五,离子对色谱法 ion pair
chromatography,IPC
分正相和反相离子对色谱法。
反相离子对色谱法
将离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分的离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或对离子，
counter ion）生成不荷电的中性离子对，增加溶质与非极性固定相间的 疏水性缔合作 用，使分配系数增加，改善分离效果。
RP-IPC用于分离可离子化（有机酸、碱、盐）或离子型化合物。
1．离子对模型
以有机碱（ B）为例。调节流动相 pH，使碱转变为正离子 BH+形式，则 BH+与流动相中离子对试剂（烷基磺酸盐）的反离子 RSO3-
生成不荷电的中性离子对，此中性离子对在固定相和流动相间达到分配平衡。
B + H+? BH+
RSO3Na? RSO3- + Na+
BH+ + RSO3-? (BH+? RSO3-)m?
(BH+? RSO3-)s
以通式表示：
(B+)m + (A -)m? (B+? A-)m? (B+? A-)s
B+,溶质离子,A-:离子对试剂反离子,m,表示流动相,s:表示固定相
溶质离子 B在固定相和流动相间的分配系数：
KB = =? [A-]m = EBA [A-]m
EBA为萃取常数。溶质的分配系数决定于离子对试剂的浓度和萃取常数。萃取常数又与固定相、离子对试剂和溶质的性质、温度有关。
m
s
B
AB
][
][
mm
s
AB
AB
][][
][
2.影响容量因子的因素
1) 离子对试剂的种类：
离子对试剂的碳链长度增加，溶质的 k增大 ；
分析酸类或带负电荷的物质时，一般用季铵盐作离子对试剂，如四丁基铵磷酸盐，溴化十六烷基三甲基铵等；
分析碱类或带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐作离子对试剂，如正戊烷基、正己烷基、正庚烷基磺酸钠等。
2) 离子对试剂的浓度：
低浓度范围内，溶质的 k随离子对试剂的浓度升高而增大，最后趋于恒定。
对长链离子对试剂（如正癸烷磺酸盐），
当离子对试剂的浓度超过一定值时,k 反而减少，溶质的 k出现极大值现象。这是离子对试剂形成胶束的结果。
3) 流动相 pH:
对弱酸、弱碱的 k影响较大。
六．手性色谱法 chiral
chromatography
药物对映体具有不同的药动学、药效学和毒理学。
DL-合霉素的疗效为 D-氯霉素的一半；
普萘洛尔（ propranolol） L-异构体的药物活性比 D-异构体大 100倍；
1．手性药物分离 (拆分 )分析的作用
对某些手性药物进行对映体的纯度检查；
探索血药浓度与临床疗效的关系 ----生物体液中药物对映体的分离分析；
在研制手性药物过程中，分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应及药物动力学性质。
2．手性 HPLC拆分法分类包括柱前手性衍生试剂法（ chiral derivatization
reagent,CDR）,手性流动相法（ chiral mobile
phase,CMP）和手性固定相法（ chiral stationary
phase,CSP）,
1） CDR法对映异构体与光学纯手性试剂反应，生成相应的非对映异构体。采用普通固定相分离。
(R) — SA → (R) — SE— (R) — SA
（ R） — SE +
(S) — SA → (R) — SE— (S) — SA
2） CMP法常用手性添加剂,
（ 1）配基交换型手性添加剂：
常用 手性配基 为光学活性氨基酸及其衍生物的二价金属离子螯合物。它们 和手性药物消旋体形成非对映异构配位络合物对。
例如，分离 DL-色氨酸手性异构体，可在流动相中加入 L-苯丙氨酸 -Cu2+作为手性添加剂。
（ 2）环糊精类添加剂（ cyclodextrins,CD）
结构特点：
环状低聚糖，外部边缘有许多羟基，内部为相对疏水的空腔，每个葡萄糖单元有 5个手性碳原子。
常用,β-CD,γ-CD以及它们的各种改性 CD。
（ 3）手性离子对络合剂
