分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目 录目 录四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为 转座 (transposition)。
目 录插入序列 (insertion sequences,IS)组成：
二个分离的反向重复 (inverted repeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（ transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR
发生形式：
保守性转座 (conservative transposition)
复制性转座 (duplicative transposition)
（一）插入序列转座插入序列的复制性转座目 录目 录转座子 (transposons) —— 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
转座子组成,反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因
IR IRTransposase Gene 有用基因
（二）转座子转座目 录由转座子介导的转座目 录目 录第 二 节重组 DNA技术
DNA Recombination Technique
目 录重组 DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验
1973年 美国斯坦福大学的科学家构建 第一个 重组 DNA分子
1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上 第一家 遗传工程公司，专门应用重组 DNA技术制造医学上重要的药物。
1980年 开始建造 第一家 应用重组 DNA技术生产胰岛素的工厂
1997年 英国罗林研究所成功的克隆了 多莉目 录
相关概念
DNA克隆
工具酶
目的基因
基因载体
基本原理
重组 DNA技术与医学的关系本节主要内容目 录一,重组 DNA技术相关概念克隆 (clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为 克隆化 (cloning)，
即 无性繁殖 。
（一） DNA克隆目 录技术水平,分子克隆 (molecular clone)
即 DNA 克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）
目 录
DNA克隆应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质 （ 同源的或异源的,原核的或真核的,天然的或人工的 DNA） 与载体 DNA接合成一具有自我复制能力的 DNA分子 —— 复制子 (replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一
DNA 分子,也称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA
(recombinant DNA) 。
目 录生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程等目的
① 分离获得某一感兴趣的基因或 DNA
② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
基因工程 (genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称 重组 DNA工艺学 。
目 录
（二）工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶 Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶目 录重组 DNA技术中常用的工具酶工 具 酶 功 能限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割 DNA
DNA连接酶 催化 DNA中相邻的 5′磷酸基和 3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA切口封合或使两个 DNA分子或片段连接
DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成双链 cDNA分子或片段连接
② 缺口平移制作高比活探针
③ DNA序列分析
④ 填补 3′末端
Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 53?
聚合,35?外切活性，而无 53?外切活性。常用于
cDNA第二链合成，双链 DNA 3?末端标记等反转录酶 ① 合成 cDNA
② 替代 DNA聚合酶 I进行填补，标记或 DNA序列分析多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶 在 3′羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶 切除末端磷酸基目 录限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease,
RE)是 识别 DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶 。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
Bam HⅠ
目 录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源 DNA,保护自身 DNA。
分类
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ
（基因工程技术中常用 Ⅱ 型）
目 录第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。
命名
Hin dⅢ
属 系 株 序
Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌 d株的第三种酶目 录
Ⅱ 类酶识别序列特点 —— 回文结构 (palindrome)
切口,平端切口,粘端切口
GGATCC
CCTAGG
目 录
Bam HⅠ
GTC
CAG
G
CCTAG
GATCC
G+
GGATCC
CCTAGG
HindⅡ
GTCGAC
CAGCTG
GAC
CTG+
平端切口 粘端切口目 录同功异源酶来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称 同功异源酶 。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
Bam HⅠ
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
BstⅠ
目 录同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割 DNA后,产生相同的粘性末端,
称为 同尾酶 。 这两个相同的粘性末端称为 配伍未端 (compatible end)。
Bam HⅠ Bg lⅡ
GGATCC
CCTAGG
AGATCT
TCTAGA
G
CCTAG
GATCC
G+
+ATCTAG GATCTA
目 录
（三）目的基因
cDNA (complementary DNA)
基因组 DNA (genomic DNA)
目 录
（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。
