第三章 生物制药工艺技术的发展第一节 生物制药工艺的发展一、生物药物类型与品种的发展
（一）生化药物
1.治疗酶与诊断用酶
（ 1）超氧化物歧化酶（ SOD）
抗炎、抗辐射、抗衰老
（ 2）凝血酶
（ 3） L－天冬酰胺酶
（ 4）尿激酶
（ 5） PEG－腺苷脱氨酶 （治疗免疫缺陷症）
（ 6） β－半乳糖苷酶（用于生产无糖牛奶）
2.核苷和核苷酸类药物
（ 1）叠氮脱氧胸苷（ AZT）（治疗爱滋病）
(2)丙氧鸟苷（ DHPG）（抗病毒）
3.多糖类药物
（ 1）肝素钙与小分子量肝素 （抗凝血）
（ 2）透明质酸（化妆品，关节炎）
4.蛋白质与多肽类药物
（ 1）水蛭素（抗凝血，防血栓）
（ 2）转移因子（如牛脾转移因子，胎盘转移因子等，免疫）
（ 3）胸腺制剂（抗肝炎，免疫）
（ 4）肝细胞生长因子（治疗肝炎）
5.脂类药物（ β－胡萝卜素,EPA,DHA）
（二）基因工程药物
（ 1）乙肝疫苗
（ 2）人白细胞干扰素（ IFN）
（ 3）基因工程人胰岛素
（ 4）人白细胞介素（ IL－ 2）
（ 5）人生长激素（ hGH）
（ 6）人组织纤溶酶原激活剂（ htPA）
（ 7）人促红细胞生成素（ hEPO）
（ 8）细胞集落刺激因子（ CSFs）
（三）细胞工程产品主要动物细胞培养产品有,α干扰素,γ干扰素,EPO,IL
－ 2及尿激酶等；植物细胞培养产品：罗汉果，洋地黄，
延胡索，人参，贝母，紫杉，紫草组织培养等。
各种单克隆抗体。
二、生化分离制备技术的发展
（一）生物反应器生物反应器包括微生物细胞大规模培养的发酵罐和动物细胞大规模的培养罐及用于固定化酶或固定化细胞进行连续自动化转化生化物质的各种生物催化反应器。
用于微生物细胞培养的生物反应器：
搅拌通气的反应器气升式反应器喷射自吸式反应器用于多糖及脂肪酶发酵生产的 离心式生物反应器用于乳酸发酵的 螺旋管式连续发酵连续培养 光合细胞的反应器动物细胞培养器用于固定化酶或固定化细胞生物反应器采用 固定床和沸腾床 。
（二）生物药物下游加工技术错流超滤，高效液相色谱，亲和色谱，色层层析等。
快速蛋白液相色谱系统。
（三）膜分离技术超滤技术，已用于酶发酵工业的纯化和浓缩。
三、生物工程技术在生物制药工业中的应用
（一）酶工程技术第一代酶 — 酶制剂第二代酶 — 固定化酶第三代酶 — 固定化多酶（包含辅因子再生系统）
1.酶的固定化方法酶的固定化方法有下述 4种：吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法
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吸附法 共价结合法 交联法 包埋法
（ 1）吸附法吸附法分为物理吸附法与离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但吸着在载体上的酶，
易于脱落，使用价值少。
离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水不溶性载体结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。
离子吸附法常用的载体有：
1)阴离子树脂，如 DEDA-C,ECTEOLA-纤维素,TEAE－
纤维素,DEAE－葡聚糖凝胶,Amberlite CG－ 50,IRC
－ 50,IR－ 120,IR－ 200,Dowex－ 50等。
例,DEAE－ Sephadex A-25 吸附氨基酰化酶
