分离技术生物制药工艺学第四章到第十一章第四章 固相析出分离法改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分出的操作技术称为固相析出分离法。析出物为晶体时称为结晶；析出物为无定形固体称为沉淀法。固相析出法主要有盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，结晶法等。
盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。
盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。
有机溶剂沉淀法向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。
主要机理,（ 1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。
(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
等电点沉淀法两性电解质，在溶液 pH处于等电点（ pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，
分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的 pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。
结晶法改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。
（一）盐析结晶法这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。
（二）透析结晶
（三）有机溶剂结晶
（四）等电点结晶
（五）温度诱导结晶第五章 吸附法吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。
由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、
原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理 上样 吸附 洗杂 洗脱 再生常用吸附剂：
1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水 >乙醇 >甲醇 >乙酸乙酯 >丙酮 >氯仿。
2)人造沸石人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素 C的分离。
3)磷酸钙凝胶在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。
4)白陶土
5)氢氧化铝凝胶用于蛋白质及酶的分离。
6)氧化铝活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。
7)硅胶最常用
8)滑石粉 惰性 助滤剂
9)硅藻土 惰性 助滤剂
10)皂土
11)聚酰胺粉
12)大孔网格聚合物吸附树脂极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等第六章 离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。
X＋
X＋
X＋
X＋
X＋
X＋
Y＋
X＋
Z＋
X＋ Y＋
Z＋
Z＋
Y＋
Y＋
Y＋
X＋
Z＋
X＋
Z＋ X＋
Z＋
Z＋
X＋
X＋
X＋
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Y＋
Z＋ Ｘ
＋
Ｘ ＋
X＋
X＋
X＋
X＋
Ｚ ＋
X＋
Ｚ ＋
X＋
X＋ OH－ nX＋
平衡上样 吸附 洗杂 洗脱第七章 凝胶层析它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
V
C
大分子小分子
A
B
C
V0 Vi
GPC测分子量 Y=A+BX
第八章 亲和层析利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。
在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（ Ligand），
与配基结合的层析介质称为载体（ Matrix）
亲和层析的设计原理和过程：
1)配基固定化选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。
2)吸附样品亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。
3)样品洗脱选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质洗脱。
L S L
L
S＋
＋
S＋ S ＋ 杂质
S S＋
LL
L
L L
配基 样品配基固定化吸附样品样品洗脱第九章 离心技术沉降作用 — 悬浮液静置时，在重力作用下，密度大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉，成为沉降作用。
离心技术 — 在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。
相对离心力 — 通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号 × g或 g表示。
mg
rmN
R C F
3600
4 22?
第十章 膜分离技术分离范围 分离动力一般过滤 >1μm 压力差微孔过滤 0.01~ 1μ m 压力差透析 5~100? 分子扩散超级过滤 5~100? 压力差反渗透 <5? 压力差电渗析 <5? 电能第十一章 制备型高效液相色谱制备型 HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质
（ >0.1g）
HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱，
然后进行检测和分部收集。
泵 色谱柱检测器 色谱数据处理溶剂按固定相对样品的保留机理,HPLC大致可分为液固色谱，
键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱，
疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱等。
色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。
分离度 Rs
理论塔板数 N
容量因子 K’— 为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中得总摩尔数之比。
选择因子 α
t0
tR1 tR2
])()[(
2
1
21
12
bb
RR
S
WW
tt
R
