第三章 高效液相色谱法
high performance liquid
chromatography,HPLC
一,概述
1,HPLC：
是以高压输送流动相，采用高效固定相和高灵敏度检测器，在 经典液相色谱法的基础上 发展而成的一种现代液相色谱分离分析技术。
2．经典液相色谱
主要指经典填充柱液相色谱。
一般使用大于 100μm粒经的多孔吸附剂作为固定相，固定相的粒径范围较宽；
色谱柱内径一般为 10-20mm；
流动相依靠重力作用自上而下通过色谱固定相，
分离速度慢；
2．经典液相色谱
色谱系统传质阻力大，纵向扩散明显，柱效低；
色谱柱填充、样品收集等为手工操作，自动化水平不高；
不需特殊仪器设备，成本低，适用于样品的初步分离、纯品制备等。
3,HPLC优点
与经典液相色谱比较：
1) 固定相颗粒极细（一般小于 10μm），粒度规则均匀，传质阻力小，柱效高，分离效率高；
2) 采用高压泵输送流动相，流速快，分析速度快；
3) 采用高灵敏度检测器，在线检测，自动化程度高，定量准确、精密度高。
与 GC比较：
1) 不受样品的挥发性和热稳定性的影响，
应用范围广；
2) 可选用性质不同的各种溶剂为流动相，
提高了分离选择性；
3) 室温条件下进行分离，不需高柱温。
4,HPLC的主要类型
1）按固定相的聚集状态分：液液色谱法（ LLC）
和液固色谱法（ LSC）
2) 按分离机制分：
分配、吸附、离子交换和空间排阻色谱法；
亲和色谱法；手性色谱法；
胶束色谱法；毛细管电色谱法。
3） 化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的一大类色谱法二,仪器装置 — --高效液相色谱仪包括输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测系统和数据处理系统。
1,输液系统
高压输液泵：分恒压泵和恒流泵，常用恒流泵。
贮液瓶：其中的 流动相应脱气 （超声波脱气和抽真空脱气）
2,进样及分离系统
1）进样器：分六通进样阀和自动进样装置。
六通进样阀进样：体积由固定体积的进样管
（ sampling loop）控制。装样位置（ load）
和进样位置 (injection)。 为了确保进样准确,
用微量注射器装样时，所取样品体积应大于进样管的体积。
样品残流问题及排除方法
2,进样及分离系统
2）色谱柱：分离核心，常用 4.6mm id × 15 or
25cm long 不锈钢柱
装柱：匀浆法
柱平衡：
柱头堵塞，填料变松或塔陷：
流动相对色谱柱的影响：实验完毕先后用水、
甲醇冲洗色谱柱至柱压恒定。
3．检测系统
常用 detector
1) UV,
单波长 UV
多波长 UV
光电二极管阵列检测器（ photodiode array detector,
PDAD）,
复合光 —— 吸收池 —— 单色器 —— 各单色光照射在二极管阵列装置上可获得三维光谱 -色谱图。吸收光谱用于定性，色谱峰面积用于定量。
2）荧光检测器
3）电化学检测器 — --安培检测器溶质在电极表面发生氧化还原反应，产生的电流与流动相中物质的浓度有关。
4）通用性检测器：
示差折光和蒸发光散射检测器三．硅胶高效液相色谱
硅胶 (silica gel)是硅酸在高温下脱水、缩合而生成的一种干凝胶，是 HPLC中应用最多的固定相填料。
用作 LSC的主要固定相,LLC的重要载体，
化学键合相的基质材料。
硅胶 HPLC主要讨论以硅胶为吸附剂的 LSC，
以硅胶为载体的 LLC分配色谱。
（一）硅胶填料主要类型
1．表面多孔层硅胶
也称薄壳型硅胶。
粒度较粗，能耐高压，易填充均匀，表面孔隙浅而均匀，传质快，柱效高，分离速度快。
缺点是表面积小，柱容量低，允许进样量小，
容易发生超载现象。
2．全多孔微粒硅胶
由毫微米粒度的二氧化硅微粒凝集而成，也称堆积硅珠。是最理想的 HPLC固定相。
5μm和 10μm两种应用最多。有不规则形和球型两种。
特点：表面积大，样品容量高，柱效高，但不易填充均匀，因此不能用干法装柱，而必须用匀浆装柱。
（二）硅胶的表面结构
1．表面积
