第二章 毛细管电泳技术及其应用
Capillary Electrophoresis
1．经典平板电泳的最大局限：
高压电场产生的焦耳热效应，导致电泳区带展宽，分离度降低。这种影响还会由于电场强度的增大而迅速加剧，
极大地限制了高电压的使用，难以提高电泳分离速度。
一,CE概述
2,CE及其特点
毛细管电泳或高效毛细管电泳（ CE 或 HPCE）
是以高压直流电场为驱动力，荷电粒子在毛细管内按其电泳淌度或 /和分配系数不同进行分离的一种电泳新技术。
和平板电泳相比,CE过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而可引入高电场强度，全面改善分离质量。
CE最显著特点,高效、快速和样品用量少。
3,CE与 HPLC的比较
CE优势,柱效更高，分析速度更快，而样品用量仅为 HPLC的几百分之一；同时，
它不需高压泵输送系统，溶剂消耗极少，
成本相对较低；另外，通过简单的操作模式和缓冲液体系改变,CE即可实现不同理化性质样品组分的有效分离，而为了达到类似目的,HPLC需要价格相对昂贵的色谱柱和有机溶剂。
3,CE与 HPLC的比较
CE 不足,由于进样量小，采用柱上在线检测，光径长度短，其灵敏度不如 HPLC；
同时由于电渗流难以定量控制及进样精确性的影响,CE的分离重现性和定量准确性也比 HPLC逊色。
4,CE发展趋势
目前,CE仍然是分析化学的一个热门研究分支，其理论、仪器、应用等各方面都在不断发展。其中 CE在生物学、医学和药学领域的应用已相当广泛，分离分析对象涉及到多肽、
蛋白质、核酸、氨基酸、有机药物、无机离子等多种物质以及单个细胞中各种化学成分。
4,CE发展趋势
最新版中国药典（ 2000年版）和美国药典（第 26版）均已收录 CE。
在今后较长一段时间内,CE 将和 HPLC
并驾齐驱，互为补充，成为生物医药学领域的一种重要分离分析工具。
二,CE基本理论
1．电泳和电泳淌度
电泳是带电粒子在电场作用下的定向迁移。电泳分离是基于组分在电场作用下的差速迁移进行的。带电粒子在电场下的迁移速度（ 电泳速度 ）为：
νe = μe E (1)
式中 E为电场强度，是指单位距离的电压降（ V/cm）；
μe为 电泳淌度,是指单位电场下带电粒子的迁移速度。
对给定粒子、分离介质和操作温度，电泳淌度为一常数。
处于电场中的带电粒子以迁移速度 νe运动时，受到电场力和粘滞阻力（或称摩擦力）两种力的作用，对电场力（ FE）有：
FE = qE (2)
而粘滞阻力（ FF）正比于粒子的迁移速度，方向与电场力相反：
FF = f νe (3)
对于球形粒子,f由 Stokes定律给出：
f = 6 π η r (4)
式中 q为粒子电荷,f为摩擦系数,η为介质粘度,r为粒子半径。
当电场力与摩擦力相对平衡时，离子以稳定速度运动。即：
qE = 6 π η r ν e (5)
显然，电泳淌度为：
μe = (6)
可见，粒子半径越小、粒子所带电荷越多、分离介质的粘度越小，电泳淌度越大。 电泳淌度不同是电泳分离的基础 。
r
q
6
2,电渗流电渗流（ electrophoresis flow,EOF）或电渗是毛细管内溶液在电场作用下 整体朝一个方向运动 的现象。
形成,对石英毛细管来说，一般情况下，由于硅醇基（ -SiOH）电离，管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合阳离子被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极迁移，由于离子是溶剂化的，因此带动了毛细管中的整体溶液向阴极迁移，其过程如图 2-1。石英毛细管中的 EOF通常是从 阳极流向阴极 。
Figure 2-1 Schematic of creating EOF.
EOF大小可用电渗速度（ νeo）或电渗淌度（ μeo）
来表示：
νeo = E (7)
μeo = (8)
式中 ξ 为双电层的 Zeta电位,ε为分离介质的介电常数。 电渗速度可用实验方法求得,
νeo = l / teo (9)
式中 l为毛细管有效长度（从进样端至检测窗的长度）,teo为电渗流标记物（中性物质）从进样端迁移至检测窗所需时间。
EOF的特点：
(1) 平面流型
EOF的一个重要特点是具有平面流型，电渗速度的径向分布几乎是均匀的，不引起样品区带扩散。
HPLC中,由于泵驱动,液体和固体表面接触处的摩擦力会导致压力下降,因此 HPLC的液体流型则是抛物线型，柱管中心速度为平均速度的两倍，使样品区带大大展宽（见图 2-2）。
Figure 2-2 Schematic of the flow shape and the sample peaks in CE (a) and HPLC (b),
（ 2）电渗速度大
EOF的速度一般比荷电粒子的电泳速度大,
因而可以使所有样品组分（正离子、中性分子、负离子）沿相同方向迁移，实现一次 CE
操作同时完成正、负离子和中性分子的分离分析。各组分从进样端迁移到检测窗所需时间（迁移时间）取决于电渗速度和组分电泳速度的矢量和，迁移过程如图 2-3所示。
Figure 2-3 Schematic for the migration of different samples in CE.
