分析方法部分第一部分 光学分析第一章 光谱分析法概论一．光学分析法 （ optical analysis）
基于物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用后产生的辐射信号或发生的信号变化来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分析方法，统称为光学分析法。
任何一种光学分析法均包含三个主要过程,1）能源提供能量 2）能量与被测物质相互作用 3）产生被检测讯号。
二．电磁辐射与电磁波谱
1,光,是一种电磁辐射（即电磁波）。具有波粒二相性。
光的波动性：用波长、波数和频率表征
ν = c / λ
光的微粒性：用每个光子具有的能量表征
E = h ν h = 6.63× 10-34 J.S
2,电磁波谱
γ射线 → X射线 → UV → 可见 → 红外 → 微波 → 无线电波
波长逐渐变长三．电磁辐射与物质的相互作用常见电磁辐射与物质相互作用的术语：
１．吸收,是原子、分子或离子吸收光子的能量
（等于基态和激发态能量之差），从基态跃迁至激发态的过程。
２．发射,是物质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放能量的过程。
３．散射,是光通过介质时，与介质分子发生弹性碰撞所致，碰撞时没有能量交换，光频率不变，
但光子的运动方向发生改变。
三．电磁辐射与物质的相互作用
４．拉曼散射,是光通过介质时，与介质分子发生非弹性碰撞所致，碰撞时不仅光子的运动方向发生改变，而且还有能量交换，光频率发生变化。
５．折射和反射
６．干涉和衍射四．光学分析法的分类表 1:
原 理 分析方法辐射的发射 1)发射光谱法 2）荧光光谱法 3）火焰光度法辐射的吸收 1）比色法 2）分光光度法（可见，紫外，红外等）
3）原子吸收法 4）核磁共振法辐射的散射 1）拉曼散射 2）散射浊度法辐射的折射 折射法辐射的衍射 1） X-射线衍射法 2）电子衍射法辐射的旋转 1）偏振法 2）旋光法 3）圆二色光谱法
（一）光谱法与非光谱法
１．光谱法,利用物质的光谱进行定性定量和结构分析的方法。有 3种基本类型：吸收光谱法、发射光谱法和散射光谱法
光谱（ spectrum）是物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化的图谱。
2．非光谱法,不涉及物质内部能级的跃迁，即不以光的波长为特征讯号，仅测量电磁辐射的某些基本性质（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所发生的变化。
（ 二）原子光谱法和分子光谱法
原子光谱法,以测量气态原子或离子外层或内层电子跃迁所产生的光谱。线状光谱。
分子光谱法,是分子中电子能级、振动能级和转动能级发生变化产生的光谱。
带状光谱。 IR,UV,分子荧光等。
（三）吸收光谱法与发射光谱法吸收光谱,是物质 吸收 相应的辐射能而产生的光谱。利用物质的吸收光谱进行定性定量及结构分析的方法为吸收光谱法。如 UV-Vis,IR,NMR
发射光谱,是物质的原子、离子或分子受到辐射能、热能、电能或化学能的激发跃迁至激发态后，有激发态回到基态时以辐射的方式释放能量而产生的光谱。
如原子发射光谱法，原子荧光光谱法，分子荧光光谱法，磷光光谱法等．
五．光谱分析仪器
研究吸收或发射的电磁辐射强度与波长关系的仪器称分光光度计。其组成图大致如下：
辐射源 → 分光系统 → 样品池 → 检测器
→ 讯号处理及显示器
1．分光系统将复合光分解成单色或有一定波长范围的谱带。
分为单色器和滤光片。
单色器由入射狭缝、出射狭缝、准直镜和色散元件组成。其中色散元件是心脏，有棱镜和光栅。
滤光片有：
带通滤光片：只能分出一个波长带；
截止滤光片：只能消除给定波长以上或以下的所有辐射。
凹口滤光片,
2．检测器,
多采用光电转换器，包括量子化检测器
（如光电倍增管）和热检测器（如真空热电偶）,