硅胶的 比表面积 （每克硅胶的表面积）与孔径大小成反比。
2．表面活性
表面活性取决于硅胶表面含有的硅羟基。
游离硅羟基：活性最高
氢化硅羟基：活性有所降低
硅氧环：活性很弱
活性的调节：在硅胶中加入一定量水，利用物理吸附水降低活性。
（三）液固吸附色谱
1．吸附色谱分离机理
决定溶质保留的因素：
溶质和流动相溶剂分子对吸附剂表面活性吸附点的竞争；
溶质分子中的各种官能团和吸附剂表面吸附中心的特殊相互作用；
流动相溶剂对样品组分的溶解能力。
2．影响分离选择性的因素
1）样品分子结构
2）吸附剂及其活性
3）流动相
（四）液 -液分配色谱
1．载体：
常用全多孔硅胶。能涂渍大量固定液（ 30-
50%），柱效高，样品容量大。
2．固定液和流动相：
正相 LLC,固定液常用极性较高的醚和醇；流动相常为非极性的烃类；
反相 LLC,常用固定液为氰乙基硅酮，碳氢聚合物等；流动相为甲醇 -水，乙腈 -水四．化学键合相色谱 bonded-phase
chromatography,BPC
通过供价键将有机固定液结合到硅胶载体表面，形成化学键合固定相。 HPLC中，
80%以上使用的是键合固定相。
（一） BPC主要特点
有机物键合到硅胶表面，消除或掩盖了表面活性点，使表面性质均匀，提高色谱峰对称性。
键合相耐溶剂充洗，耐高温，没有固定液流失，
提高色谱柱的稳定性和使用寿命，分析结果重现性好。
（一） BPC主要特点
改变键合有机分子的结构和官能团类型，可改变固定相的分离选择性，扩大分析样品的范围。
由于固定相稳定性高，不流失，可提高 S/N,因此提高了灵敏度。
最突出的缺点：
商品化填料的重复性不理想；
耐酸碱性能差，流动相一般只能在 pH 2-8范围内使用。
（二）化学键合相的键型、种类和性能参数
1．键型
主要为硅氧烷型键合相（ Si-O-Si-C），有氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应制得。
S i O H S i C 1 8 H 3 7
R 1
R 2
H C l
S i C 1 8 H 3 7
R 1
R 2
S i OC l
2．种类
1）非极性键合相
常见的有烃基、苯基等键合相
2）弱极性键合相
常见的有醚基、硝基等键合相
3）极性键合相
常见的有氨基、氰基、二羟基等键合相
4）其它特殊键合相：
键合型离子交换剂：表面键合基团为磺酸基 -SO3H,季铵基等
键合型手性固定相：表面键合基团为环糊精，冠醚，大环药物（如万古霉素）等
键合型亲合色谱固定相：蛋白质键合硅胶
2．性能参数
1） 键合有机分子数表示方法：
含碳量 C%,烃类键合相常用，用元素分析测定。
有机物重量：用热失重法测定。加热使键合相断裂。
表面键合浓度：每平方米硅胶表面上有机分子的微摩尔数
C =
W,有机物重量（ μg/g硅胶）； M,有机物分子量； S:
硅胶比表面积
)/( 2mm o lSM W
2）表面覆盖率
参加键合反应的硅羟基数（对单功能基键合试剂形成单分子键合相而言，等于键合的有机基团数）占硅胶表面硅羟基总数的比例。一般小于 1。
3）游离硅羟基
包括硅胶表面未反应完的硅羟基和硅烷化试剂可能引入的新的硅羟基。
（三）正相键合相色谱以极性键合相为固定相，弱极性或非极性溶剂为流动相进行的 HPLC,
1．主要分离对象：
能溶于有机溶剂的各种极性的分子型化合物。
2．常用固定相：
氰基、氨基、二羟基键合硅胶等极性键合相。
氰基键合相常用于含双键化合物的分离；
氨基键合相常用于含多功能基化合物的分离，如糖类、甾体的分离
3．常用流动相：
烷烃（如正戊烷，正己烷）加适量极性调节剂
（醚，醇，氯仿，二氯甲烷,THF,乙腈等）。
流动相极性越高，其洗脱能力越强。
4．分离机理：
分配过程：溶质的保留主要取决于其在固定相和流动相中的溶解性
吸附过程：溶质的保留主要取决于它与键合极性基团间的诱导、氢键和静电作用。
5．决定分离选择性的因素：
键合相的种类，流动相的极性和样品的性质。
（四）反相键合相色谱
以非极性键合相或弱极性、中等极性键合相为固定相，极性溶剂为流动相进行的 HPLC.