常用载体质粒 DNA
噬菌体 DNA
病毒 DNA
目 录克隆载体 (cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体称为 克隆载体 。
表达载体 (expression vector)
为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为 表达载体 。
目 录载体的选择标准
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源 DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
分子量小，以容纳较大的外源 DNA。
目 录
1,质粒 (plasmid)
特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状 。
目 录目 录目 录
λ噬菌体 DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用 cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
2,噬菌体 (phage)
M13噬菌体 DNA改造系统（含 lacZ基因）
M13mp系列
pUC系列目 录
3,粘性质粒 (cosmid)
目 录酵母人工染色体
(yeast artificial chromosome,YAC)
细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome,BAC)
动物病毒 DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
其他目 录二,重组 DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取
DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选 克隆基因的表达以质粒为载体的
DNA
克隆过程目 录目 录
（一）目的基因的获取
1,化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。
2.基因组 DNA文库 (genomic DNA library)
3,cDNA文库 (cDNA library)
4,聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)
（见第 22章）
目 录
* 化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的 DNA序列组织或细胞染色体 DNA
基因片断克隆载体重组 DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组 DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA的集合
* 从基因组 DNA文库获取目的基因目 录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段
cos L R cos
cos L
左臂
R cos
右臂真核生物染色体 DNA
限制酶部分消化外源 DNA与载体 DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌
~20 Kb DNA 片段
cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段基因文库目 录
mRNA
cDNA
双链 cDNA
重组 DNA分子
cDNA文库反转录酶载体受体菌复制
* 从 cDNA文库获取目的基因逆转录酶
A A A A
T T T T
AAAA
SI核酸酶
DNA聚合酶 Ⅰ
碱水解
T T T T
目 录目 录
（三）外源基因与载体的连接
1,粘性末端连接方式,(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接
（二）克隆载体的选择和构建
Bam HⅠ 切割反应GGATCCCCTAGG
T4 DNA连接酶
15oC
GATCC
G
G
CCTAG
+
目的基因用 Bam HⅠ 切割
G
C C T A G
G
C C T A G
GATCC
G
GATCC
G
载体 DNA用 Bam HⅠ 切割
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
重组体
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
载体自连 目的基因自连同一限制酶切位点连接目 录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
G A A T T CC T T A A G A G A T C TT C T A G A
Eco RⅠ 切割位点
G
CT TA A
A
TC TAG
A A TT C
G
GA TC T
A
Bg lⅡ 切割位点
AA TT CG ATCT AG
AATTC
G
GATCT
A
AA TT CG ATCT AG+
EcoRⅠ + Bg lⅡ
双酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ双酶切
G
CT TA A
A
TC TAG
A A TT C
G
GA TC T
A
T4 DNA连接酶
15oC
重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。
目 录目 录
2,平端连接适用于,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶
T4 DNA连接酶
15oC
重组体 载体自连 目的基因自连目 录目 录
3,同聚物加尾连接在末端转移酶 (terminal transferase)的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、
制造出粘性末端，再进行粘端连接。
5′
3′
3′
5′
载体 DNA
5′
3′
3′
5′
目的基因限制酶或机械剪切 限制酶
5′
3′
3′
5′
5′
3′ T(T)nT
T(T)nT 3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′ A(A)nA
A(A)nA 3′
5′
λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶末端转移酶
+ dATP
末端转移酶
+ dTTP
T4 DNA连接酶
15oC
重组体目 录目 录
4,人工接头 (linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接 。
人工接头及其应用
CCGAATTCG
GGCTTAAGC
5′-
3′-
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
目 录目 录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 (competent)
导入方式转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（四）重组 DNA导入受体菌目 录
（五）重组体的筛选
1,直接选择法
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救 (marker rescue)
(3) 分子杂交法原位杂交
Southern印迹
2,免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