（ 2）包埋法包埋法系将酶包埋于凝胶或高分子聚合物网格内，网格可以防止酶的渗出，底物仍能渗入网格内与酶相接触。
包埋法的优点是酶分子本身不参与水不溶性网格的形成，许多酶都可用此法固定化。其操作简单，酶分子只是被保埋起来，而未受到化学反应，因此固定化酶表现活力较高。
常用的报埋剂有聚丙烯酰胺，卡拉胶，淀粉凝胶，三醋酸纤维素，海藻酸，胶原，血纤维，大豆蛋白等。
例：卡拉胶保埋细胞生产苹果酸
（ 3）共价键结合法共价键结合法是通过化学反应使酶与聚合物载体共价偶联。酶与载体共价结合的功能团包括氨基，羧基，酚羟基，巯基，羟基，咪唑基。
常用共价键结合法有：重氮化法，烷基化和芳基化法，
戊二醛结合反应法，钛螯合法，硫醇－二硫化物的互换反应等。 固定化糖化酶
（ 4）肽键结合法该法主要将含羧基的水不溶性载体变成酰基叠氮，异氰酸盐，卤化物等衍生物，再使这些衍生物与酶的游离氨基进行反应，形成肽键。
（ 5）交联法交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。由于酶蛋白的功能基团，如氨基，
酚基，巯基，和咪唑基，参与交联反应，因此可能影响酶的活性中心结构，而使酶活力显著失活。交联剂有多种，主要为戊二醛。
在固定化酶的基础上，固定化细胞技术得到迅速发展，其实际应用速度已超过固定化酶。固定化细胞具有更多的优点，
它省去酶的分离操作。在细胞内，酶稳定性较高，进行固定化时，活力丧失较少，且能利用天然存在的多酶体系，制造成本更低。但是反应产物与底物必须容易透过细胞膜。
2.酶工程技术的应用固定化酶和固定化细胞在食品发酵工业和制药工业方面的应用，不仅可以改革现有的生产工艺，而且可以创新多酶反应工艺，还可以促使发酵工业发生根本性变革，因此在制药工业中的应用具有很大潜力。
（二）细胞培养技术
1.动物细胞培养技术及其应用动物细胞的培养是将来自动物体的某些组织或器官，在模拟体内生理条件下，在体外进行培养，使之存活和生长。
（ 1）动物细胞培养条件营养条件 培养基（人工合成，半人工合成）
pH条件 7.2-7.4
温度条件 37± 0.5℃
气体条件 O2和 CO2
渗透压无菌条件
（ 2）培养方法体外培养细胞有原代培养与传代培养两种方法。
原代培养法有单层培养法和组织块培养法。
传代培养是将原代培养的细胞进行稀释分瓶继续培养。
（ 3）动物细胞大批培养技术许多有价值得蛋白质，多肽制品都可以用动物细胞大规模培养技术进行生产，如病毒疫苗，干扰素，单克隆抗体等。因此动物细胞培养技术正向大型化，自动化和精巧化方向发展。
①微载体培养系统微载体培养是细胞培养附着和生长在微载体表面。
②气升式深层发酵罐法
③中空纤维法
④微囊法将活细胞悬浮在海藻酸钠中，滴入氯化钙溶液中，形成小珠，用长链氨基酸聚合物聚赖氨酸，形成多孔外膜，然后重新液化胶化小球，使成胶物质从多孔外膜流出，活细胞留在膜内，然后进行培养。
（ 4）动物细胞培养技术的应用 （人生长激素，乙型肝炎疫苗）
2.植物细胞的培养及其应用
（ 1）植物细胞的培养技术植物细胞培养是将植物体的某一部分经无菌处理后置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。
用于进行培养所需的植物部分成为外殖体。所形成的脱分化的细胞团称为愈伤组织。将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养即为悬浮培养。
培养基大量无机盐，植物激素等
（ 2）植物组织培养的应用植物细胞培养技术有着广泛应用，尤其在天然药物的生产上具有广阔前景。如长春碱、地高辛，
（三）单克隆抗体技术
1.单克隆抗体的制备原理