目前,HPLC中,70%以上是采用 RP-HPLC
进行的。
1．分离对象,
分子型、离子型化合物均可用 RP-HPLC分离分析。
2．常用固定相
十八烷基硅烷（ C18）,辛烷基硅烷（ C8）、苯基键合硅胶等非极性固定相。
短链烷烃基键合相能用于极性化合物的分离；
苯基键合相适用于分离分析芳香化合物及多羟基化合物。
当分离强极性化合物时，极性键合相也能用于反相色谱，如分离糖类时，可用氨基键合相作固定相，
用乙腈 -水为流动相。
3．常用流动相
以水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂；
常用甲醇 -水，乙腈 -水。
流动相极性越低，其洗脱能力越强。
4．分离机理疏溶剂理论（ solvophobic theory） （疏水作用）
非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂
（流动相）接触时，产生相互排斥力（即产生疏溶剂作用），而从溶剂中被“挤出”，与固定相表面的非极性部分产生缔合作用（即疏溶剂缔合），使溶质保留在固定相中。
即溶质的保留不是由于溶质与键合相之间的非极性相互作用引起的。
5．影响溶质保留行为的因素
1）溶质的分子结构：
溶质极性越弱，疏水作用越强,k越大
２）流动相溶剂的性质
溶剂的表面张力、介电常数增大，溶质的保留增加；
水 -有机溶剂混合溶剂中，有机溶剂含量增加，表面张力和介电常数下降,溶质的 k减小 。
3）流动相中性盐的影响
盐的加入，使溶剂的表面张力增加，非离子性溶质的 k增加；
对离子性溶质，其 k随盐浓度增加而减小，可能由于溶质与流动相间的静电作用增强所致。
４）流动相 pH
对弱酸、弱碱性溶质的保留，影响大。
若 pH控制不当，则溶质解离,k减小，同时使色谱峰扩张和拖尾。
需调节流动相的 pH，抑制溶质的解离，增加溶质与固定相的非极性缔合作用，增强保留，同时可改善色谱峰形 ------称离子抑制色谱法,通常适用于 3? pKa? 7的弱酸和 7? pKa? 8的弱减。
调节 pH的方法,
流动相中加入少量弱酸：常用醋酸，对弱酸性溶质
流动相中加入少量弱碱：常用氨水，三乙胺，对弱碱性溶质
流动相中加入少量缓冲盐：常用磷酸盐，醋酸盐
5）固定相性质
非极性大，溶质保留强。
自学,CE在体内药物分析中的应用”一节。
根据示例及已学知识，做下列思考题：
有一种药物在水溶液中存在下列离解平衡：
即该药物在酸性条件下主要带正电，在 pH大于 9.0条件下主要带负电。请根据药物结构及离解平衡，设计一种完整的 CE分析方法测定血浆中该药物的浓度，简要说明设计理由。 （方法不需很具体）
C H
3
O O
O
O O H
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
C H
3
O O
O
O O H
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
C H
3
O O
O
O O
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
N H
3
+
N H
2
N H
2
p K a
1
= 7,7
p K a
2
= 9,0
high performance liquid
chromatography,HPLC
一,概述
1,HPLC：
是以高压输送流动相，采用高效固定相和高灵敏度检测器，在 经典液相色谱法的基础上 发展而成的一种现代液相色谱分离分析技术。
2．经典液相色谱
主要指经典填充柱液相色谱。
一般使用大于 100μm粒经的多孔吸附剂作为固定相，固定相的粒径范围较宽；
色谱柱内径一般为 10-20mm；