插入失活法)
抗药性标记选择目 录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成
λDNA
重组体标志补救目 录
α互补目 录
α
互补的检测目 录原位杂交目 录
Southern印迹目 录鸡的 β肌球蛋白的克隆和检出 目 录目 录重组 DNA技术操作过程可形象归纳为小 结分 分离目的基因切 限制酶切目的基因与载体接 拼接重组体转 转入受体菌筛 筛选重组体重组 DNA技术操作的主要步骤载体质粒 噬菌体 病毒目的基因（外源基因）
基因组 DNA cDNA 人工合成 PCR产物限制酶消化开环载体 DNA 目的基因连接酶重组体转化 体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交目 录目 录表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化
（六）克隆基因的表达目 录
1,原核表达体系 （ E.coli表达体系最为常用）
标准,选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组 DNA
不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion
body)
很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原 cDNA
的表达和分泌目 录目 录目 录优点,可表达克隆的 cDNA及真核基因组 DNA
可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点,操作技术难、费时、经济转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程方法,磷酸钙转染
DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射
2,真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体 pFASTBACI 的物理图谱 目 录目 录目 录
（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。
三、重组技术与医学的关系
（二）生 物制药重组 DNA医药产品产 品 功 能组织胞浆素原激活剂 抗凝血液因子 VIII 促进凝血颗粒细胞 -巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成促红细胞生成素 剌激白细胞生成生长因子 (bFGF,EGF) 刺激细胞生长与分化生长素 治疗侏儒症胰岛素 治疗糖尿病干扰素 (?1b,?2a,? 2b,?) 抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素 激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶 抗组织损伤单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗 (CHO,酵母 ) 预防乙肝口服重组 B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱目 录目 录基因诊断 (genetic diagnosis)是 利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在 DNA水平分析,鉴定遗传疾病所涉及基因的置换,缺失或插入等突变 。
（三）基因诊断基本过程区分或鉴定 DNA的异常分离、扩增待测的 DNA片断目 录标准
,能正确扩增靶基因；
,能准确区分单个碱基的差别；
,本底或噪声低，不干扰 DNA的鉴定 ;
,便于完全自动化操作，适合大面积、
大人群普查。
目 录
（四）基因治疗定义基因治疗 (gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
方式体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)
性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)
目 录
1,产前诊断
2,携带者测试
3,症候前诊断
4,遗传病易感性
（五）遗传疾病的预防
Genetic Recombination and Genetic
Engineering
第 十 四 章目 录目 录第 一 节
DNA的重组
DNA Recombination
目 录
DNA重组接合作用 (conjugation)
转化作用 (transformation)
转导作用 (transduction)
转 座 (transposition)
同源重组 (homologous recombination)
位点特异的重组 (site-specific recombination)
目 录发生在同源序列间的重组称为 同源重组
(homologous recombination),又称 基本重组 。
是最基本的 DNA重组方式,通过链的断裂和再连接,在两个 DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换 。
以 E.coli的同源重组为例,了解同源重组机制的 Holliday模型 。
一、同源重组目 录
Holliday模型中，同源重组主要 4个关键步骤
① 两个同源染色体 DNA排列整齐
②一个 DNA的一条链断裂、并与另一个 DNA
对应的链连接，形成 Holliday中间体
③通过分支移动产生异源双链 DNA
④ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体 DNA，分别为：
片段重组体 (patch recombinant)
拼接重组体 (splice recombinant)
目 录片段重组体 （见模型图左边产物）：
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本
DNA。
拼接重组体 （见模型图右边产物）：
切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本 DNA。
内切酶
(recBCD)
DNA侵扰
(recA)
分支迁移
(recA)
内切酶
(recBCD)
DNA
连接酶
5′ 3′
5′
3′5′
3′
5′3′
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′ 5′3′
5′ 3′
3′ 3′
5′3′
5′3′
3′5′
5′ 3′
5′3′
5′3′
Holiday中间体
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
目 录
Holiday中间体
5′ 3′
5′ 3′
5′3′
5′3′
5′
3′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′
5′
3′
3′
3′
3′
5′ 5′
5′5′ 3′
3′
3′
3′
内切酶
(ruvC)内切酶
(ruvC)
DNA
连接酶
DNA
连接酶片段重组体拼接重组体 目 录目 录二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用当细胞与细胞,或细菌通过菌毛相互接触时,质粒 DNA从一个细胞 （ 细菌 ） 转移至另一细胞 （ 细菌 ） 的 DNA转移称为 接合作用
(conjugation)。
目 录可接合质粒如 F 因子 (F factor)
质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链 DNA分子目 录
