第二部分 色谱分析法部分第一章 色谱法概论
chromatography
一,概述重要性,历史上两次诺贝尔化学奖都直接与色谱研究相关
1948年瑞典科学家 Tiselins因电泳和吸附分析的研究获奖；
1952年英国的 Martin和 Synge因发展了分配色谱获奖。
色谱法的创建,
色谱法创始于 20世纪初,1903年由俄国植物学家
Tsweet发现,并于 1906年发表论文,将这种方法命名为“色谱”。
二,色谱法分类
1,按流动相与固定相的分子集聚状态分：
流动相可为气体、液体和超临界流体；
固定相可为液体和固体；
以化学键合固定相进行的色谱法称为键合相色谱法。
2,按操作形式分：
柱色谱法，平面色谱法，毛细管电泳法等
3,按色谱过程的分离机制分,
分配色谱法，吸附色谱法，离子交换色谱法，空间排阻色谱法,CE,CEC
等,
色谱法气 相 色 谱 法 G C
g a s c h r o m
柱 色 谱 法
c o l u m n c h r o m
G S C
G L C
液 相 色 谱 法 L C
l i q u i d c h r o m
纸 色 谱 法
p a p e r c h r o m
L L C
平 面 色 谱 法
p l a n a r o r p l a n e c h r o m
薄 层 色 谱 法 T L C
t h i n l a y e r c h r o m
L L C
L S C
柱 色 谱 法
c o l u m n c h r o m
L L C
L S C
S E C,s t e r i c e x c l u s i o n c h r o m
I E C,i o n e x c h a n g e c h r o m
B P C
b o n d e d p h a s e c h r o m
毛 细 管 电 泳 法 C E
c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s s i s
超 临 界 流 体 色 谱 法 S F C
s u p e r c r i t i c a l f l u i d c h r o m
毛 细 管 电 色谱 法
c a p i l l a r y
e l e c t r o - c h r o m
三．基本原理和概念
（一）色谱过程
实现色谱操作的基本条件：必须具备相对运动的两相，即：
固定相（ stationary phase）：固定不动；
流动相（ mobile phase）：携带试样向前移动的流动体。
色谱过程,组分分子在流动相和固定相间多次分配的过程。
（二）色谱流出曲线和有关概念
1．色谱流出曲线和色谱峰
1）色谱流出曲线：由检测器输出的响应信号对时间作图所得到的曲线，即色谱图。
2）基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。反映仪器（主要是检测器）
的噪音随时间的变化。
3）色谱峰,
正常峰：对称形正态分布曲线。
拖尾峰（ tailing peak）：前沿陡峭，
后沿平缓。
前延峰（ leading peak）：后沿陡峭，
前沿平缓。
对称因子 fs (symmetry factor) 或拖尾因子（ tailing
factor）,fs = W0.05h / 2A = (A + B) / 2A
W0.05h为 0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽。
A,B分别为 0.05倍色谱峰高处的色谱峰前沿、后沿与色谱峰顶点至基线的垂线之间的距离。
fs = 0.95-1.05 对称峰 ; 小于 0.95为前延峰 ; 大于 1.05为拖尾峰,
描述色谱峰的参数：
峰高和峰面积：用于定量；
保留值：定性；
峰宽：衡量柱效。
2．保留值
1）保留时间（ retention time,tR）：
从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。
2）死时间 (dead time,t0)：不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。
3) 调整保留时间（ adjusted retention time,t’R）,
t’R = tR – t0
4) 保留体积 （ retention volume,VR）,从进样到某组分在柱后出现浓度极大时,所需通过色谱柱的流动相体积。
VR = tR × Fc
流动相流速（体积流速,ml/min）越大，保留时间越短，
二者的乘积不变，即 VR与流动相流速无关。
5） 死体积 （ dead volume,V0）,
从进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。是色谱柱中固定相颗粒间间隙、进样器到色谱柱间导管的容积、柱出口导管及检测器内腔容积的总和。