带电手性药物与手性离子对络合成电中性非对映体络合物对。
常用手性离子对络合剂：
（ +） -10-樟脑磺酸，奎宁，奎尼丁等。
3） CSP法常用手性固定相为：
（ 1） Pirkle型手性固定相
Pirkle实验室研究的手性固定相。主要有：
电荷转移型手性固定相固定相分子与对映体分子间发生 π-π电荷转移作用。包括：
π电子给予体手性固定相；
π电子接受体手性固定相。
氨基酸类手性固定相
（ 2）蛋白质类手性固定相广泛应用的是牛血清蛋白和人血 α1-酸性糖蛋白键合硅胶手性固定相（通过氨基酸键合）。
（ 3）环糊精类手性固定相六．亲合色谱法 affinity
chromatography,AC
是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离分析特殊物质的一种色谱方法。
AC是选择性最高的一种色谱分离模式。
具有专一亲和特性的生物分子对：
抗体与抗原； 酶与底物；
激素或药物与受体； RNA与和它互补的 DNA。
将上述分子对的其中之一固定在载体上，形成固定相，可用于分离分析与之有专一亲合性的物质。
常用载体为多孔硅胶。
七．离子色谱法 ion
chromatography
将离子交换法与电导检测器相结合分离分析各种离子的方法，分双柱型（抑制型）和单柱型（非抑制型）离子色谱法。
八,HPLC中的速率理论
H = A + B/u + Cu
(一 ) 涡流扩散
A = 2λ dp
λ,填充不规则因子；
dp,固定相颗粒粒径
固定相颗粒越小，填充越均匀,A越小。
（二）纵向扩散
纵向扩散系数 β = 2γ Dm
Dm,组分在流动相中的扩散系数，与流动相的粘度成反比，与温度成正比。
HPLC中，流动相是液体，粘度 较大；
在室温下工作。 Dm较小
HPLC 的纵向扩散可以忽略不计。
（三）传质阻抗
1,固定相传质阻抗 Cs：
键合固定相多为单分子层，其厚度可忽略，因此
Cs可忽略。
2,流动相传质阻抗 Cm
位于流动相流路中心的组分分子还未来得及扩散进入流动相和固定相界面，就被流动相带走，此部分分子总比靠近固定相颗粒表面的组分分子移动得快些，结果使峰展宽。
Cm =
m
pm
D
d 2
3,静态流动相传质阻抗 Csm
固定相具有多孔性，部分流动相会滞留在微孔内，这部分流动相中的组分的传质过程存在静态传质阻抗。
Csm
m
p
D
d 2
根据速率理论，提高 HPLC柱效，应采用下列条件：
小粒径，均匀的球形化学键合相；
低粘度流动相，流速不宜快；
常用甲醇（ η = 0.54 mPa?s）,乙腈（ η = 0.34
mPa?s）作流动相成分不用乙醇（ η = 1.08 mPa?s）
柱温适当。
小粒径是保证 HPLC高柱效的主要措施。
九,HPLC分析方法
（一） 定性分析方法
1．色谱鉴定法：只能对范围已知的化合物定性。
定性原理：同一物质在相同色谱条件下保留时间
（或保留体积或相对保留值）相同。
2．化学鉴定法收集色谱馏分，在利用化学反应进行鉴定。
3,两谱联用鉴定法：
离线：
制备 HPLC获得纯组分，用 UV,IR,MS NMR鉴定；
在线：联用仪
（二） 定量分析法
1,色谱峰面积对正常色谱峰,A = 1.065× h× W1/2
2,色谱定量分析依据,
被测物质的量与其色谱峰峰面积成正比例关系。
3,定量校正因子
同一种检测器对相同量的不同类型物质有不同响应值，同一种物质在不同检测器上有不同响应灵敏度，
因此不能用峰面积直接计算物质的含量，而需引入定量校正因子。
1) 绝对校正因子：
fi’ = mi / Ai 单位面积所代表的物质的质量。
2) 相对定量校正因子,
物质 i和标准物质 s的绝对校正因子之比
fi = fi’/fs’ =
si
is
mA
mA
4,定量方法常用外标法和内标法
1） 外标法 （校正曲线法）：
在一定色谱条件下，用一系列不同浓度的对照品溶液进样分析，得一系列色谱图，以各色谱峰面积或峰高对对照品溶液的量或浓度作图，得校正曲线，
求得线性回归方程
A = a + bC（或 m） 。
对样品溶液进样分析，得峰面积，根据校正曲线，
求得样品的量或浓度。
外标一点法（对比法）：
若校正曲线线性好，截距近似为零，可用。
mi =