第二章 紫外 -可见分光光度法一．基本原理和概念
UV-Vis是研究物质在紫外 -可见光区（ UV,
200-400nm,Vis,400-800nm）分子吸收光谱的分析方法。
（一） UV-Vis的常用概念
1．吸收光谱吸收度或透光率与波长的关系曲线。
2．吸收峰及最大吸收波长 λmax
3,峰谷及最小吸收波长 λmin
4,肩峰 (shoulder peak),在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。
5．末端吸收（ end absorption）：在图谱短波端呈现强吸收但不成峰形的部分。
（二）定量原理 —— Lambert-Beer 定律
A = -lgT = ECL
描述物质对 单色光 吸收的强弱与吸光物质的浓度与厚度间关系的定律。吸收系数可用于定性定量。
百分吸收系数,指在一定波长下，溶液浓度为
1%（ W/V,g/ml）,溶液厚度为 1cm时的吸光度．
摩尔吸收系数 ε：指在一定波长下，溶液浓度为
1mol/L,溶液厚度为 1cm时的吸光度,
ε = (M/10)× M为摩尔质量
吸光度的加合性,混合组分的吸光度是各组分吸光度的和。
1cmE%
1cmE%
（三）定性依据
吸收光谱：
最大吸收波长
吸收系数
两波长处吸收度比值
（四）影响测定准确性的因素
1．偏离 Beer定律的因素
光学因素,单色光不纯，比色皿厚度的均匀度不合要求。
化学因素,若溶液为胶体溶液或混浊，则入射光通过溶液时部分光会散射或反射而损失；
溶液中的溶质因浓度改变而发生解离、缔合、与溶剂相互作用等变化，使吸收发生改变，偏离 Beer定律。
2．透光率测定误差来自仪器的噪音
可见，浓度相对误差取决于透光率及其测量误差的大小。
A在 0.2－ 0.7范围时，浓度测量值的相对误差较小。
TT
T
C
C
lg
4 3 4.0
二．紫外 -可见分光光度计
1．光源
钨灯和卤钨灯：发可见光
氢灯和氘灯：发紫外光
2．单色器
3．吸收池光学玻璃吸收池：只能用于可见光区。
熔融石英（氧化硅）吸收池：在紫外光区和可见光区都可用。
4．检测器
常用光电倍增管、光二极管阵列检测器（ photo-diode
array detector）
三,UV-Vis分析方法
（一）定性鉴别
UV-Vis一般采用对比法进行定性鉴别。将试样的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征进行对照比较。
１．对比吸收光谱特征数据
２．对比吸收度或吸收系数的比值可消除溶液浓度和吸收厚度的影响。
３．对比吸收光谱的一致性
（二）纯度检查
1．杂质检查
2．杂质的限量检查：后面讲
（三）定量测定
1．测定方法的建立
（１）查文献，根据化学结构确定有无紫外吸收
（２）测定条件的选择：
通过测定吸收光谱，确定波长：一般选择?max，以提高灵敏度并减少误差；或无干扰且吸收度较大的峰对应的波长；不选择末端吸收波长。
溶剂的选择：
（３）估算灵敏度，决定取样量
标准曲线线性范围的吸收度最好在 0.2-0.7之间。
（ 4）空白液：
一般以空白体液的提取液为空白，消除体液中其他物质的干扰。
2．单组分的定量方法
1） 吸收系数法,单色光很纯时采用
C = A / (ε l)
2） 校正曲线法必须使用相同仪器，且固定工作状态和测定条件，
否则吸光度和浓度之间的关系就会偏离线性。
３） 对照法
Cx = (Ax / As)× Cs
Cs,标准溶液的浓度。在相同仪器、相同波长下测定。标准物和试样为相同物质。
３．同时测定多组分的定量方法
— 计算分光光度法样品中有两种组分共存时，各组分吸收光谱相互重叠的程度主要三种：
各组分的吸收峰处，其它组分没有吸收,可按单组分的测定方法，分别在各自的吸收峰处测定。
各组分的吸收光谱有部分重叠,可先在 λ1处按单组分测定法测得混合溶液中 a组分的浓度 Ca，再在 λ2处测定混合溶液的吸收度 A2(a+b),则可根据吸收度的加和性计算组分 b 的浓度 Cb.