V0 = t0× Fc
死时间相当于流动相充满死体积所需的时间。
6） 调整保留 体积 （ adjusted retention volume,V’R）
7) 相对保留值 （ relative retention,r or α）,
色谱系统的选择性指标。
8） 保留指数 （ retention index,I）
GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，
即以正构烷烃作为组分相对保留值的标准，用 2个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称保留指数。
又称 Kovats指数。
Ix = 100 [ z + n ]
z和 z + n为正构烷烃的碳原子数,n 一般为 1
)()(
)()(
'lg'lg
'lg'lg
zRnzR
zRxR
tt
tt
3．色谱峰高和峰面积
1） peak height,h
2) peak area,A
4,色谱峰区域宽度
1）标准差 （ standard deviation,σ）,0.607倍峰高处的峰宽之半。
2）半峰宽（ peak width at half height,W1/2）
W1/2= 2.355σ
3) 峰底宽 （ peak width,W）,通过色谱峰两侧拐点作切线，在基线上所截得的距离
W = 1.699 W1/2= 4σ
5,分离度 (resolution,R)
R =
R = 1.5时，两峰完全分开，称基线分离。
2/)( 21
12
WW
tt RR
（三）分配系数与色谱分离
1．分配系数和容量因子
分配系数（ distribution coefficient,K）,
在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的浓度之比
K = Cs /Cm
K与组分、固定相和流动相的性质和温度有关。在固定相、流动相和温度一定时,K是组分的特征参数。
容量因子（ capacity factor,k）
在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比
k = ms / mm = (CsVs)/ (CmVm) = K × (Vs/ Vm)
2,K和 k与保留时间的关系
设流动相的线速度为 u，样品组分的速度为 v，将二者之比称为保留比,
R’ = v / u (1)
在定距展开的柱色谱中,v = L / tR,u = L / t0,则：
R’ = t0 / tR (2)
因 t0近似于组分在流动相中的时间 tm，溶质分子只有出现在流动相中时才能随流动相前移故保留比与溶质分子在流动相中的分数有关：
R’ =
R’ = (3)
由（ 2）和（ 3）式，得,tR = t0 ( 1+k ) (4)
tR = t0 ( 1+ K ) (5)
(5)式为色谱过程方程，表示保留时间与分配系数的关系
ssmm
mm
sm
m
sm
m
VCVC
VC
NN
N
tt
t
k?1
1
m
s
V
V
容量因子与保留时间的关系,
k =
3．色谱分离的前提
两组分 A和 B:
tRA = t0 ( 1+ KA ) tRB = t0 ( 1+ KB )
tR = tRA - tRB = t0 (KA – KB)
两组分如果被分离，保留时间必须不等，则两组分的 K必须不等,--
-----色谱分离的前提。
或?tR = tRA - tRB = t0 (kA – kB),即容量因子不等是分离的前提。
00
0 '
t
t
t
tt RR
m
s
V
V
m
s
V
V
m
s
V
V
四．基本类型色谱方法及其分离机制
（一）分配色谱法
分离原理：
利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别进行分离
K = Cs/Cm = (Xs/Vs) / (Xm/Vm)
Xs,溶解在固定相中的组分溶质分子
Xm,溶解在流动相中的组分溶质分子
包括：
气液分配色谱法 ;
液液分配色谱法 (正相分配色谱和反相分配色谱 )
（二）吸附色谱法
分离原理,
利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别进行分离。吸附过程是组分分子和流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。
吸附系数 Ka = (Xa/Sa) / (Xm/Vm)
Xa,被吸附的组分分子
Xm：流动相中的组分溶质分子
Sa,吸附剂的表面积
包括：气固吸附色谱法和液固吸附色谱法。
（三）离子交换色谱法
分离原理,
利用被分离组分离子交换能力的差别进行分离。
RSO3-H+ + Na+ RSO3-Na+ + H+