AR及 mR分别为对照品溶液在进样体积中所含组分的质量和相应峰面积。
外标法特点,
不需用校正因子；
不需内标；
分析结果的准确度主要取决于进样量的重复性和色谱条件的稳定性。
R
R
i m
A
A
2）内标法
以一定量纯物质为内标物，加到准确称取的试样中，进样分析，根据内标物的质量及峰面积，计算样品组分的含量。
mi = fiAi,ms = fsAs
mi =
s
ss
ii m
fA
fA
内标法特点,
可抵消样品预处理、仪器不稳定、色谱条件不稳定、
进样量（指进样体积）不准确等原因带来的误差。
通常内标在试样预处理前加入。
内标的选择,
内标物应是试样中不存在的纯物质；
内标物色谱峰位于被测组分色谱峰附近或几个被测组分色谱峰中间，并与各组分峰完全分离。
3） 内标校正曲线法类似于外标法。在各浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。
线性回归方程为,AR/As = a + b C（或 m）
若截距近似为零，可用 内标一点法 定量：
Ci = ×
R
i
sR
si
C
C
AA
AA?
)/(
)/(
)/(
)/(
sR
si
AA
AA
RC
该法特点,
不需用校正因子；
可抵消样品预处理、仪器不稳定、色谱条件不稳定、进样量（指进样体积）不准确等原因带来的误差。
4）内标校正因子法先在对照品溶液中，加入一定量内标物，进样分析，求得样品组分的相对校正因子：
fi =
含一定量内标物的试样溶液进样分析，求得：
mi = = fs =1
该法实际为内标一点法
s
ss
ii m
fA
fA
sR
Rs
mA
mA
s
s
ii m
A
fA
5）内加法
将待测组分的对照品加到待测试样溶液中，测定增加对照品后的溶液中组分的峰面积比原试样溶液中组分的峰面积的增加量，计算组分的含量。
mi =
特点,
不需内标物；
可克服进样量的不准确带来的定量误差 ;
只求多组分混合物中某一组分的含量，而又没有合适的内标物时，可采用此法。
i
i
i m
A
A?
６）归一化法
mi % =
特点,
定量结果与进样量无关；
操作条件变化时对测定结果影响较小；
在一个分析周期内，所有组分都必须流出色谱柱，
且检测器对它们都产生信号；
不能用于微量杂质的含量测定。
1 0 0
332211
nn
ii
fAfAfAfA
fA
十,HPLC分离方法的选择
(一）分子量小于 1000的组分
1,组分溶于有机溶剂,可用：
1） LSC
SP,硅胶； MP,有机溶剂。
2）反相色谱
SP,-C18,C8等；
MP：甲醇，乙腈,THF的混合液
3）正相色谱
SP,-CN,-NH2键合相,MP,有机溶剂
2,组分溶于水，可用：
1）非离子型化合物用反相色谱
SP,-C18,C8等
MP：水或缓冲溶液，甲醇，乙腈,THF的混合液
2) 可离子化化合物用反相离子对色谱
SP,-C18,C8等
MP：水或缓冲溶液（含离子对试剂），甲醇，乙腈,THF的混合液
3）离子型化合物可用离子交换色谱或采用反相离子对色谱
SP,-SO3H,-NR3Cl型离子交换剂
MP：缓冲液
(二）分子量大于 1000的组分采用凝胶色谱法
1,组分溶于水：
凝胶过滤色谱
SP：水溶性凝胶
MP：水溶液
2,组分溶于有机溶剂凝胶渗透色谱
SP：有机凝胶
MP：有机溶剂
chromatography,IPC
分正相和反相离子对色谱法。
反相离子对色谱法
将离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分的离子在流动相中与离子对试剂的反离子（或对离子，
counter ion）生成不荷电的中性离子对，增加溶质与非极性固定相间的 疏水性缔合作 用，使分配系数增加，改善分离效果。
RP-IPC用于分离可离子化（有机酸、碱、盐）或离子型化合物。
1．离子对模型
以有机碱（ B）为例。调节流动相 pH，使碱转变为正离子 BH+形式，则 BH+与流动相中离子对试剂（烷基磺酸盐）的反离子 RSO3-
生成不荷电的中性离子对，此中性离子对在固定相和流动相间达到分配平衡。
B + H+? BH+
RSO3Na? RSO3- + Na+
BH+ + RSO3-? (BH+? RSO3-)m?