A2(a+b) = A2a + A2b = E2a× Ca + E2b× Cb
各组分的吸收光谱完全重叠（相互干扰）,最常见的情况。
可采用以下方法测定。
１）差示分光光度法 （ difference
spectrophotometry）
不需事先分离，能消除背景吸收和干扰物对供试液测定的影响。
测定方法与原理,
取两份相等的供试液，制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变 pH；或在其一中加入能与供试品发生化学反应的试剂）,供试品在不同的化学环境中以两种不同的化学形式存在 （如分子型与离子型，氧化型与还原型）,且两种化学形式的吸收光谱有显著差异 ；
而背景吸收和干扰物的吸收不受化学环境的影响 。
将两份供试液稀释到相同浓度，分别置于样品池和参比池中，于适当波长处测定吸收度的差值 (?A),即可对供试品进行定量。
设 x,y分别代表两种不同化学环境中供试品的两种不同化学形式，它们在测定波长处的吸收度以 Ax和 Ay表示；背景吸收和干扰物的吸收度为 Az，则：
A = A样品 – A参比
=（ Ax + Az） -(Ay + Az)
= Ax –Ay = εxCL - εyCL =(εx –εy)CL
具体测定方法有 3种（见,体内药物分析,p 82）：
1) 利用最大吸收波长处的吸收度差定量；
2) 利用最小吸收波长处的吸收度差定两；
3) 利用差示光谱中最大吸收与最小吸收之差定量。
2) 双波长分光光度法
一般用双波长分光光度计测定。
A,等吸收点双波长法
原理：以 a,b两组分为例。选择两个测定波长,使干扰组分 a在两波长处有等吸收，而待测组分在两波长处的吸收度有显著差别 。测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。
A = Aλ2(a+b) -Aλ1(a+b)
= (Aλ2a + Aλ2b ) - (Aλ1 a + Aλ1b )
= Aλ2b - Aλ1b
= (ελ2b-ελ1b)Cb L
2) 双波长分光光度法
B.系数倍率法
当干扰组分没有等吸收波长或虽有等吸收波长而待测组分的?A较小时，
等吸收点双波长法则不能使用。可用系数倍率法。
原理：
在选定的两波长处，利用双波长分光光度计的信号放大装置，将一个波长处的吸收信号放大 k倍，使干扰组分 a在两波长的吸收度相等,
即 Aλ1a = k Aλ2a 。 测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。
A = kAλ2(a+b) - Aλ1(a+b) = (kAλ2a + kAλ2b )- (Aλ1a + Aλ1b )
= kAλ2b - Aλ1b = (kελ2b-ελ1b)Cb L
当 k=1时，即是等吸收点法。应选择使 k值尽可能接近于 1的波长对进行实验。
3）导数分光光度法
A 导数光谱的波型和特点
零阶光谱的极大 在奇数阶的导数光谱中相应于 0，
在偶数阶的导数光谱中相应于极值（极大和极小交替出现）；
零阶光谱的拐点 在奇数阶的导数光谱中产生极值，
在偶数阶的导数光谱中相应于 0；
随着导数阶数增加，极值数量增加（导数阶数 +
1），谱带边窄，分辨能力提高。
因此导数光谱在定性分析中十分有用。
B 消除干扰组分吸收的原理
若干扰组分的吸收对波长呈线性，可用一阶导数法消除干扰：
A总 = εCL + (aλ + b)
dA/dλ = (dε/dλ)CL + a
定量参数 D =（ dA/dλ） 峰 -（ dA/dλ） 谷
= [（ dε/dλ） 峰 -（ dε/dλ） 谷 ] CL
对给定波长,(dε/dλ)峰,(dε/dλ)谷 为常数第三章 荧光分析法
fluorometry
一,概述
fluorometry是根据物质荧光谱线的位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
灵敏度比 UV-Vis法高，但重现性不如 UV-
Vis法。
光致发光,常见光致发光有荧光和磷光。
化学发光 （ Chemiluminescence,CL）：
是指吸收了化学反应能的原子或分子由激发态回到基态时产生的一种光辐射现象。
分子荧光,待测物质是分子。
原子荧光,待测物质是原子。
激发光,UV-Vis光,IR光,X-射线等二．基本原理
（一）分子荧光的产生
1．振动弛豫 vibrational relaxation：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。振动弛豫属于 无辐射跃迁,因为能量不是以光辐射的形式放出的。
2．内部能量转换 internal conversion：受激分子由高电子能级 以无辐射方式 转移至低电子能级的过程。
3．外部能量转换 external conversion,溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以 热能的形式 释放能量的过程。
4．荧光发射：物质分子从激发态的最低振动能级返回基态时，以辐射形式发射光量子，这些光量子就称为荧光。
由于振动弛豫、内部能量转换和外部能量转换损失了部分能量，故荧光的波长总比激发光波长长。
