第十四章 核酸类药物第一节 核酸类物质的分离提取及其发酵生产一,RNA与 DNA的提取与制备
(一) RNA的提取与制备
1.工业用 RNA的提取
( 1) RNA及其工业来源从微生物中提取 RNA是工业上最实际和有效的方法。
通常在细菌中 RNA占 5% -25%,在酵母中占 2.7%~ 15%,
在霉菌中占 0.7%~28%,面包酵母含 RNA4.1%~ 7.2%。
培养酵母菌体收率高,易于提取 RNA,在工业上主要由 RNA生产 5‘-核苷酸。
( 2)高 RNA含量酵母菌株的筛选可以从自然界筛选到 RNA含量高的酵母菌株,也可以用诱变育种的方法提高酵母菌的 RNA含量。
糖蜜 水糖蜜配料液水解水解液中和中和沉淀过滤清糖水种子揺瓶发酵种子培养物种子发酵种子发酵培养物连续发酵发酵液收集菌体酵母菌体酵母浆保温抽提 配料抽提液分离抽提清液酸化酸化液过滤
RNA
洗涤干燥
RNA干粉磨粉包装成品水洗涤发酵法生产高含量 RNA酵母及其 RNA提取工艺流程
( 3)用工业废水培养高含量 RNA酵母减少环境污染,降低粮食消耗
( 4) RNA的提取实例啤酒酵母是提取 RNA的很好的资源。
取 100g压榨啤酒酵母(含水 70% ),加入 230ml含 NaOH
3g的水,20℃ 以下搅拌 30min。用 6mol/L HCl调至 pH7,
搅拌 15分钟,离心得上清液 255ml。冷至 10℃ 以下,
6mol/L HCl调 pH2.5,置冷过夜,离心等 RNA1.8g(纯度 80%)。
(二) DNA的提取与制备
1.工业用 DNA的提取取新鲜冷冻鱼精 20kg,用绞肉机粉碎 2次成浆,加入等体积水,搅拌均匀,倾入反应锅内,缓慢搅拌,升温至
100 ℃,保温 15分钟,迅速冷却至 20~ 25 ℃,离心去除鱼精蛋白等沉淀物,共获得 35L含热变性 DNA溶液。
加乙醇沉淀,可得到固体 DNA产品。
2.具有生物活性 DNA的制备动物内脏加 4倍量生理盐水经组织捣碎机捣碎 1分钟,匀浆于 2500rpm离心 30分钟,沉淀用同样体积的生理盐水洗涤 3次,每次洗涤后离心,将沉淀悬浮于 20倍量的冷生理盐水中,再捣碎 3分钟,加入 2倍量 5%十二烷基磺酸钠,并搅拌 2~ 3小时,在 0 ℃ 2500rpm离心,在上层液中加入等体积的冷乙醇,离心即可得纤维状 DNA,
再用冷乙醇和丙酮洗涤,减压低温干燥得粗品 DNA。
二、用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸
(一)酶解法及碱水解法制备核苷酸
1.酶解法制备脱氧核苷酸桔青霉或熄曲霉液体培养 2天发酵液压滤除菌体酶液酶解液鱼精绞肉机粉碎鱼精匀浆热变性 冷却,过滤
DNA溶液加热使酶失活,调 pH9.0置冷过夜,过滤
DNA降解液吸附于氯型阴离子交换树脂分步洗脱脱氧胞苷酸
dCMP
脱氧腺苷
dAMP
脱氧胸苷酸
dTMP
脱氧鸟苷酸
dGMP
混合,调 pH
保温
2.酶解法制备戊糖核苷酸桔青霉 M843培养产生核酸酶 P1
酵母提取
RNA
RNA降解成 5‘-核苷酸阳离子树脂分离无离子水洗涤
UMP浑浊液除盐等杂质 UMP
UMP稀溶液
UMP干粉
GMP,CMP混和液
GMP浓溶液
GMP干粉
CMP稀溶液
GMP浓溶液
GMP干粉
AMP稀溶液
AMP浓溶液
AMP干粉流出液 pH1.5
CMP溶液
2.0~3.5 3.5~4.0 3.5~4.5
碳柱吸附,解析阴离子树脂乙醇沉淀阴离子树脂阴离子树脂乙醇沉淀 乙醇沉淀乙醇沉淀减压浓缩
3.双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸( I+ G)
呈味核苷酸桔青霉 M843培养产生核酸酶 P1
曲霉 M1197培养产生 AMP脱氨霉
RNA降解,AMP脱氨 RNA溶解,调 pH升温阳树脂分离( I+ G)
减压浓缩乙醇结晶干燥产品( I+ G)
4.菌体自溶法生产核苷酸谷氨酸发酵液 离心 湿菌体 自溶
pH10
菌体自溶液除盐无盐提取液 离心 清液pH3.5
阴阳离子交换树脂 单核苷酸纯化液浓缩 浓缩液 结晶 结晶单核苷酸
5.碱水解法生产 2‘,3’-混合核苷酸
RNA中的磷酸二酯键对碱性条件不稳定的特性,很容易生成 2‘,3’-环状磷酸酯,水解生成 2‘,3’-核苷酸。
取 RNA配成 3%~ 3.5%的水溶液,加氢氧化钠达
0.3mol/L浓度,升温 38C,保温 16-20小时,用 6mol/L盐酸中和至 pH7.0,从 RNA水解成 2‘,3’-核苷酸降解率达 95%以上。
(二)发酵法生产核苷酸
1.发酵法生产肌苷酸( IMP)
肌苷酸钠是一种高效增鲜剂,在谷氨酸钠中添加 2%,鲜度可以增加 3倍。