(BH+? RSO3-)s
以通式表示：
(B+)m + (A -)m? (B+? A-)m? (B+? A-)s
B+,溶质离子,A-:离子对试剂反离子,m,表示流动相,s:表示固定相
溶质离子 B在固定相和流动相间的分配系数：
KB = =? [A-]m = EBA [A-]m
EBA为萃取常数。溶质的分配系数决定于离子对试剂的浓度和萃取常数。萃取常数又与固定相、离子对试剂和溶质的性质、温度有关。
m
s
B
AB
][
][
mm
s
AB
AB
][][
][
2.影响容量因子的因素
1) 离子对试剂的种类：
离子对试剂的碳链长度增加，溶质的 k增大 ；
分析酸类或带负电荷的物质时，一般用季铵盐作离子对试剂，如四丁基铵磷酸盐，溴化十六烷基三甲基铵等；
分析碱类或带正电荷的物质时，一般用烷基磺酸盐作离子对试剂，如正戊烷基、正己烷基、正庚烷基磺酸钠等。
2) 离子对试剂的浓度：
低浓度范围内，溶质的 k随离子对试剂的浓度升高而增大，最后趋于恒定。
对长链离子对试剂（如正癸烷磺酸盐），
当离子对试剂的浓度超过一定值时,k 反而减少，溶质的 k出现极大值现象。这是离子对试剂形成胶束的结果。
3) 流动相 pH:
对弱酸、弱碱的 k影响较大。
六．手性色谱法 chiral
chromatography
药物对映体具有不同的药动学、药效学和毒理学。
DL-合霉素的疗效为 D-氯霉素的一半；
普萘洛尔（ propranolol） L-异构体的药物活性比 D-异构体大 100倍；
1．手性药物分离 (拆分 )分析的作用
对某些手性药物进行对映体的纯度检查；
探索血药浓度与临床疗效的关系 ----生物体液中药物对映体的分离分析；
在研制手性药物过程中，分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应及药物动力学性质。
2．手性 HPLC拆分法分类包括柱前手性衍生试剂法（ chiral derivatization
reagent,CDR）,手性流动相法（ chiral mobile
phase,CMP）和手性固定相法（ chiral stationary
phase,CSP）,
1） CDR法对映异构体与光学纯手性试剂反应，生成相应的非对映异构体。采用普通固定相分离。
(R) — SA → (R) — SE— (R) — SA
（ R） — SE +
(S) — SA → (R) — SE— (S) — SA
2） CMP法常用手性添加剂,
（ 1）配基交换型手性添加剂：
常用 手性配基 为光学活性氨基酸及其衍生物的二价金属离子螯合物。它们 和手性药物消旋体形成非对映异构配位络合物对。
例如，分离 DL-色氨酸手性异构体，可在流动相中加入 L-苯丙氨酸 -Cu2+作为手性添加剂。
（ 2）环糊精类添加剂（ cyclodextrins,CD）
结构特点：
环状低聚糖，外部边缘有许多羟基，内部为相对疏水的空腔，每个葡萄糖单元有 5个手性碳原子。
常用,β-CD,γ-CD以及它们的各种改性 CD。
（ 3）手性离子对络合剂
带电手性药物与手性离子对络合成电中性非对映体络合物对。
常用手性离子对络合剂：
（ +） -10-樟脑磺酸，奎宁，奎尼丁等。
3） CSP法常用手性固定相为：
（ 1） Pirkle型手性固定相
Pirkle实验室研究的手性固定相。主要有：
电荷转移型手性固定相固定相分子与对映体分子间发生 π-π电荷转移作用。包括：
π电子给予体手性固定相；