(二 ) 激发光谱和发射光谱激发光谱（ excitation spectrum）,表示不同激发波长的光引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱曲线时，固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的光激发物质,记录荧光强度对激发光波长的关系曲线,即得激发光谱。类似于吸收光谱。
发射光谱（或称荧光光谱,fluorescence spectrum）,表示在所发射的荧光中，各种波长荧光组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度。 记录荧光强度对发射波长的关系曲线,即得荧光光谱。
激发光谱和发射光谱可用于鉴别荧光物质，且是选择测定波长的依据。
(三 ) 荧光效率
（ fluorescence efficency）
即荧光量子效率，指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光 子数之比。
φf = 发射荧光的光子数 / 吸收荧光的光子数
一般在 0 —1之间。
(四 ) 有机化合物分子结构与荧光的关系能发射荧光的物质需同时具备 2个条件,
有强的紫外 -可见吸收：具有 π-π*跃迁的长共轭分子有；
具有一定的荧光效率：有刚性平面结构的分子有。
1.长共轭结构与荧光的关系,
含芳香环或芳香杂环的物质具有长共轭的 π-π*跃迁，能产生荧光。 π电子共轭程度越大，则荧光强度越大，荧光波长也长移。
λex 205nm λex 286nm λem 356nm
λem 278nm λem 321nm λex 404nm
φf = 0.11 φf = 0.29 φf = 0.36
2,分子的刚性与荧光的关系,在相同的长共轭分子中，
分子的刚性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。
φf = 0.2 φf = 1.0
3,取代基与荧光的关系
给电子取代基,-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-NR2,-CN
能增加分子的 π电子共轭程度，荧光效率提高，荧光波长长移。
吸电子取代基,-COOH,-NO2,-C=O,-NO,-F,-Cl,-Br,
-I等。能减弱分子的 π电子共轭程度，荧光效率减弱甚至熄灭。
(五 ) 荧光试剂
与弱荧光物质或不显荧光的物质作用，
得到强荧光性衍生物。
常用试剂：荧光胺，邻苯二甲醛
（ OPA）,丹酰氯，丹酰肼,8-羟基喹啉
（常用于无机离子的衍生）等。
(六 ) 影响荧光强度的外部因素
1,温度,一般，温度升高，溶液中荧光物质的荧光强度和荧光效率降低。 因温度升高，分子运动速度加快，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加。
2,溶剂
极性,一般,溶剂的极 性增加，荧光波长长移，荧光强度增加。因极性溶剂中,π-π*跃迁的能量差减小，使激发波长和荧光波长均长移，跃迁几率增加，荧光强度增加。
粘度,粘度减小，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，荧光减弱。
3,酸度,当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强度影响较大。因荧光物质有其最适宜的发射荧光的存在形式。
苯胺,pH 7-12,主要以分子形式存在,-NH2能提高荧光效率。发射蓝色荧光。
当溶液的 pH<2 或 pH>13时，以离子形式存在，不能发射荧光。
4,荧光熄灭剂 quenching medium：
能与荧光物质相互作用,使其荧光强度降低或熄灭的物质。荧光熄灭剂会使荧光分析产生误差。
荧光熄灭法,如果一种荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的降低和荧光熄灭剂的浓度成线性关系，则可利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。
5,散射光,一束光照在溶液中时，与溶液中的物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称散射光。又分为：
瑞利光 （ Reyleigh scattering light）：光子与物质分子发生 弹性碰撞 时，产生的散射光。其波长与入射光波长相同。
拉曼光 （ Raman scattering light）：光子与物质分子发生 非弹性碰撞 时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种光称拉曼光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是比入射光波长更长的拉曼光，干扰更大。
三,荧光定量分析
（一）定量原理
荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度,F=K(I0-I)