2
2
1
)
2
(54.5
t
tN R
0
0'
t
ttk R
2
1
'
'
k
k
盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度的差异，通过向溶液中引入一定数量的中性盐，使目的物或杂蛋白以沉淀析出，达到纯化目的的方法。
盐析的机制：高浓度的中性盐溶液中存在着大量的带电荷的盐离子，它们能够中和生物分子表面的电荷，使之赖以稳定的双电层受损，从而破坏分子外围的水化层；另外，大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，从另一方面摧毁了水化层，使生物分子相互聚集而沉淀。
有机溶剂沉淀法向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。
主要机理,（ 1)亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质的介电常数，使得溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。
(2)水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了亲水溶质分子表面原有水化层的厚度，降低了它的亲水性，导致脱水凝集。
等电点沉淀法两性电解质，在溶液 pH处于等电点（ pI）时分子表面净电荷为零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的削弱或破坏，
分子间引力增加，溶解度降低。调节溶解的 pH值，使两性溶质溶解度下降，析出沉淀的操作。
结晶法改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程称作结晶。
（一）盐析结晶法这是生化制药中应用最多的结晶方法。其作用是通过向结晶溶液中引入中性盐，逐渐降低溶质的溶解度使其过饱和，经过一定时间后晶体形成并逐渐长大。
（二）透析结晶
（三）有机溶剂结晶
（四）等电点结晶
（五）温度诱导结晶第五章 吸附法吸附是物质分子在两相界面上浓度的增加。
由于界面上的分子同时受到不相等的两相分子的作用力，因此界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、
原子或离子，并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。我们称物质从流动性（气或液相）浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。把在表面上能发生吸附作用的固体称为吸附剂；将被吸附的物质称为吸附物。
预处理 上样 吸附 洗杂 洗脱 再生常用吸附剂：
1)活性炭是一种吸附能力很强的非极性吸附剂，其吸附作用在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，吸附能力的顺序：水 >乙醇 >甲醇 >乙酸乙酯 >丙酮 >氯仿。
2)人造沸石人造沸石是一种人工合成的无机阳离子交换剂。用于细胞色素 C的分离。
3)磷酸钙凝胶在蛋白质的分离、精制中，较为常用的吸附剂为磷酸钙凝胶。（羟基磷灰石）活性部位为钙离子。
4)白陶土
5)氢氧化铝凝胶用于蛋白质及酶的分离。
6)氧化铝活性氧化铝是最常用的一种吸附剂，特别适于亲脂性成分的分离，广泛地用于在醇，酚，生物碱，染料，甾体化合物，苷类，氨基酸，蛋白质以及维生素等物质的分离。
7)硅胶最常用
8)滑石粉 惰性 助滤剂
9)硅藻土 惰性 助滤剂
10)皂土
11)聚酰胺粉
12)大孔网格聚合物吸附树脂极性，弱极性，非极性大孔吸附树脂强酸性，弱酸性，强碱性，弱碱性等第六章 离子交换法离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电力。它们结合是可逆的，在一定条件下能够结合，条件改变后也能被释放出来。离子交换剂由惰性的不溶性载体，功能基团和平衡离子组成。
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平衡上样 吸附 洗杂 洗脱第七章 凝胶层析它是将样品化合物通过一定孔径的凝胶固定相，用于流经体积的差异，使不同分子量的组成得以分离的层析。
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大分子小分子
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第八章 亲和层析利用生物大分子特异性亲和力而设计的层析技术称为亲核层析。
在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（ Ligand），
与配基结合的层析介质称为载体（ Matrix）
亲和层析的设计原理和过程：
1)配基固定化选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异性亲和性分离介质。
2)吸附样品亲和层析介质选择性吸附酶或其它生物活性物质，杂质与层析间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除。
3)样品洗脱选择适宜的条件使被吸附的亲和介质上的酶或其它生物活性物质洗脱。
L S L
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离心技术 — 在离心力场作用下，加速悬浮液中固体颗粒沉降速度的方法称为离心技术。
相对离心力 — 通常用离心力与重力的比值表示离心机的离心能力，也称分离因素，用符号 × g或 g表示。
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4 22?
第十章 膜分离技术分离范围 分离动力一般过滤 >1μm 压力差微孔过滤 0.01~ 1μ m 压力差透析 5~100? 分子扩散超级过滤 5~100? 压力差反渗透 <5? 压力差电渗析 <5? 电能第十一章 制备型高效液相色谱制备型 HPLC技术是利用大直径柱，分离制备大量纯物质
（ >0.1g）
HPLC的分离依据是样品中各组分之间带电性，极性，疏水性，分子大小，等电点，亲和性，螯合性等理化性质的差异。将样品导入柱头，流动相在高压泵的作用下，其流量被准确地控制通过色谱柱，样品中各组分在色谱柱中形成查速迁移，按时间先后流出层析柱，
然后进行检测和分部收集。
泵 色谱柱检测器 色谱数据处理溶剂按固定相对样品的保留机理,HPLC大致可分为液固色谱，
键合相色谱，离子交换色谱，离子对色谱，凝胶色谱，
疏水色谱，亲和色谱，聚焦色谱，金属螯合亲和色谱等。
色谱重要参数：分离度，分离速度，回收率，样品容量。
分离度 Rs
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容量因子 K’— 为溶质在固定相中得总摩尔数与流动相中得总摩尔数之比。
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