用通式表示：
R- B+ + A+ = R —A + B+
离子交换反应的选择性系数：
K A/B = =
KA和 KB为分配系数,K A/B越大，说明 A的交换能力越大。
]][[
]][[
ABR
BAR
B
AKKBBR AAR ]/[][ ]/[][
固定相,离子交换树脂
交联度
交换容量
粒度影响保留行为的因素：
溶质离子的电荷和水合半径
离子交换剂的交联度和交换容量
流动相组成和 pH
（四）空间排阻色谱法又称分子排阻色谱法，凝胶色谱法（ gel chromatography
分离原理：
利用被分离组分分子的线团尺寸差异进行分离。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成正比，因此组分按分子量大小差异进行分离。
渗透系数 Kp = [Xs]/[Xm]
Kp由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙大小所决定。凝胶孔隙一定时，分子的线团尺寸越大，越不易进入凝胶孔隙。
固定相：
凝胶．主要性能参数：
1）平均孔径
2）排斥极限：化合物的分子量达到一定值时，就不能进入凝胶的任何孔隙，这一分子量为凝胶的排斥极限；
3）分子量范围：排斥极限与全渗透点（ Kp = 1）之间的分子量范围。
流动相：
应能溶解样品组分，同时还必须能润湿凝胶；粘度低
总结,
根据色谱过程方程：
tR = t0 ( 1+ K )
上述各种色谱法中,K分别为分配系数，吸俯系数，选择性系数和渗透系数,Vs分别为色谱柱内固定相体积，吸附剂表面积，离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。
m
sVV
m
s
V
V
五．色谱法基本理论
1．塔板理论在解释流出曲线的形状、评价柱效等方面比较好。
假设：
在色谱柱内一小段长度 H内，组分可以在 2相中瞬间达到分配平衡。
样品和新鲜流动相都加在第 0号塔板上。
试样的纵向扩散可以忽略。
分配系数在各塔板上是常数。
理论塔板高度 H（ plate height,height equivalent to a
theoretical plate）,
H = L / n
理论塔板数 n ( the number of theoretical plates):
n = 16 (tR /W)2 = 5.54 (tR /W1/2)2
2,速率理论能阐明影响柱效的因素。
H = A + B/u + Cu
A,涡流扩散 （ eddy diffusion），
也叫多径扩散
B/u：纵向扩散（ longitudinal diffusion）
C,传质阻抗 （ mass transfer
resistance）
chromatography
一,概述重要性,历史上两次诺贝尔化学奖都直接与色谱研究相关
1948年瑞典科学家 Tiselins因电泳和吸附分析的研究获奖；
1952年英国的 Martin和 Synge因发展了分配色谱获奖。
色谱法的创建,
色谱法创始于 20世纪初,1903年由俄国植物学家
Tsweet发现,并于 1906年发表论文,将这种方法命名为“色谱”。
二,色谱法分类
1,按流动相与固定相的分子集聚状态分：
流动相可为气体、液体和超临界流体；
固定相可为液体和固体；
以化学键合固定相进行的色谱法称为键合相色谱法。
2,按操作形式分：
柱色谱法，平面色谱法，毛细管电泳法等
3,按色谱过程的分离机制分,
分配色谱法，吸附色谱法，离子交换色谱法，空间排阻色谱法,CE,CEC
等,
色谱法气 相 色 谱 法 G C
g a s c h r o m
柱 色 谱 法
c o l u m n c h r o m
G S C
G L C
液 相 色 谱 法 L C
l i q u i d c h r o m
纸 色 谱 法
p a p e r c h r o m
L L C
平 面 色 谱 法
p l a n a r o r p l a n e c h r o m
薄 层 色 谱 法 T L C
t h i n l a y e r c h r o m
L L C
L S C
柱 色 谱 法
c o l u m n c h r o m
L L C
L S C
S E C,s t e r i c e x c l u s i o n c h r o m
I E C,i o n e x c h a n g e c h r o m
B P C
b o n d e d p h a s e c h r o m
毛 细 管 电 泳 法 C E
c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s s i s
超 临 界 流 体 色 谱 法 S F C
s u p e r c r i t i c a l f l u i d c h r o m