根据 beer定律,I=I010-ECL,则
F = K I0(1-10-ECL) = K I0(1- e-2.3ECL)
= K I0[1- (1 + + + +……)]
= K I0[2.3ECL - - -…)]
当浓度很小时（即当 ECL?0.05时），上式简化为：
F = 2.3 K I0 ECL
即低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系。且与受下列因素的影响：
荧光量子效率；入射光强度；化合物的吸收系数。
!1 )3.2( ECL? !2
)3.2( 2ECL? !3 )3.2( 3ECL?
!2 )3.2(
2ECL?
!3 )3.2(
3ECL?
（二）定量方法
1．标准曲线法：
以空白溶液调 0（荧光强度为 0），以标准系列中最大浓度的标准溶液调 100%（荧光强度为 100%）。
2．对照法：
若标准曲线通过 0点，可用对照法定量。
Cx = × Cs
当空白溶液的荧光强度不能调到 0时，必须扣出。
0
0
FF
FF
s
x
四．荧光分光光度计
1．激发光源：汞灯，氙灯，激光
2．滤光片,2个，激发滤光片位于光源和样品池之间；
荧光滤光片位于样品池和检测器之间。
3．样品池
4．检测器,PMT
收集荧光的方向,与激发光源的方向垂直五．测定方法的建立
1．根据文献及结构,判断物质的荧光性质
2．作激发光谱和荧光光谱，选择最佳激发波长和发射波长
3．定性方法：比较待测组分与标准品的最大发射波长、荧光强度、荧光光谱等。
3．定量方法：
第四章 原子吸收分光光度法
atomic absorption
spectrophotometry
根据蒸气相中被测元素的基态原子对特征辐射的吸收来测定试样中该元素含量的分析方法。
是金属元素含量测定的首选方法
光源（空心阴极灯） ----原子化器（火焰和石墨炉） ----单色器 -----检测系统
基于物质发射的电磁辐射或物质与电磁辐射相互作用后产生的辐射信号或发生的信号变化来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分析方法，统称为光学分析法。
任何一种光学分析法均包含三个主要过程,1）能源提供能量 2）能量与被测物质相互作用 3）产生被检测讯号。
二．电磁辐射与电磁波谱
1,光,是一种电磁辐射（即电磁波）。具有波粒二相性。
光的波动性：用波长、波数和频率表征
ν = c / λ
光的微粒性：用每个光子具有的能量表征
E = h ν h = 6.63× 10-34 J.S
2,电磁波谱
γ射线 → X射线 → UV → 可见 → 红外 → 微波 → 无线电波
波长逐渐变长三．电磁辐射与物质的相互作用常见电磁辐射与物质相互作用的术语：
１．吸收,是原子、分子或离子吸收光子的能量
（等于基态和激发态能量之差），从基态跃迁至激发态的过程。
２．发射,是物质从激发态跃迁回基态，并以光的形式释放能量的过程。
３．散射,是光通过介质时，与介质分子发生弹性碰撞所致，碰撞时没有能量交换，光频率不变，
但光子的运动方向发生改变。
三．电磁辐射与物质的相互作用
４．拉曼散射,是光通过介质时，与介质分子发生非弹性碰撞所致，碰撞时不仅光子的运动方向发生改变，而且还有能量交换，光频率发生变化。
５．折射和反射
６．干涉和衍射四．光学分析法的分类表 1:
原 理 分析方法辐射的发射 1)发射光谱法 2）荧光光谱法 3）火焰光度法辐射的吸收 1）比色法 2）分光光度法（可见，紫外，红外等）
3）原子吸收法 4）核磁共振法辐射的散射 1）拉曼散射 2）散射浊度法辐射的折射 折射法辐射的衍射 1） X-射线衍射法 2）电子衍射法辐射的旋转 1）偏振法 2）旋光法 3）圆二色光谱法
（一）光谱法与非光谱法
１．光谱法,利用物质的光谱进行定性定量和结构分析的方法。有 3种基本类型：吸收光谱法、发射光谱法和散射光谱法
光谱（ spectrum）是物质与辐射能相互作用时，物质内部发生能级跃迁所产生的辐射能强度随波长变化的图谱。
2．非光谱法,不涉及物质内部能级的跃迁，即不以光的波长为特征讯号，仅测量电磁辐射的某些基本性质（反射，折射，干涉，衍射和偏振）所发生的变化。
（ 二）原子光谱法和分子光谱法
原子光谱法,以测量气态原子或离子外层或内层电子跃迁所产生的光谱。线状光谱。
分子光谱法,是分子中电子能级、振动能级和转动能级发生变化产生的光谱。
带状光谱。 IR,UV,分子荧光等。
（三）吸收光谱法与发射光谱法吸收光谱,是物质 吸收 相应的辐射能而产生的光谱。利用物质的吸收光谱进行定性定量及结构分析的方法为吸收光谱法。如 UV-Vis,IR,NMR
发射光谱,是物质的原子、离子或分子受到辐射能、热能、电能或化学能的激发跃迁至激发态后，有激发态回到基态时以辐射的方式释放能量而产生的光谱。
如原子发射光谱法，原子荧光光谱法，分子荧光光谱法，磷光光谱法等．
五．光谱分析仪器
研究吸收或发射的电磁辐射强度与波长关系的仪器称分光光度计。其组成图大致如下：
辐射源 → 分光系统 → 样品池 → 检测器
→ 讯号处理及显示器
1．分光系统将复合光分解成单色或有一定波长范围的谱带。
分为单色器和滤光片。