影响 EOF的因素
（ 1） 电场强度
EOF与电场强度成正比。当毛细管长度固定时，
与外加电压 V成正比。但 V太高时，由于毛细管不能有效地散失产生的焦耳热,EOF会偏离线性。
（ 2） 缓冲液组成、浓度和 pH
对同一种缓冲液,EOF随浓度增加而降低。
因浓度增加，双电层厚度变薄,Zeta电势下降，
EOF减小。
对石英毛细管,pH增加,Si-OH易电离，负电荷密度增大,Zeta电势增高,EOF增大。
（ 3） 毛细管材料
（ 4）缓冲液添加剂中性盐,增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，
EOF降低。缺点是热效应大，电流升高。
两性离子,如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-CH2-COO-。
可增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离,EOF
降低。但不增加电流。
表面活性剂,如烷基季铵盐有机溶剂,影响机理复杂
（ 5） 柱温,
T升高,CE buffer 粘度降低,EOF增大。
3．柱效和分离度
CE的柱效用理论塔板数（ the number of theoretical
plates,N）表示，其表达式来源于色谱理论：
N = （ μe + μeo） (10)
式中 μe 为电泳淌度,μeo为电渗淌度,V为操作电压，
l为毛细管有效长度,D为溶质的扩散系数,L为毛细管总长度。
DL
Vl
2
实际理论塔板数 可以直接从电泳图谱中求得：
N =5.54 (tm / W1/2) 2 (11)
式中 tm 为迁移时间,W1/2为半峰宽。由式
（ 11）求得的柱效总是小于由式（ 10）计算的理论值。
影响 CE柱效的因素,
CE buffer 和溶质本身,主要是自热、扩散和吸附 ;
1) 自热在毛细管内产生径向温度梯度,进而产生径向粘度梯度,使带电粒子的迁移速度产生径向不均匀分布,EOF的平面流型被破坏,导致区带展宽,
2) 扩散,主要是溶质的纵向扩散
3) 吸附,静电吸附和疏水作用引起的吸附
系统本身,如进样和检测,
CE中两相邻组分的分离度可用下列公式表示：
Rs = (12)
式中 为两组分电泳淌度之差,为两组分平均电泳淌度。可见，分离度不仅取决于两组分的电泳淌度，也与电渗流有关。
2/1
)(24
1
eoe
e
DL
Vl
e
e?
分离度也可用 实验方法 测定：
Rs = (3)
式中 tm为迁移时间,W为峰底宽度，
脚标 1,2分别代表两个组分。
2/)( 21
12
WW
tt mm
4．分离模式根据分离介质、分离机理不同,CE有多种分离模式。
毛细管区带电泳 （ capillary zone electrophoresis,
CZE）,又称自由溶液毛细管电泳，是 CE中最简单、
最基本、应用最广泛的一种分离模式，分离介质为缓冲液，基于带电溶质电泳淌度的不同进行分离。
溶质组分间的分离只受组分本身结构特点和缓冲液组成的影响，能分离电泳淌度差别很小的组分。 由于存在 EOF，阴、阳离子可同时被分析，中性溶质与
EOF同时流出 。为了降低 EOF和吸附现象，可对毛细管内壁改性。
胶束电动毛细管色谱 （ micellar electrokinetic
capillary chromatography,MECC）,CE借用胶束色谱 准固定相 分离技术的一种分离模式。 在缓冲液分离介质中加入离子型表面活性剂，形成的胶束为准固定相，电中性溶质以不同的分配系数在水相和准固定相之间进行分配并随电渗流在毛细管内迁移而达到分离。 它是 CE中唯一能同时分离中性溶质和离子型溶质的分离模式。 电动毛细管色谱的其它模式还有环糊精电动色谱、离子交换电动色谱和微乳胶电动色谱，它们分别用环糊精衍生物、高聚物离子和微乳胶代替 MECC中的胶束作为准固定相。
毛细管凝胶电泳 （ capillary gel electrophoresis,
CGE ）,在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶分离介质，主要用于分析蛋白质,DNA等生物大分子化合物。由于毛细管凝胶柱制备困难，且使用寿命较短，进样端易堵，因此有人在 CE缓冲液中加入具有筛分作用的低粘度水溶性高分子聚合物，代替凝胶进行分析，