毛 细 管 电 色谱 法
c a p i l l a r y
e l e c t r o - c h r o m
三．基本原理和概念
（一）色谱过程
实现色谱操作的基本条件：必须具备相对运动的两相，即：
固定相（ stationary phase）：固定不动；
流动相（ mobile phase）：携带试样向前移动的流动体。
色谱过程,组分分子在流动相和固定相间多次分配的过程。
（二）色谱流出曲线和有关概念
1．色谱流出曲线和色谱峰
1）色谱流出曲线：由检测器输出的响应信号对时间作图所得到的曲线，即色谱图。
2）基线：在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。反映仪器（主要是检测器）
的噪音随时间的变化。
3）色谱峰,
正常峰：对称形正态分布曲线。
拖尾峰（ tailing peak）：前沿陡峭，
后沿平缓。
前延峰（ leading peak）：后沿陡峭，
前沿平缓。
对称因子 fs (symmetry factor) 或拖尾因子（ tailing
factor）,fs = W0.05h / 2A = (A + B) / 2A
W0.05h为 0.05倍色谱峰高处的色谱峰宽。
A,B分别为 0.05倍色谱峰高处的色谱峰前沿、后沿与色谱峰顶点至基线的垂线之间的距离。
fs = 0.95-1.05 对称峰 ; 小于 0.95为前延峰 ; 大于 1.05为拖尾峰,
描述色谱峰的参数：
峰高和峰面积：用于定量；
保留值：定性；
峰宽：衡量柱效。
2．保留值
1）保留时间（ retention time,tR）：
从进样到某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔。
2）死时间 (dead time,t0)：不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。
3) 调整保留时间（ adjusted retention time,t’R）,
t’R = tR – t0
4) 保留体积 （ retention volume,VR）,从进样到某组分在柱后出现浓度极大时,所需通过色谱柱的流动相体积。
VR = tR × Fc
流动相流速（体积流速,ml/min）越大，保留时间越短，
二者的乘积不变，即 VR与流动相流速无关。
5） 死体积 （ dead volume,V0）,
从进样器至检测器的流路中未被固定相占有的空间。是色谱柱中固定相颗粒间间隙、进样器到色谱柱间导管的容积、柱出口导管及检测器内腔容积的总和。
V0 = t0× Fc
死时间相当于流动相充满死体积所需的时间。
6） 调整保留 体积 （ adjusted retention volume,V’R）
7) 相对保留值 （ relative retention,r or α）,
色谱系统的选择性指标。
8） 保留指数 （ retention index,I）
GC中，把组分的保留行为换算成相当于正构烷烃的保留行为，
即以正构烷烃作为组分相对保留值的标准，用 2个保留时间紧邻待测组分的基准物质来标定组分，这个相对值称保留指数。
又称 Kovats指数。
Ix = 100 [ z + n ]
z和 z + n为正构烷烃的碳原子数,n 一般为 1
)()(
)()(
'lg'lg
'lg'lg
zRnzR
zRxR
tt
tt
3．色谱峰高和峰面积
1） peak height,h
2) peak area,A
4,色谱峰区域宽度
1）标准差 （ standard deviation,σ）,0.607倍峰高处的峰宽之半。
2）半峰宽（ peak width at half height,W1/2）
W1/2= 2.355σ
3) 峰底宽 （ peak width,W）,通过色谱峰两侧拐点作切线，在基线上所截得的距离
W = 1.699 W1/2= 4σ
5,分离度 (resolution,R)
R =
R = 1.5时，两峰完全分开，称基线分离。
2/)( 21
12
WW
tt RR
（三）分配系数与色谱分离
1．分配系数和容量因子
分配系数（ distribution coefficient,K）,
在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的浓度之比
K = Cs /Cm
K与组分、固定相和流动相的性质和温度有关。在固定相、流动相和温度一定时,K是组分的特征参数。
容量因子（ capacity factor,k）
在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量之比
k = ms / mm = (CsVs)/ (CmVm) = K × (Vs/ Vm)
2,K和 k与保留时间的关系