流动相依靠重力作用自上而下通过色谱固定相，
分离速度慢；
2．经典液相色谱
色谱系统传质阻力大，纵向扩散明显，柱效低；
色谱柱填充、样品收集等为手工操作，自动化水平不高；
不需特殊仪器设备，成本低，适用于样品的初步分离、纯品制备等。
3,HPLC优点
与经典液相色谱比较：
1) 固定相颗粒极细（一般小于 10μm），粒度规则均匀，传质阻力小，柱效高，分离效率高；
2) 采用高压泵输送流动相，流速快，分析速度快；
3) 采用高灵敏度检测器，在线检测，自动化程度高，定量准确、精密度高。
与 GC比较：
1) 不受样品的挥发性和热稳定性的影响，
应用范围广；
2) 可选用性质不同的各种溶剂为流动相，
提高了分离选择性；
3) 室温条件下进行分离，不需高柱温。
4,HPLC的主要类型
1）按固定相的聚集状态分：液液色谱法（ LLC）
和液固色谱法（ LSC）
2) 按分离机制分：
分配、吸附、离子交换和空间排阻色谱法；
亲和色谱法；手性色谱法；
胶束色谱法；毛细管电色谱法。
3） 化学键合相色谱法以化学键合相为固定相的一大类色谱法二,仪器装置 — --高效液相色谱仪包括输液系统、进样系统、色谱柱分离系统、检测系统和数据处理系统。
1,输液系统
高压输液泵：分恒压泵和恒流泵，常用恒流泵。
贮液瓶：其中的 流动相应脱气 （超声波脱气和抽真空脱气）
2,进样及分离系统
1）进样器：分六通进样阀和自动进样装置。
六通进样阀进样：体积由固定体积的进样管
（ sampling loop）控制。装样位置（ load）
和进样位置 (injection)。 为了确保进样准确,
用微量注射器装样时，所取样品体积应大于进样管的体积。
样品残流问题及排除方法
2,进样及分离系统
2）色谱柱：分离核心，常用 4.6mm id × 15 or
25cm long 不锈钢柱
装柱：匀浆法
柱平衡：
柱头堵塞，填料变松或塔陷：
流动相对色谱柱的影响：实验完毕先后用水、
甲醇冲洗色谱柱至柱压恒定。
3．检测系统
常用 detector
1) UV,
单波长 UV
多波长 UV
光电二极管阵列检测器（ photodiode array detector,
PDAD）,
复合光 —— 吸收池 —— 单色器 —— 各单色光照射在二极管阵列装置上可获得三维光谱 -色谱图。吸收光谱用于定性，色谱峰面积用于定量。
2）荧光检测器
3）电化学检测器 — --安培检测器溶质在电极表面发生氧化还原反应，产生的电流与流动相中物质的浓度有关。
4）通用性检测器：
示差折光和蒸发光散射检测器三．硅胶高效液相色谱
硅胶 (silica gel)是硅酸在高温下脱水、缩合而生成的一种干凝胶，是 HPLC中应用最多的固定相填料。
用作 LSC的主要固定相,LLC的重要载体，
化学键合相的基质材料。
硅胶 HPLC主要讨论以硅胶为吸附剂的 LSC，
以硅胶为载体的 LLC分配色谱。
（一）硅胶填料主要类型
1．表面多孔层硅胶
也称薄壳型硅胶。
粒度较粗，能耐高压，易填充均匀，表面孔隙浅而均匀，传质快，柱效高，分离速度快。
缺点是表面积小，柱容量低，允许进样量小，
容易发生超载现象。
2．全多孔微粒硅胶
由毫微米粒度的二氧化硅微粒凝集而成，也称堆积硅珠。是最理想的 HPLC固定相。
5μm和 10μm两种应用最多。有不规则形和球型两种。
特点：表面积大，样品容量高，柱效高，但不易填充均匀，因此不能用干法装柱，而必须用匀浆装柱。
（二）硅胶的表面结构
1．表面积
硅胶的 比表面积 （每克硅胶的表面积）与孔径大小成反比。
2．表面活性
表面活性取决于硅胶表面含有的硅羟基。
游离硅羟基：活性最高
氢化硅羟基：活性有所降低
硅氧环：活性很弱
活性的调节：在硅胶中加入一定量水，利用物理吸附水降低活性。