B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决定族的特异性抗体，一个机体可产生多达 100万种特异性的抗体。但是一个 B细胞却只能分泌一种特异性抗体。例如，小鼠
B细胞受乙肝病毒刺激后，可产生针对乙肝病毒的 7种不同标志的特异性抗体，它们分别由 7种小鼠 B细胞产生。
这些 B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，形成 7种杂交瘤细胞，稀释纯化，挑出单个杂交瘤细胞，进行无性繁殖
（克隆）。同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合并分泌的特异性抗体质地均一，这种抗体称之为单克隆抗体。
2.单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。
（ 1）杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养罐，微囊发酵罐培养基：牛淋巴液，血清
（ 2）单抗的分离纯化（超滤、盐析、离子交换,HPLC等）
（ 3）单克隆抗体的制剂技术
3.单克隆抗体的应用
（四）基因工程技术基因工程实际上包括了体外基因工程（ DNA体外重组）和体内基因工程（ DNA体内重组）两种方式。一般指体外基因工程。
1.基因工程的基本程序基因工程操作程序包括取得目的基因，将目的基因同载体连接构建成 DNA重组体，再将经过重组的 DNA转化导入受体细胞（宿主细胞），并使目的基因和载体上其它基因地形状得以表达（即基因转录和翻译为目的蛋白）
见图 p57
（五）生物合成技术
1.利用微生物代谢产物的药物
（ 1）醇酮类药物：如乙醇，丁醇，丙醇及甘油。
（ 2）有机酸类药物：如醋酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸
（ 3）维生素类药物
（ 4）氨基酸类药物
（ 5）生物碱类药物
（ 6）抗生素
2.半合成药物第二节 生物药物制剂工艺的发展生物药物剂型的开发主要方向为控释性，靶向性，脂质体，微囊剂等。
（一）生化药物
1.治疗酶与诊断用酶
（ 1）超氧化物歧化酶（ SOD）
抗炎、抗辐射、抗衰老
（ 2）凝血酶
（ 3） L－天冬酰胺酶
（ 4）尿激酶
（ 5） PEG－腺苷脱氨酶 （治疗免疫缺陷症）
（ 6） β－半乳糖苷酶（用于生产无糖牛奶）
2.核苷和核苷酸类药物
（ 1）叠氮脱氧胸苷（ AZT）（治疗爱滋病）
(2)丙氧鸟苷（ DHPG）（抗病毒）
3.多糖类药物
（ 1）肝素钙与小分子量肝素 （抗凝血）
（ 2）透明质酸（化妆品，关节炎）
4.蛋白质与多肽类药物
（ 1）水蛭素（抗凝血，防血栓）
（ 2）转移因子（如牛脾转移因子，胎盘转移因子等，免疫）
（ 3）胸腺制剂（抗肝炎，免疫）
（ 4）肝细胞生长因子（治疗肝炎）
5.脂类药物（ β－胡萝卜素,EPA,DHA）
（二）基因工程药物
（ 1）乙肝疫苗
（ 2）人白细胞干扰素（ IFN）
（ 3）基因工程人胰岛素
（ 4）人白细胞介素（ IL－ 2）
（ 5）人生长激素（ hGH）
（ 6）人组织纤溶酶原激活剂（ htPA）
（ 7）人促红细胞生成素（ hEPO）
（ 8）细胞集落刺激因子（ CSFs）
（三）细胞工程产品主要动物细胞培养产品有,α干扰素,γ干扰素,EPO,IL
－ 2及尿激酶等；植物细胞培养产品：罗汉果，洋地黄，
延胡索，人参，贝母，紫杉，紫草组织培养等。
各种单克隆抗体。
二、生化分离制备技术的发展