设流动相的线速度为 u，样品组分的速度为 v，将二者之比称为保留比,
R’ = v / u (1)
在定距展开的柱色谱中,v = L / tR,u = L / t0,则：
R’ = t0 / tR (2)
因 t0近似于组分在流动相中的时间 tm，溶质分子只有出现在流动相中时才能随流动相前移故保留比与溶质分子在流动相中的分数有关：
R’ =
R’ = (3)
由（ 2）和（ 3）式，得,tR = t0 ( 1+k ) (4)
tR = t0 ( 1+ K ) (5)
(5)式为色谱过程方程，表示保留时间与分配系数的关系
ssmm
mm
sm
m
sm
m
VCVC
VC
NN
N
tt
t
k?1
1
m
s
V
V
容量因子与保留时间的关系,
k =
3．色谱分离的前提
两组分 A和 B:
tRA = t0 ( 1+ KA ) tRB = t0 ( 1+ KB )
tR = tRA - tRB = t0 (KA – KB)
两组分如果被分离，保留时间必须不等，则两组分的 K必须不等,--
-----色谱分离的前提。
或?tR = tRA - tRB = t0 (kA – kB),即容量因子不等是分离的前提。
00
0 '
t
t
t
tt RR
m
s
V
V
m
s
V
V
m
s
V
V
四．基本类型色谱方法及其分离机制
（一）分配色谱法
分离原理：
利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别进行分离
K = Cs/Cm = (Xs/Vs) / (Xm/Vm)
Xs,溶解在固定相中的组分溶质分子
Xm,溶解在流动相中的组分溶质分子
包括：
气液分配色谱法 ;
液液分配色谱法 (正相分配色谱和反相分配色谱 )
（二）吸附色谱法
分离原理,
利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别进行分离。吸附过程是组分分子和流动相分子争夺吸附剂表面活性中心的过程。
吸附系数 Ka = (Xa/Sa) / (Xm/Vm)
Xa,被吸附的组分分子
Xm：流动相中的组分溶质分子
Sa,吸附剂的表面积
包括：气固吸附色谱法和液固吸附色谱法。
（三）离子交换色谱法
分离原理,
利用被分离组分离子交换能力的差别进行分离。
RSO3-H+ + Na+ RSO3-Na+ + H+
用通式表示：
R- B+ + A+ = R —A + B+
离子交换反应的选择性系数：
K A/B = =
KA和 KB为分配系数,K A/B越大，说明 A的交换能力越大。
]][[
]][[
ABR
BAR
B
AKKBBR AAR ]/[][ ]/[][
固定相,离子交换树脂
交联度
交换容量
粒度影响保留行为的因素：
溶质离子的电荷和水合半径
离子交换剂的交联度和交换容量
流动相组成和 pH
（四）空间排阻色谱法又称分子排阻色谱法，凝胶色谱法（ gel chromatography
分离原理：
利用被分离组分分子的线团尺寸差异进行分离。在高分子溶液中，相同成分的分子的线团尺寸与其分子量成正比，因此组分按分子量大小差异进行分离。
渗透系数 Kp = [Xs]/[Xm]
Kp由溶质分子的线团尺寸和凝胶孔隙大小所决定。凝胶孔隙一定时，分子的线团尺寸越大，越不易进入凝胶孔隙。
固定相：
凝胶．主要性能参数：
1）平均孔径
2）排斥极限：化合物的分子量达到一定值时，就不能进入凝胶的任何孔隙，这一分子量为凝胶的排斥极限；
3）分子量范围：排斥极限与全渗透点（ Kp = 1）之间的分子量范围。
流动相：
应能溶解样品组分，同时还必须能润湿凝胶；粘度低
总结,
根据色谱过程方程：
tR = t0 ( 1+ K )
上述各种色谱法中,K分别为分配系数，吸俯系数，选择性系数和渗透系数,Vs分别为色谱柱内固定相体积，吸附剂表面积，离子交换剂总交换容量和凝胶孔内总容积。
m
sVV
m
s
V
V
五．色谱法基本理论
1．塔板理论在解释流出曲线的形状、评价柱效等方面比较好。
假设：
在色谱柱内一小段长度 H内，组分可以在 2相中瞬间达到分配平衡。
样品和新鲜流动相都加在第 0号塔板上。
试样的纵向扩散可以忽略。
分配系数在各塔板上是常数。
理论塔板高度 H（ plate height,height equivalent to a
theoretical plate）,
H = L / n
理论塔板数 n ( the number of theoretical plates):
n = 16 (tR /W)2 = 5.54 (tR /W1/2)2
2,速率理论能阐明影响柱效的因素。
H = A + B/u + Cu
A,涡流扩散 （ eddy diffusion），
也叫多径扩散
B/u：纵向扩散（ longitudinal diffusion）
C,传质阻抗 （ mass transfer
resistance）