（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源 DNA，
使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型,
称为 转化作用 (transformation)。
目 录例,溶菌时，裂解的 DNA片段被另一细菌摄取。
目 录目 录
（三）转导作用当病毒从被感染的 （ 供体 ） 细胞释放出来,再次感染另一 （ 供体 ） 细胞时,发生在供体细胞与受体细胞之间的 DNA转移及基因重组即为 转导作用 (transduction)。
λ噬菌体的生活史溶菌生长途径
(lysis pathway)
溶源菌生长途径
(lysogenic pathway)
例目 录目 录目 录三,位点特异重组位点特异重组 (site-specific recombination)
是由整合酶催化,在两个 DNA序列的特异位点间发生的整合 。
例 （ 一 ） λ噬菌体 DNA的整合
λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒 整合酶 可特 异地识 别,整 合反转 录病毒
cDNA的 长末端重复序列 (long terminal repeat,
LTR)。
目 录例 （二）细菌的特异位点重组沙门氏菌 H片段倒位决定鞭毛相转变目 录
hix为反向重复序列,它们之间的 H片段可在 Hin控制下进行特异位点重组 (倒位 )。 H
片段上有两个启动子 P,其一驱动 hin基因表达,另一正向时驱动 H2和 rH1基因表达,反向 (倒位 )时 H2和 rH1不表达 。 rH1为 H1的阻遏蛋白基因 。
目 录
H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段
hin H2 I H1
H1鞭毛素
hin H2 I
DNA 启动序列
H1
启动序列沙门氏菌 H片段倒位决定鞭毛相转变目 录例 （三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白 (Ig),由两条轻链 (L链 )和两条重链 (H链 )组成,分别由三个独立的基因族编码,其中两个编码轻链 (?和?),一个编码重链 。
轻链的基因片段：
重链的基因片段：
L V J C
L V D J C
目 录重链 (IgH)基因的 V-D-J重排和轻链 (IgL)基因的 V-J重排均发生在特异位点上 。 在 V片段的下游,J片段的上游以及 D片段的两侧均存在保守的重组信号序列 (recombination signal
sequence,RSS) 。 此 重 排 的 重 组 酶 基 因 rag
(recombination activating gene)共有两个,分别产生蛋白质 RAG1和 RAG2。
CACAGTG(12/23)ACAAAAACC
GTGTCCAC TGTTTTTGG
重组信号序列基因片段
V片段 J片段RSS RSS
间插 DNA
OH
OH
V J
单链切开 RAG1RAG2
分子内转酯反应单链切开转移核苷酸修复、连接免疫球蛋白基因重排过程目 录目 录四、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为 转座 (transposition)。
目 录插入序列 (insertion sequences,IS)组成：
二个分离的反向重复 (inverted repeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（ transposase)编码基因
IR Transposase Gene IR
发生形式：
保守性转座 (conservative transposition)
复制性转座 (duplicative transposition)
（一）插入序列转座插入序列的复制性转座目 录目 录转座子 (transposons) —— 可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。
转座子组成,反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因
IR IRTransposase Gene 有用基因
（二）转座子转座目 录由转座子介导的转座目 录目 录第 二 节重组 DNA技术
DNA Recombination Technique
目 录重组 DNA技术的发展史
1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验
1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验
1973年 美国斯坦福大学的科学家构建 第一个 重组 DNA分子
1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上 第一家 遗传工程公司，专门应用重组 DNA技术制造医学上重要的药物。
1980年 开始建造 第一家 应用重组 DNA技术生产胰岛素的工厂
1997年 英国罗林研究所成功的克隆了 多莉目 录
相关概念
DNA克隆
工具酶
目的基因
基因载体
基本原理
重组 DNA技术与医学的关系本节主要内容目 录一,重组 DNA技术相关概念克隆 (clone)
来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为 克隆化 (cloning)，
即 无性繁殖 。
（一） DNA克隆目 录技术水平,分子克隆 (molecular clone)
即 DNA 克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）
目 录
DNA克隆应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传物质 （ 同源的或异源的,原核的或真核的,天然的或人工的 DNA） 与载体 DNA接合成一具有自我复制能力的 DNA分子 —— 复制子 (replicon),继而通过转化或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子细胞,再进行扩增提取获得大量同一
DNA 分子,也称 基 因 克 隆 或 重 组 DNA
(recombinant DNA) 。
目 录生物技术工程,基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程等目的
① 分离获得某一感兴趣的基因或 DNA
② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
基因工程 (genetic engineering) —— 实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
又称 重组 DNA工艺学 。
目 录
（二）工具酶
限制性核酸内切酶
DNA聚合酶 Ⅰ
逆转录酶
T4DNA连接酶
碱性磷酸酶
末端转移酶
Taq DNA聚合酶目 录重组 DNA技术中常用的工具酶工 具 酶 功 能限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割 DNA
DNA连接酶 催化 DNA中相邻的 5′磷酸基和 3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使 DNA切口封合或使两个 DNA分子或片段连接
DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成双链 cDNA分子或片段连接
② 缺口平移制作高比活探针
③ DNA序列分析
④ 填补 3′末端
Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 53?