（三）液固吸附色谱
1．吸附色谱分离机理
决定溶质保留的因素：
溶质和流动相溶剂分子对吸附剂表面活性吸附点的竞争；
溶质分子中的各种官能团和吸附剂表面吸附中心的特殊相互作用；
流动相溶剂对样品组分的溶解能力。
2．影响分离选择性的因素
1）样品分子结构
2）吸附剂及其活性
3）流动相
（四）液 -液分配色谱
1．载体：
常用全多孔硅胶。能涂渍大量固定液（ 30-
50%），柱效高，样品容量大。
2．固定液和流动相：
正相 LLC,固定液常用极性较高的醚和醇；流动相常为非极性的烃类；
反相 LLC,常用固定液为氰乙基硅酮，碳氢聚合物等；流动相为甲醇 -水，乙腈 -水四．化学键合相色谱 bonded-phase
chromatography,BPC
通过供价键将有机固定液结合到硅胶载体表面，形成化学键合固定相。 HPLC中，
80%以上使用的是键合固定相。
（一） BPC主要特点
有机物键合到硅胶表面，消除或掩盖了表面活性点，使表面性质均匀，提高色谱峰对称性。
键合相耐溶剂充洗，耐高温，没有固定液流失，
提高色谱柱的稳定性和使用寿命，分析结果重现性好。
（一） BPC主要特点
改变键合有机分子的结构和官能团类型，可改变固定相的分离选择性，扩大分析样品的范围。
由于固定相稳定性高，不流失，可提高 S/N,因此提高了灵敏度。
最突出的缺点：
商品化填料的重复性不理想；
耐酸碱性能差，流动相一般只能在 pH 2-8范围内使用。
（二）化学键合相的键型、种类和性能参数
1．键型
主要为硅氧烷型键合相（ Si-O-Si-C），有氯硅烷与硅胶进行硅烷化反应制得。
S i O H S i C 1 8 H 3 7
R 1
R 2
H C l
S i C 1 8 H 3 7
R 1
R 2
S i OC l
2．种类
1）非极性键合相
常见的有烃基、苯基等键合相
2）弱极性键合相
常见的有醚基、硝基等键合相
3）极性键合相
常见的有氨基、氰基、二羟基等键合相
4）其它特殊键合相：
键合型离子交换剂：表面键合基团为磺酸基 -SO3H,季铵基等
键合型手性固定相：表面键合基团为环糊精，冠醚，大环药物（如万古霉素）等
键合型亲合色谱固定相：蛋白质键合硅胶
2．性能参数
1） 键合有机分子数表示方法：
含碳量 C%,烃类键合相常用，用元素分析测定。
有机物重量：用热失重法测定。加热使键合相断裂。
表面键合浓度：每平方米硅胶表面上有机分子的微摩尔数
C =
W,有机物重量（ μg/g硅胶）； M,有机物分子量； S:
硅胶比表面积
)/( 2mm o lSM W
2）表面覆盖率
参加键合反应的硅羟基数（对单功能基键合试剂形成单分子键合相而言，等于键合的有机基团数）占硅胶表面硅羟基总数的比例。一般小于 1。
3）游离硅羟基
包括硅胶表面未反应完的硅羟基和硅烷化试剂可能引入的新的硅羟基。
（三）正相键合相色谱以极性键合相为固定相，弱极性或非极性溶剂为流动相进行的 HPLC,
1．主要分离对象：
能溶于有机溶剂的各种极性的分子型化合物。
2．常用固定相：
氰基、氨基、二羟基键合硅胶等极性键合相。
氰基键合相常用于含双键化合物的分离；
氨基键合相常用于含多功能基化合物的分离，如糖类、甾体的分离
3．常用流动相：
烷烃（如正戊烷，正己烷）加适量极性调节剂
（醚，醇，氯仿，二氯甲烷,THF,乙腈等）。
流动相极性越高，其洗脱能力越强。
4．分离机理：
分配过程：溶质的保留主要取决于其在固定相和流动相中的溶解性
吸附过程：溶质的保留主要取决于它与键合极性基团间的诱导、氢键和静电作用。
5．决定分离选择性的因素：
键合相的种类，流动相的极性和样品的性质。
（四）反相键合相色谱
以非极性键合相或弱极性、中等极性键合相为固定相，极性溶剂为流动相进行的 HPLC.