π电子接受体手性固定相。
氨基酸类手性固定相
（ 2）蛋白质类手性固定相广泛应用的是牛血清蛋白和人血 α1-酸性糖蛋白键合硅胶手性固定相（通过氨基酸键合）。
（ 3）环糊精类手性固定相六．亲合色谱法 affinity
chromatography,AC
是利用或模拟生物分子之间的专一性作用，从复杂生物试样中分离分析特殊物质的一种色谱方法。
AC是选择性最高的一种色谱分离模式。
具有专一亲和特性的生物分子对：
抗体与抗原； 酶与底物；
激素或药物与受体； RNA与和它互补的 DNA。
将上述分子对的其中之一固定在载体上，形成固定相，可用于分离分析与之有专一亲合性的物质。
常用载体为多孔硅胶。
七．离子色谱法 ion
chromatography
将离子交换法与电导检测器相结合分离分析各种离子的方法，分双柱型（抑制型）和单柱型（非抑制型）离子色谱法。
八,HPLC中的速率理论
H = A + B/u + Cu
(一 ) 涡流扩散
A = 2λ dp
λ,填充不规则因子；
dp,固定相颗粒粒径
固定相颗粒越小，填充越均匀,A越小。
（二）纵向扩散
纵向扩散系数 β = 2γ Dm
Dm,组分在流动相中的扩散系数，与流动相的粘度成反比，与温度成正比。
HPLC中，流动相是液体，粘度 较大；
在室温下工作。 Dm较小
HPLC 的纵向扩散可以忽略不计。
（三）传质阻抗
1,固定相传质阻抗 Cs：
键合固定相多为单分子层，其厚度可忽略，因此
Cs可忽略。
2,流动相传质阻抗 Cm
位于流动相流路中心的组分分子还未来得及扩散进入流动相和固定相界面，就被流动相带走，此部分分子总比靠近固定相颗粒表面的组分分子移动得快些，结果使峰展宽。
Cm =
m
pm
D
d 2
3,静态流动相传质阻抗 Csm
固定相具有多孔性，部分流动相会滞留在微孔内，这部分流动相中的组分的传质过程存在静态传质阻抗。
Csm
m
p
D
d 2
根据速率理论，提高 HPLC柱效，应采用下列条件：
小粒径，均匀的球形化学键合相；
低粘度流动相，流速不宜快；
常用甲醇（ η = 0.54 mPa?s）,乙腈（ η = 0.34
mPa?s）作流动相成分不用乙醇（ η = 1.08 mPa?s）
柱温适当。
小粒径是保证 HPLC高柱效的主要措施。
九,HPLC分析方法
（一） 定性分析方法
1．色谱鉴定法：只能对范围已知的化合物定性。
定性原理：同一物质在相同色谱条件下保留时间
（或保留体积或相对保留值）相同。
2．化学鉴定法收集色谱馏分，在利用化学反应进行鉴定。
3,两谱联用鉴定法：
离线：
制备 HPLC获得纯组分，用 UV,IR,MS NMR鉴定；
在线：联用仪
（二） 定量分析法
1,色谱峰面积对正常色谱峰,A = 1.065× h× W1/2
2,色谱定量分析依据,
被测物质的量与其色谱峰峰面积成正比例关系。
3,定量校正因子
同一种检测器对相同量的不同类型物质有不同响应值，同一种物质在不同检测器上有不同响应灵敏度，
因此不能用峰面积直接计算物质的含量，而需引入定量校正因子。
1) 绝对校正因子：
fi’ = mi / Ai 单位面积所代表的物质的质量。
2) 相对定量校正因子,
物质 i和标准物质 s的绝对校正因子之比
fi = fi’/fs’ =
si
is
mA
mA
4,定量方法常用外标法和内标法
1） 外标法 （校正曲线法）：
在一定色谱条件下，用一系列不同浓度的对照品溶液进样分析，得一系列色谱图，以各色谱峰面积或峰高对对照品溶液的量或浓度作图，得校正曲线，