（一）生物反应器生物反应器包括微生物细胞大规模培养的发酵罐和动物细胞大规模的培养罐及用于固定化酶或固定化细胞进行连续自动化转化生化物质的各种生物催化反应器。
用于微生物细胞培养的生物反应器：
搅拌通气的反应器气升式反应器喷射自吸式反应器用于多糖及脂肪酶发酵生产的 离心式生物反应器用于乳酸发酵的 螺旋管式连续发酵连续培养 光合细胞的反应器动物细胞培养器用于固定化酶或固定化细胞生物反应器采用 固定床和沸腾床 。
（二）生物药物下游加工技术错流超滤，高效液相色谱，亲和色谱，色层层析等。
快速蛋白液相色谱系统。
（三）膜分离技术超滤技术，已用于酶发酵工业的纯化和浓缩。
三、生物工程技术在生物制药工业中的应用
（一）酶工程技术第一代酶 — 酶制剂第二代酶 — 固定化酶第三代酶 — 固定化多酶（包含辅因子再生系统）
1.酶的固定化方法酶的固定化方法有下述 4种：吸附法，包埋法，共价键结合法，交联法
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吸附法 共价结合法 交联法 包埋法
（ 1）吸附法吸附法分为物理吸附法与离子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力损失很少，但吸着在载体上的酶，
易于脱落，使用价值少。
离子吸附法是将酶与含有离子交换剂的水不溶性载体结合，酶吸附于载体上较为牢固，在工业上用途颇广。
离子吸附法常用的载体有：
1)阴离子树脂，如 DEDA-C,ECTEOLA-纤维素,TEAE－
纤维素,DEAE－葡聚糖凝胶,Amberlite CG－ 50,IRC
－ 50,IR－ 120,IR－ 200,Dowex－ 50等。
例,DEAE－ Sephadex A-25 吸附氨基酰化酶
（ 2）包埋法包埋法系将酶包埋于凝胶或高分子聚合物网格内，网格可以防止酶的渗出，底物仍能渗入网格内与酶相接触。
包埋法的优点是酶分子本身不参与水不溶性网格的形成，许多酶都可用此法固定化。其操作简单，酶分子只是被保埋起来，而未受到化学反应，因此固定化酶表现活力较高。
常用的报埋剂有聚丙烯酰胺，卡拉胶，淀粉凝胶，三醋酸纤维素，海藻酸，胶原，血纤维，大豆蛋白等。
例：卡拉胶保埋细胞生产苹果酸
（ 3）共价键结合法共价键结合法是通过化学反应使酶与聚合物载体共价偶联。酶与载体共价结合的功能团包括氨基，羧基，酚羟基，巯基，羟基，咪唑基。
常用共价键结合法有：重氮化法，烷基化和芳基化法，
戊二醛结合反应法，钛螯合法，硫醇－二硫化物的互换反应等。 固定化糖化酶
（ 4）肽键结合法该法主要将含羧基的水不溶性载体变成酰基叠氮，异氰酸盐，卤化物等衍生物，再使这些衍生物与酶的游离氨基进行反应，形成肽键。
（ 5）交联法交联法是使用双功能或多功能试剂与酶分子之间进行分子间的交联反应的固定化方法。由于酶蛋白的功能基团，如氨基，
酚基，巯基，和咪唑基，参与交联反应，因此可能影响酶的活性中心结构，而使酶活力显著失活。交联剂有多种，主要为戊二醛。
在固定化酶的基础上，固定化细胞技术得到迅速发展，其实际应用速度已超过固定化酶。固定化细胞具有更多的优点，
它省去酶的分离操作。在细胞内，酶稳定性较高，进行固定化时，活力丧失较少，且能利用天然存在的多酶体系，制造成本更低。但是反应产物与底物必须容易透过细胞膜。
2.酶工程技术的应用固定化酶和固定化细胞在食品发酵工业和制药工业方面的应用，不仅可以改革现有的生产工艺，而且可以创新多酶反应工艺，还可以促使发酵工业发生根本性变革，因此在制药工业中的应用具有很大潜力。
（二）细胞培养技术