聚合,35?外切活性，而无 53?外切活性。常用于
cDNA第二链合成，双链 DNA 3?末端标记等反转录酶 ① 合成 cDNA
② 替代 DNA聚合酶 I进行填补，标记或 DNA序列分析多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5′羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶 在 3′羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶 切除末端磷酸基目 录限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease,
RE)是 识别 DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链 DNA的一类内切酶 。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
Bam HⅠ
目 录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源 DNA,保护自身 DNA。
分类
Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ
（基因工程技术中常用 Ⅱ 型）
目 录第一个字母取自产生该酶的细菌属名,用大写；
第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；
第四个字母代表株；
用罗马数字表示发现的先后次序。
命名
Hin dⅢ
属 系 株 序
Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌 d株的第三种酶目 录
Ⅱ 类酶识别序列特点 —— 回文结构 (palindrome)
切口,平端切口,粘端切口
GGATCC
CCTAGG
目 录
Bam HⅠ
GTC
CAG
G
CCTAG
GATCC
G+
GGATCC
CCTAGG
HindⅡ
GTCGAC
CAGCTG
GAC
CTG+
平端切口 粘端切口目 录同功异源酶来源不同的限制酶,但能识别和切割同一位点,这些酶称 同功异源酶 。
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
Bam HⅠ
GGATCC
CCTAGG
G
CCTAG
GATCC
G+
BstⅠ
目 录同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割 DNA后,产生相同的粘性末端,
称为 同尾酶 。 这两个相同的粘性末端称为 配伍未端 (compatible end)。
Bam HⅠ Bg lⅡ
GGATCC
CCTAGG
AGATCT
TCTAGA
G
CCTAG
GATCC
G+
+ATCTAG GATCTA
目 录
（三）目的基因
cDNA (complementary DNA)
基因组 DNA (genomic DNA)
目 录
（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。
常用载体质粒 DNA
噬菌体 DNA
病毒 DNA
目 录克隆载体 (cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意设计的载体称为 克隆载体 。
表达载体 (expression vector)
为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为 表达载体 。
目 录载体的选择标准
能自主复制；
具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
有克隆位点（外源 DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；
分子量小，以容纳较大的外源 DNA。
目 录
1,质粒 (plasmid)
特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状 。
目 录目 录目 录
λ噬菌体 DNA改造系统
λgt系列（插入型，适用 cDNA克隆）
EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）
2,噬菌体 (phage)
M13噬菌体 DNA改造系统（含 lacZ基因）
M13mp系列
pUC系列目 录
3,粘性质粒 (cosmid)
目 录酵母人工染色体
(yeast artificial chromosome,YAC)
细菌人工染色体
(bacterial artificial chromosome,BAC)
动物病毒 DNA改造的载体
（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
其他目 录二,重组 DNA技术基本原理基本原理目的基因的获取
DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选 克隆基因的表达以质粒为载体的
DNA
克隆过程目 录目 录
（一）目的基因的获取
1,化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。
2.基因组 DNA文库 (genomic DNA library)
3,cDNA文库 (cDNA library)
4,聚合酶链反应 (polymerase chain reaction,PCR)
（见第 22章）
目 录
* 化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的 DNA序列组织或细胞染色体 DNA
基因片断克隆载体重组 DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组 DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组 DNA的集合
* 从基因组 DNA文库获取目的基因目 录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段
cos L R cos
cos L
左臂
R cos
右臂真核生物染色体 DNA
限制酶部分消化外源 DNA与载体 DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌
~20 Kb DNA 片段
cos L R cos~20 Kb 外源 DNA 片段基因文库目 录
mRNA
cDNA
双链 cDNA
重组 DNA分子
cDNA文库反转录酶载体受体菌复制
* 从 cDNA文库获取目的基因逆转录酶
A A A A
T T T T
AAAA
SI核酸酶
DNA聚合酶 Ⅰ
碱水解
T T T T
目 录目 录
（三）外源基因与载体的连接
1,粘性末端连接方式,(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接
（二）克隆载体的选择和构建
Bam HⅠ 切割反应GGATCCCCTAGG
T4 DNA连接酶
15oC
GATCC
G
G
CCTAG
+
目的基因用 Bam HⅠ 切割
G
C C T A G
G
C C T A G
GATCC
G
GATCC
G
载体 DNA用 Bam HⅠ 切割
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