单色器由入射狭缝、出射狭缝、准直镜和色散元件组成。其中色散元件是心脏，有棱镜和光栅。
滤光片有：
带通滤光片：只能分出一个波长带；
截止滤光片：只能消除给定波长以上或以下的所有辐射。
凹口滤光片,
2．检测器,
多采用光电转换器，包括量子化检测器
（如光电倍增管）和热检测器（如真空热电偶）,
第二章 紫外 -可见分光光度法一．基本原理和概念
UV-Vis是研究物质在紫外 -可见光区（ UV,
200-400nm,Vis,400-800nm）分子吸收光谱的分析方法。
（一） UV-Vis的常用概念
1．吸收光谱吸收度或透光率与波长的关系曲线。
2．吸收峰及最大吸收波长 λmax
3,峰谷及最小吸收波长 λmin
4,肩峰 (shoulder peak),在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。
5．末端吸收（ end absorption）：在图谱短波端呈现强吸收但不成峰形的部分。
（二）定量原理 —— Lambert-Beer 定律
A = -lgT = ECL
描述物质对 单色光 吸收的强弱与吸光物质的浓度与厚度间关系的定律。吸收系数可用于定性定量。
百分吸收系数,指在一定波长下，溶液浓度为
1%（ W/V,g/ml）,溶液厚度为 1cm时的吸光度．
摩尔吸收系数 ε：指在一定波长下，溶液浓度为
1mol/L,溶液厚度为 1cm时的吸光度,
ε = (M/10)× M为摩尔质量
吸光度的加合性,混合组分的吸光度是各组分吸光度的和。
1cmE%
1cmE%
（三）定性依据
吸收光谱：
最大吸收波长
吸收系数
两波长处吸收度比值
（四）影响测定准确性的因素
1．偏离 Beer定律的因素
光学因素,单色光不纯，比色皿厚度的均匀度不合要求。
化学因素,若溶液为胶体溶液或混浊，则入射光通过溶液时部分光会散射或反射而损失；
溶液中的溶质因浓度改变而发生解离、缔合、与溶剂相互作用等变化，使吸收发生改变，偏离 Beer定律。
2．透光率测定误差来自仪器的噪音
可见，浓度相对误差取决于透光率及其测量误差的大小。
A在 0.2－ 0.7范围时，浓度测量值的相对误差较小。
TT
T
C
C
lg
4 3 4.0
二．紫外 -可见分光光度计
1．光源
钨灯和卤钨灯：发可见光
氢灯和氘灯：发紫外光
2．单色器
3．吸收池光学玻璃吸收池：只能用于可见光区。
熔融石英（氧化硅）吸收池：在紫外光区和可见光区都可用。
4．检测器
常用光电倍增管、光二极管阵列检测器（ photo-diode
array detector）
三,UV-Vis分析方法
（一）定性鉴别
UV-Vis一般采用对比法进行定性鉴别。将试样的吸收光谱特征与标准化合物的吸收光谱特征进行对照比较。
１．对比吸收光谱特征数据
２．对比吸收度或吸收系数的比值可消除溶液浓度和吸收厚度的影响。
３．对比吸收光谱的一致性
（二）纯度检查
1．杂质检查
2．杂质的限量检查：后面讲
（三）定量测定
1．测定方法的建立
（１）查文献，根据化学结构确定有无紫外吸收
（２）测定条件的选择：
通过测定吸收光谱，确定波长：一般选择?max，以提高灵敏度并减少误差；或无干扰且吸收度较大的峰对应的波长；不选择末端吸收波长。
溶剂的选择：
（３）估算灵敏度，决定取样量
标准曲线线性范围的吸收度最好在 0.2-0.7之间。
（ 4）空白液：
一般以空白体液的提取液为空白，消除体液中其他物质的干扰。
2．单组分的定量方法
1） 吸收系数法,单色光很纯时采用
C = A / (ε l)
2） 校正曲线法必须使用相同仪器，且固定工作状态和测定条件，
否则吸光度和浓度之间的关系就会偏离线性。
３） 对照法
Cx = (Ax / As)× Cs
Cs,标准溶液的浓度。在相同仪器、相同波长下测定。标准物和试样为相同物质。
３．同时测定多组分的定量方法
— 计算分光光度法样品中有两种组分共存时，各组分吸收光谱相互重叠的程度主要三种：
各组分的吸收峰处，其它组分没有吸收,可按单组分的测定方法，分别在各自的吸收峰处测定。
各组分的吸收光谱有部分重叠,可先在 λ1处按单组分测定法测得混合溶液中 a组分的浓度 Ca，再在 λ2处测定混合溶液的吸收度 A2(a+b),则可根据吸收度的加和性计算组分 b 的浓度 Cb.
A2(a+b) = A2a + A2b = E2a× Ca + E2b× Cb
各组分的吸收光谱完全重叠（相互干扰）,最常见的情况。
可采用以下方法测定。
１）差示分光光度法 （ difference
spectrophotometry）
不需事先分离，能消除背景吸收和干扰物对供试液测定的影响。
测定方法与原理,
取两份相等的供试液，制成两种不同的化学环境（如在其一中加酸或碱，改变 pH；或在其一中加入能与供试品发生化学反应的试剂）,供试品在不同的化学环境中以两种不同的化学形式存在 （如分子型与离子型，氧化型与还原型）,且两种化学形式的吸收光谱有显著差异 ；
而背景吸收和干扰物的吸收不受化学环境的影响 。
将两份供试液稀释到相同浓度，分别置于样品池和参比池中，于适当波长处测定吸收度的差值 (?A),即可对供试品进行定量。
设 x,y分别代表两种不同化学环境中供试品的两种不同化学形式，它们在测定波长处的吸收度以 Ax和 Ay表示；背景吸收和干扰物的吸收度为 Az，则：