求得线性回归方程
A = a + bC（或 m） 。
对样品溶液进样分析，得峰面积，根据校正曲线，
求得样品的量或浓度。
外标一点法（对比法）：
若校正曲线线性好，截距近似为零，可用。
mi =
AR及 mR分别为对照品溶液在进样体积中所含组分的质量和相应峰面积。
外标法特点,
不需用校正因子；
不需内标；
分析结果的准确度主要取决于进样量的重复性和色谱条件的稳定性。
R
R
i m
A
A
2）内标法
以一定量纯物质为内标物，加到准确称取的试样中，进样分析，根据内标物的质量及峰面积，计算样品组分的含量。
mi = fiAi,ms = fsAs
mi =
s
ss
ii m
fA
fA
内标法特点,
可抵消样品预处理、仪器不稳定、色谱条件不稳定、
进样量（指进样体积）不准确等原因带来的误差。
通常内标在试样预处理前加入。
内标的选择,
内标物应是试样中不存在的纯物质；
内标物色谱峰位于被测组分色谱峰附近或几个被测组分色谱峰中间，并与各组分峰完全分离。
3） 内标校正曲线法类似于外标法。在各浓度的对照品溶液中加入相同量的内标物。
线性回归方程为,AR/As = a + b C（或 m）
若截距近似为零，可用 内标一点法 定量：
Ci = ×
R
i
sR
si
C
C
AA
AA?
)/(
)/(
)/(
)/(
sR
si
AA
AA
RC
该法特点,
不需用校正因子；
可抵消样品预处理、仪器不稳定、色谱条件不稳定、进样量（指进样体积）不准确等原因带来的误差。
4）内标校正因子法先在对照品溶液中，加入一定量内标物，进样分析，求得样品组分的相对校正因子：
fi =
含一定量内标物的试样溶液进样分析，求得：
mi = = fs =1
该法实际为内标一点法
s
ss
ii m
fA
fA
sR
Rs
mA
mA
s
s
ii m
A
fA
5）内加法
将待测组分的对照品加到待测试样溶液中，测定增加对照品后的溶液中组分的峰面积比原试样溶液中组分的峰面积的增加量，计算组分的含量。
mi =
特点,
不需内标物；
可克服进样量的不准确带来的定量误差 ;
只求多组分混合物中某一组分的含量，而又没有合适的内标物时，可采用此法。
i
i
i m
A
A?
６）归一化法
mi % =
特点,
定量结果与进样量无关；
操作条件变化时对测定结果影响较小；
在一个分析周期内，所有组分都必须流出色谱柱，
且检测器对它们都产生信号；
不能用于微量杂质的含量测定。
1 0 0
332211
nn
ii
fAfAfAfA
fA
十,HPLC分离方法的选择
(一）分子量小于 1000的组分
1,组分溶于有机溶剂,可用：
1） LSC
SP,硅胶； MP,有机溶剂。
2）反相色谱
SP,-C18,C8等；
MP：甲醇，乙腈,THF的混合液
3）正相色谱
SP,-CN,-NH2键合相,MP,有机溶剂
2,组分溶于水，可用：
1）非离子型化合物用反相色谱
SP,-C18,C8等
MP：水或缓冲溶液，甲醇，乙腈,THF的混合液
2) 可离子化化合物用反相离子对色谱
SP,-C18,C8等
MP：水或缓冲溶液（含离子对试剂），甲醇，乙腈,THF的混合液
3）离子型化合物可用离子交换色谱或采用反相离子对色谱
SP,-SO3H,-NR3Cl型离子交换剂
MP：缓冲液
(二）分子量大于 1000的组分采用凝胶色谱法
1,组分溶于水：
凝胶过滤色谱
SP：水溶性凝胶
MP：水溶液
2,组分溶于有机溶剂凝胶渗透色谱
SP：有机凝胶
MP：有机溶剂