重组体
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
G
C C T A G
G
C C T A G
G A T C C
G
G A T C C
G
载体自连 目的基因自连同一限制酶切位点连接目 录不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接
G A A T T CC T T A A G A G A T C TT C T A G A
Eco RⅠ 切割位点
G
CT TA A
A
TC TAG
A A TT C
G
GA TC T
A
Bg lⅡ 切割位点
AA TT CG ATCT AG
AATTC
G
GATCT
A
AA TT CG ATCT AG+
EcoRⅠ + Bg lⅡ
双酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ双酶切
G
CT TA A
A
TC TAG
A A TT C
G
GA TC T
A
T4 DNA连接酶
15oC
重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。
目 录目 录
2,平端连接适用于,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶
T4 DNA连接酶
15oC
重组体 载体自连 目的基因自连目 录目 录
3,同聚物加尾连接在末端转移酶 (terminal transferase)的作用下，在 DNA片段末端加上同聚物序列、
制造出粘性末端，再进行粘端连接。
5′
3′
3′
5′
载体 DNA
5′
3′
3′
5′
目的基因限制酶或机械剪切 限制酶
5′
3′
3′
5′
5′
3′ T(T)nT
T(T)nT 3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′ A(A)nA
A(A)nA 3′
5′
λ-核酸外切酶 λ-核酸外切酶末端转移酶
+ dATP
末端转移酶
+ dTTP
T4 DNA连接酶
15oC
重组体目 录目 录
4,人工接头 (linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接 。
人工接头及其应用
CCGAATTCG
GGCTTAAGC
5′-
3′-
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
Eco RⅠ
目 录目 录受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态 (competent)
导入方式转化 (transformation)
转染 (transfection)
感染 (infection)
（四）重组 DNA导入受体菌目 录
（五）重组体的筛选
1,直接选择法
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救 (marker rescue)
(3) 分子杂交法原位杂交
Southern印迹
2,免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等
(
插入失活法)
抗药性标记选择目 录组氨酸缺陷型大肠杆菌无组氨酸的培养基酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因促进组氨酸合成
λDNA
重组体标志补救目 录
α互补目 录
α
互补的检测目 录原位杂交目 录
Southern印迹目 录鸡的 β肌球蛋白的克隆和检出 目 录目 录重组 DNA技术操作过程可形象归纳为小 结分 分离目的基因切 限制酶切目的基因与载体接 拼接重组体转 转入受体菌筛 筛选重组体重组 DNA技术操作的主要步骤载体质粒 噬菌体 病毒目的基因（外源基因）
基因组 DNA cDNA 人工合成 PCR产物限制酶消化开环载体 DNA 目的基因连接酶重组体转化 体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交目 录目 录表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化
（六）克隆基因的表达目 录
1,原核表达体系 （ E.coli表达体系最为常用）
标准,选择标志 强启动子翻译调控序列 多接头克隆位点
E.coli表达体系的不足不宜表达真核基因组 DNA
不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion
body)
很难表达大量可溶性蛋白大鼠胰岛素原 cDNA
的表达和分泌目 录目 录目 录优点,可表达克隆的 cDNA及真核基因组 DNA
可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点,操作技术难、费时、经济转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程方法,磷酸钙转染
DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射
2,真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞表达载体 pFASTBACI 的物理图谱 目 录目 录目 录
（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。
三、重组技术与医学的关系
（二）生 物制药重组 DNA医药产品产 品 功 能组织胞浆素原激活剂 抗凝血液因子 VIII 促进凝血颗粒细胞 -巨噬细胞集落剌激因子 剌激白细胞生成促红细胞生成素 剌激白细胞生成生长因子 (bFGF,EGF) 刺激细胞生长与分化生长素 治疗侏儒症胰岛素 治疗糖尿病干扰素 (?1b,?2a,? 2b,?) 抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素 激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶 抗组织损伤单克隆抗体 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗乙肝疫苗 (CHO,酵母 ) 预防乙肝口服重组 B亚单位菌体霍乱菌苗 预防霍乱目 录目 录基因诊断 (genetic diagnosis)是 利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在 DNA水平分析,鉴定遗传疾病所涉及基因的置换,缺失或插入等突变 。
（三）基因诊断基本过程区分或鉴定 DNA的异常分离、扩增待测的 DNA片断目 录标准
,能正确扩增靶基因；
,能准确区分单个碱基的差别；
,本底或噪声低，不干扰 DNA的鉴定 ;
,便于完全自动化操作，适合大面积、
大人群普查。
目 录
（四）基因治疗定义基因治疗 (gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。
方式体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)
性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)
目 录
1,产前诊断
2,携带者测试
3,症候前诊断
4,遗传病易感性
（五）遗传疾病的预防