A = A样品 – A参比
=（ Ax + Az） -(Ay + Az)
= Ax –Ay = εxCL - εyCL =(εx –εy)CL
具体测定方法有 3种（见,体内药物分析,p 82）：
1) 利用最大吸收波长处的吸收度差定量；
2) 利用最小吸收波长处的吸收度差定两；
3) 利用差示光谱中最大吸收与最小吸收之差定量。
2) 双波长分光光度法
一般用双波长分光光度计测定。
A,等吸收点双波长法
原理：以 a,b两组分为例。选择两个测定波长,使干扰组分 a在两波长处有等吸收，而待测组分在两波长处的吸收度有显著差别 。测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。
A = Aλ2(a+b) -Aλ1(a+b)
= (Aλ2a + Aλ2b ) - (Aλ1 a + Aλ1b )
= Aλ2b - Aλ1b
= (ελ2b-ελ1b)Cb L
2) 双波长分光光度法
B.系数倍率法
当干扰组分没有等吸收波长或虽有等吸收波长而待测组分的?A较小时，
等吸收点双波长法则不能使用。可用系数倍率法。
原理：
在选定的两波长处，利用双波长分光光度计的信号放大装置，将一个波长处的吸收信号放大 k倍，使干扰组分 a在两波长的吸收度相等,
即 Aλ1a = k Aλ2a 。 测定混合物溶液在两波长处的吸收度之差即可对待测组分进行定量。
A = kAλ2(a+b) - Aλ1(a+b) = (kAλ2a + kAλ2b )- (Aλ1a + Aλ1b )
= kAλ2b - Aλ1b = (kελ2b-ελ1b)Cb L
当 k=1时，即是等吸收点法。应选择使 k值尽可能接近于 1的波长对进行实验。
3）导数分光光度法
A 导数光谱的波型和特点
零阶光谱的极大 在奇数阶的导数光谱中相应于 0，
在偶数阶的导数光谱中相应于极值（极大和极小交替出现）；
零阶光谱的拐点 在奇数阶的导数光谱中产生极值，
在偶数阶的导数光谱中相应于 0；
随着导数阶数增加，极值数量增加（导数阶数 +
1），谱带边窄，分辨能力提高。
因此导数光谱在定性分析中十分有用。
B 消除干扰组分吸收的原理
若干扰组分的吸收对波长呈线性，可用一阶导数法消除干扰：
A总 = εCL + (aλ + b)
dA/dλ = (dε/dλ)CL + a
定量参数 D =（ dA/dλ） 峰 -（ dA/dλ） 谷
= [（ dε/dλ） 峰 -（ dε/dλ） 谷 ] CL
对给定波长,(dε/dλ)峰,(dε/dλ)谷 为常数第三章 荧光分析法
fluorometry
一,概述
fluorometry是根据物质荧光谱线的位置及强度进行物质鉴定和含量测定的方法。
灵敏度比 UV-Vis法高，但重现性不如 UV-
Vis法。
光致发光,常见光致发光有荧光和磷光。
化学发光 （ Chemiluminescence,CL）：
是指吸收了化学反应能的原子或分子由激发态回到基态时产生的一种光辐射现象。
分子荧光,待测物质是分子。
原子荧光,待测物质是原子。
激发光,UV-Vis光,IR光,X-射线等二．基本原理
（一）分子荧光的产生
1．振动弛豫 vibrational relaxation：处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。振动弛豫属于 无辐射跃迁,因为能量不是以光辐射的形式放出的。
2．内部能量转换 internal conversion：受激分子由高电子能级 以无辐射方式 转移至低电子能级的过程。
3．外部能量转换 external conversion,溶液中的激发态分子与溶剂分子或与其他溶质分子之间相互碰撞而失去能量，并以 热能的形式 释放能量的过程。
4．荧光发射：物质分子从激发态的最低振动能级返回基态时，以辐射形式发射光量子，这些光量子就称为荧光。
由于振动弛豫、内部能量转换和外部能量转换损失了部分能量，故荧光的波长总比激发光波长长。
(二 ) 激发光谱和发射光谱激发光谱（ excitation spectrum）,表示不同激发波长的光引起物质发射某一波长荧光的相对效率。绘制激发光谱曲线时，固定发射单色器在某一波长，通过激发单色器扫描，以不同波长的光激发物质,记录荧光强度对激发光波长的关系曲线,即得激发光谱。类似于吸收光谱。
发射光谱（或称荧光光谱,fluorescence spectrum）,表示在所发射的荧光中，各种波长荧光组分的相对强度。绘制发射光谱时，使激发光的波长和强度保持不变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下相应的荧光强度。 记录荧光强度对发射波长的关系曲线,即得荧光光谱。
激发光谱和发射光谱可用于鉴别荧光物质，且是选择测定波长的依据。
(三 ) 荧光效率
（ fluorescence efficency）
即荧光量子效率，指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光 子数之比。
φf = 发射荧光的光子数 / 吸收荧光的光子数
一般在 0 —1之间。