2.发酵法生产黄苷酸( XMP)及酶法转化成鸟苷酸
(三)半合成法制备核苷酸三、核苷的制备
(一) RNA化学水解法制备核苷
(二)发酵法生产核苷
1.发酵法生产肌苷
2.发酵法生产鸟苷和黄苷
3.发酵法生产腺苷第二节 核酸类药物核酸类药物可分为两类:一类为具有天然结构的核酸类物质,有助于改善机体的物质代谢和能量平衡,加速受损组织的修复,促进缺氧组织恢复正常生理机能。
临床上用于放射病,血小板减少症,急慢性肝炎,心血管疾病,肌肉萎缩等代谢障碍。如肌苷,ATP,辅酶 A,脱氧核苷酸,肌苷酸等第二类为自然结构碱基、核苷、核苷酸结构的类似物或聚合物,这一类核酸类药物是当今治疗病毒,肿瘤,
艾滋病得重要手段,也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。已经正式在临床应用的 8个抗病毒核苷酸类药物。
O
O H
OH
NH
N
O
O
C F
3
O
OH
NH
N
O
O
C H
3
N
3
O
OH
NH
N
O
O
I
O H
N N
N
O
OH
O H
NH
2
O
O H
N
N
N H
N
O H
NH
2
O
O H
N
N
N H
N
O H
NH
2
O C H
2
O H
C H
2
O HH
O
OH
N
N
N H
N
O H
OH
O
OH
N
N
N H
N
O H
NH
2
O H
O H
三氟 代 胸苷叠氮 胸苷 5'- 碘脱氧 尿 苷三氮唑核苷无环鸟 苷 丙氧 鸟 苷阿糖腺苷双 脱氧 肌苷一、叠氮胸苷( AZT)
(一)结构与性质
AZT治疗艾滋病的新药。化学名为 3‘-叠氮- 2’-脱氧胸腺嘧啶核苷,商品名为 Refrovir。
68%的病人临床表现为减轻症状,延长寿命的显著效果,
常见副作用为贫血,白血球减少,部分病人骨髓坏死等。
AZT的药理作用是在体内经磷酸化后生成了 3‘-叠氮- 2’
-脱氧胸腺嘧啶核苷酸,取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒 DNA的合成,含有 AZT成分 DNA不能继续复制,从而达到阻止病毒增殖的目的。
(二)生产工艺
O
O H
OH
NH
N
O
C H
3
O
O
O H
T r O
NH
N
O
C H
3
O
O
O M S
T r O
NH
N
O
C H
3
O
O
T r O
NH
N
O
C H
3
O
O
T r O
NH
N
O
C H
3
O
O H
O
T r O
NH
N
O
C H
3
O
O M S
O
T r O
NH
N
O
C H
3
O
N
3
O
OH
NH
N
O
C H
3
O
N
3
Tr
2
Cl
-
吡啶
MS - Cl

0 ℃,吡 啶乙 醇,N aO H
加热乙醇氢 氧 化钠
MS - Cl

0 ℃,吡 啶
LiN
3
,90 -95 ℃
D MF
80 %醋 酸 回 流
AZT
T r 三苯 甲 烷 基 MS 甲 基磺 酰基二、阿糖腺苷
(一)结构与性质阿糖腺苷的化学名称为 9- β- D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤。
阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱 DNA病毒抑制剂,对单纯疱疹 ⅠⅡ 型,带状疱疹,巨细,牛痘等 DNA病毒,
在体内外都有明显抑制作用。
阿糖腺苷在体内受激酶作用生成阿糖腺三磷,是脱氧腺三磷( dATP)的拮抗物,从而抑制了以 dATP为底物的病毒 DNA聚合酶的活力。
(二)生产工艺
O
OH
NH
N
O
O
O H O H
O
OH
NH
N
O
O
O H
OH
O
OH
O H
OH
P
N
H
N
N
N
N H
2
O
OH
O H
OH
N
N
N
N
N H
2
鸟苷
PO C l
3
D MF
H
2
O
p H 9,0
嘧啶核苷 磷 酸 化酶阿糖腺苷嘌 呤 核苷 酸磷 酸 化酶三、三氮唑核苷( Ribavirin,利巴伟林)
(一)结构与性质三氮唑核苷商品名病毒唑,对 DNA病毒,RNA病毒都具有广泛作用。
三氮唑核苷除了主要应用于小儿呼吸系统的疾病治疗以外,已用于猩红热,流感以及爱滋病的治疗,特别是在临床上能明显改善患者症状,而且毒副作用比 AZT
小,药物价格与 AZT相差 50倍。
在体内被磷酸化成三氮唑核苷酸,抑制肌苷酸脱氧酶阻断鸟苷酸的生物合成,从而抑制病毒 DNA合成。
(二)生产工艺
O
OH
O H O H
NH
O
NO
O
OH
O H O H
P
N N
H
NNH 2
O
O
OH
O H O H
N N
NNH 2
O
py np ase