目前,HPLC中,70%以上是采用 RP-HPLC
进行的。
1．分离对象,
分子型、离子型化合物均可用 RP-HPLC分离分析。
2．常用固定相
十八烷基硅烷（ C18）,辛烷基硅烷（ C8）、苯基键合硅胶等非极性固定相。
短链烷烃基键合相能用于极性化合物的分离；
苯基键合相适用于分离分析芳香化合物及多羟基化合物。
当分离强极性化合物时，极性键合相也能用于反相色谱，如分离糖类时，可用氨基键合相作固定相，
用乙腈 -水为流动相。
3．常用流动相
以水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂；
常用甲醇 -水，乙腈 -水。
流动相极性越低，其洗脱能力越强。
4．分离机理疏溶剂理论（ solvophobic theory） （疏水作用）
非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂
（流动相）接触时，产生相互排斥力（即产生疏溶剂作用），而从溶剂中被“挤出”，与固定相表面的非极性部分产生缔合作用（即疏溶剂缔合），使溶质保留在固定相中。
即溶质的保留不是由于溶质与键合相之间的非极性相互作用引起的。
5．影响溶质保留行为的因素
1）溶质的分子结构：
溶质极性越弱，疏水作用越强,k越大
２）流动相溶剂的性质
溶剂的表面张力、介电常数增大，溶质的保留增加；
水 -有机溶剂混合溶剂中，有机溶剂含量增加，表面张力和介电常数下降,溶质的 k减小 。
3）流动相中性盐的影响
盐的加入，使溶剂的表面张力增加，非离子性溶质的 k增加；
对离子性溶质，其 k随盐浓度增加而减小，可能由于溶质与流动相间的静电作用增强所致。
４）流动相 pH
对弱酸、弱碱性溶质的保留，影响大。
若 pH控制不当，则溶质解离,k减小，同时使色谱峰扩张和拖尾。
需调节流动相的 pH，抑制溶质的解离，增加溶质与固定相的非极性缔合作用，增强保留，同时可改善色谱峰形 ------称离子抑制色谱法,通常适用于 3? pKa? 7的弱酸和 7? pKa? 8的弱减。
调节 pH的方法,
流动相中加入少量弱酸：常用醋酸，对弱酸性溶质
流动相中加入少量弱碱：常用氨水，三乙胺，对弱碱性溶质
流动相中加入少量缓冲盐：常用磷酸盐，醋酸盐
5）固定相性质
非极性大，溶质保留强。
自学,CE在体内药物分析中的应用”一节。
根据示例及已学知识，做下列思考题：
有一种药物在水溶液中存在下列离解平衡：
即该药物在酸性条件下主要带正电，在 pH大于 9.0条件下主要带负电。请根据药物结构及离解平衡，设计一种完整的 CE分析方法测定血浆中该药物的浓度，简要说明设计理由。 （方法不需很具体）
C H
3
O O
O
O O H
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
C H
3
O O
O
O O H
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
C H
3
O O
O
O O
O H
O H
O
O H
H O
O
H
H
3
C
N H
3
+
N H
2
N H
2
p K a
1
= 7,7
p K a
2
= 9,0