(四 ) 有机化合物分子结构与荧光的关系能发射荧光的物质需同时具备 2个条件,
有强的紫外 -可见吸收：具有 π-π*跃迁的长共轭分子有；
具有一定的荧光效率：有刚性平面结构的分子有。
1.长共轭结构与荧光的关系,
含芳香环或芳香杂环的物质具有长共轭的 π-π*跃迁，能产生荧光。 π电子共轭程度越大，则荧光强度越大，荧光波长也长移。
λex 205nm λex 286nm λem 356nm
λem 278nm λem 321nm λex 404nm
φf = 0.11 φf = 0.29 φf = 0.36
2,分子的刚性与荧光的关系,在相同的长共轭分子中，
分子的刚性越强，荧光效率越大，荧光波长越长。
φf = 0.2 φf = 1.0
3,取代基与荧光的关系
给电子取代基,-NH2,-OH,-OCH3,-NHR,-NR2,-CN
能增加分子的 π电子共轭程度，荧光效率提高，荧光波长长移。
吸电子取代基,-COOH,-NO2,-C=O,-NO,-F,-Cl,-Br,
-I等。能减弱分子的 π电子共轭程度，荧光效率减弱甚至熄灭。
(五 ) 荧光试剂
与弱荧光物质或不显荧光的物质作用，
得到强荧光性衍生物。
常用试剂：荧光胺，邻苯二甲醛
（ OPA）,丹酰氯，丹酰肼,8-羟基喹啉
（常用于无机离子的衍生）等。
(六 ) 影响荧光强度的外部因素
1,温度,一般，温度升高，溶液中荧光物质的荧光强度和荧光效率降低。 因温度升高，分子运动速度加快，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加。
2,溶剂
极性,一般,溶剂的极 性增加，荧光波长长移，荧光强度增加。因极性溶剂中,π-π*跃迁的能量差减小，使激发波长和荧光波长均长移，跃迁几率增加，荧光强度增加。
粘度,粘度减小，分子碰撞几率增加，使无辐射跃迁增加，荧光减弱。
3,酸度,当荧光物质本身是弱酸或弱碱时，溶液的酸度对其荧光强度影响较大。因荧光物质有其最适宜的发射荧光的存在形式。
苯胺,pH 7-12,主要以分子形式存在,-NH2能提高荧光效率。发射蓝色荧光。
当溶液的 pH<2 或 pH>13时，以离子形式存在，不能发射荧光。
4,荧光熄灭剂 quenching medium：
能与荧光物质相互作用,使其荧光强度降低或熄灭的物质。荧光熄灭剂会使荧光分析产生误差。
荧光熄灭法,如果一种荧光物质在加入某种熄灭剂后，荧光强度的降低和荧光熄灭剂的浓度成线性关系，则可利用这一性质测定荧光熄灭剂的含量。
5,散射光,一束光照在溶液中时，与溶液中的物质分子相互碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称散射光。又分为：
瑞利光 （ Reyleigh scattering light）：光子与物质分子发生 弹性碰撞 时，产生的散射光。其波长与入射光波长相同。
拉曼光 （ Raman scattering light）：光子与物质分子发生 非弹性碰撞 时，光子把部分能量转移给物质分子或从物质分子获得部分能量，而发射出比入射光稍长或稍短的光，这种光称拉曼光。
散射光对荧光测定有干扰，尤其是比入射光波长更长的拉曼光，干扰更大。
三,荧光定量分析
（一）定量原理
荧光强度正比于被荧光物质吸收的光强度,F=K(I0-I)
根据 beer定律,I=I010-ECL,则
F = K I0(1-10-ECL) = K I0(1- e-2.3ECL)
= K I0[1- (1 + + + +……)]
= K I0[2.3ECL - - -…)]
当浓度很小时（即当 ECL?0.05时），上式简化为：
F = 2.3 K I0 ECL
即低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系。且与受下列因素的影响：
荧光量子效率；入射光强度；化合物的吸收系数。
!1 )3.2( ECL? !2
)3.2( 2ECL? !3 )3.2( 3ECL?
!2 )3.2(
2ECL?
!3 )3.2(
3ECL?
（二）定量方法
1．标准曲线法：
以空白溶液调 0（荧光强度为 0），以标准系列中最大浓度的标准溶液调 100%（荧光强度为 100%）。
2．对照法：
若标准曲线通过 0点，可用对照法定量。
Cx = × Cs
当空白溶液的荧光强度不能调到 0时，必须扣出。
0
0
FF
FF
s
x
四．荧光分光光度计
1．激发光源：汞灯，氙灯，激光
2．滤光片,2个，激发滤光片位于光源和样品池之间；
荧光滤光片位于样品池和检测器之间。
3．样品池
4．检测器,PMT
收集荧光的方向,与激发光源的方向垂直五．测定方法的建立
1．根据文献及结构,判断物质的荧光性质
2．作激发光谱和荧光光谱，选择最佳激发波长和发射波长
3．定性方法：比较待测组分与标准品的最大发射波长、荧光强度、荧光光谱等。
3．定量方法：
第四章 原子吸收分光光度法
atomic absorption
spectrophotometry
根据蒸气相中被测元素的基态原子对特征辐射的吸收来测定试样中该元素含量的分析方法。
是金属元素含量测定的首选方法
光源（空心阴极灯） ----原子化器（火焰和石墨炉） ----单色器 -----检测系统