1.动物细胞培养技术及其应用动物细胞的培养是将来自动物体的某些组织或器官，在模拟体内生理条件下，在体外进行培养，使之存活和生长。
（ 1）动物细胞培养条件营养条件 培养基（人工合成，半人工合成）
pH条件 7.2-7.4
温度条件 37± 0.5℃
气体条件 O2和 CO2
渗透压无菌条件
（ 2）培养方法体外培养细胞有原代培养与传代培养两种方法。
原代培养法有单层培养法和组织块培养法。
传代培养是将原代培养的细胞进行稀释分瓶继续培养。
（ 3）动物细胞大批培养技术许多有价值得蛋白质，多肽制品都可以用动物细胞大规模培养技术进行生产，如病毒疫苗，干扰素，单克隆抗体等。因此动物细胞培养技术正向大型化，自动化和精巧化方向发展。
①微载体培养系统微载体培养是细胞培养附着和生长在微载体表面。
②气升式深层发酵罐法
③中空纤维法
④微囊法将活细胞悬浮在海藻酸钠中，滴入氯化钙溶液中，形成小珠，用长链氨基酸聚合物聚赖氨酸，形成多孔外膜，然后重新液化胶化小球，使成胶物质从多孔外膜流出，活细胞留在膜内，然后进行培养。
（ 4）动物细胞培养技术的应用 （人生长激素，乙型肝炎疫苗）
2.植物细胞的培养及其应用
（ 1）植物细胞的培养技术植物细胞培养是将植物体的某一部分经无菌处理后置于人工培养基上使其细胞增殖，进而按需要进行培养的技术。
用于进行培养所需的植物部分成为外殖体。所形成的脱分化的细胞团称为愈伤组织。将愈伤组织转移到液体培养基中进行培养即为悬浮培养。
培养基大量无机盐，植物激素等
（ 2）植物组织培养的应用植物细胞培养技术有着广泛应用，尤其在天然药物的生产上具有广阔前景。如长春碱、地高辛，
（三）单克隆抗体技术
1.单克隆抗体的制备原理
B细胞群受抗原刺激后能产生针对抗原决定族的特异性抗体，一个机体可产生多达 100万种特异性的抗体。但是一个 B细胞却只能分泌一种特异性抗体。例如，小鼠
B细胞受乙肝病毒刺激后，可产生针对乙肝病毒的 7种不同标志的特异性抗体，它们分别由 7种小鼠 B细胞产生。
这些 B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后，形成 7种杂交瘤细胞，稀释纯化，挑出单个杂交瘤细胞，进行无性繁殖
（克隆）。同一个克隆的杂交瘤细胞基因相同，合并分泌的特异性抗体质地均一，这种抗体称之为单克隆抗体。
2.单克隆抗体的工业化生产单克隆抗体的生产包括细胞培养、提纯和制剂等工艺过程。
（ 1）杂交瘤细胞的大规模培养生物反应器：气升式发酵罐，中空纤维培养罐，微囊发酵罐培养基：牛淋巴液，血清
（ 2）单抗的分离纯化（超滤、盐析、离子交换,HPLC等）
（ 3）单克隆抗体的制剂技术
3.单克隆抗体的应用
（四）基因工程技术基因工程实际上包括了体外基因工程（ DNA体外重组）和体内基因工程（ DNA体内重组）两种方式。一般指体外基因工程。
1.基因工程的基本程序基因工程操作程序包括取得目的基因，将目的基因同载体连接构建成 DNA重组体，再将经过重组的 DNA转化导入受体细胞（宿主细胞），并使目的基因和载体上其它基因地形状得以表达（即基因转录和翻译为目的蛋白）
见图 p57
（五）生物合成技术
1.利用微生物代谢产物的药物
（ 1）醇酮类药物：如乙醇，丁醇，丙醇及甘油。
（ 2）有机酸类药物：如醋酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸
（ 3）维生素类药物
（ 4）氨基酸类药物
（ 5）生物碱类药物
（ 6）抗生素
2.半合成药物第二节 生物药物制剂工艺的发展生物药物剂型的开发主要方向为控释性，靶向性，脂质体，微囊剂等。