这种模式称为毛细管非胶筛分电泳。有时将这两种模式总称为毛细管筛分电泳。
毛细管等电聚焦 （ capillary isoelectric
focusing,CIEF）,分别采用酸性和碱性溶液作为两个电极槽溶液，毛细管内充满两性电解质混合溶液，加高电压后，在毛细管柱内产生 pH梯度，当溶质到达与其等电点相应的 pH位置时，由于电荷为零而停止迁移即聚焦形成区带，再在毛细管一端施加压力或改变检测器末端电极槽储液的 pH，
使溶质区带通过检测器。
毛细管等速电泳（ capillary isotachophoresis,
CITP）,使用两个电解质缓冲系统（即前导电解质和尾随电解质），样品夹在前导和尾随电解质之间，所有样品组分区带以相同速度移动，
不同组分按电泳淌度大小被分离。
常采用恒电流操作模式。在分离过程中，场强会自动调整以维持区带的等速移动。
毛细管电色谱 (capillary
electrochromatography,CEC)
包含电泳和色谱两种机制,
溶质组分根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度的差异进行分离,
CEC的介质选择首先是选择合适的固定相,其次才是流动相或缓冲溶液的选择,
根据固定相的极性,CEC包括正相和反相 CEC.
根据固定相的存在方式,CEC包括开管 CEC,
填充 CEC 和整体 CEC
非水毛细管电泳 (non-aqueous capillary
electrophoresis,NACE)
是在以有机溶剂为主体的非水缓冲体系中进行的 CE。
非水体系可承受更高的操作电压,提高分离效率；使在水性体系中难溶而不能用 CE分离的样品得到 CE分离。
但增加了 CE的可优化参数 (如分离介质的极性、介电常数等 )。
常用有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，甲酰胺等。
有机溶剂中常加入的电解质：酸及其铵盐。用于调节分离介质的 pH和分离选择性，使分离介质具有导电性。
三．仪器系统
CE仪器主要包括进样、（高压电场作用下的）分离、检测及数据处理系统，如图 1-4。
Figure 1-4 Schematic of the CE instrumentation,HV,high voltage; C,capillary;
E,electrode vial containing buffer; Pt,platinum electrode; D,detector; S,
sample; DA,data processing apparatus,
进样方式
常用 CE进样方式为电动进样和流体动力学进样（又称压力进样）。
压力进样比电动进样的重现性好。
样品区带长度应小于毛细管总长度的 1%。进样量太大，会使峰变宽甚至使峰形畸变。
电动进样,是在短时间内施加低电压，
通过电迁移作用将样品引入毛细管，其实际进样量与电渗流和被分析组分的电泳淌度有关。
进样方式
流体动力学进样,具体包括 3种进样方式：
（ 1）在毛细管进样端加压；
（ 2）在毛细管出口端抽真空；
（ 3）调节进样端样品池和出口端缓冲液电极槽的相对高度，通过虹吸作用进样。
高压电源
CE一般采用 0～ ± 30kV连续可调的直流高压电源。
电源输出电压的稳定性直接影响 CE分离的重现性，
因此通常要求电压输出精度高于 1%。
高压电源具有恒电压、恒电流或恒功率等方式，
但以恒压最常用。
毛细管
毛细管是 CE分离的核心部件，目前所用毛细管材料有熔融石英、聚四氟乙烯（ teflon）和玻璃，
其中熔融石英最常用。
石英毛细管外壁涂覆聚酰亚胺保护层，以增强弹性、便于操作。
实验前，需除去一小段保护层，形成一个柱上光学检测窗口。常用毛细管内径为 25～ 100μm。
毛细管的清洗。
检测器
信号检测是 CE分析的一个重要因素,CE中的检测器包括：
紫外吸收光谱 (UV)
激光诱导荧光 (LIF)
电化学（ ECD,包括电导、电位和安培法）
质谱（ MS）
折射指数、激光光热、放射、免疫、单细胞生物传感器等检测器。
四,CE分离的优化
（一） CE的外加电压
Voltage升高，迁移时间减小，柱效升高，分离度增加。但由于焦耳热的影响，当 V太高时,N,Rs
反而减小。
tm= N = （ μe + μeo）
Rs =
V
lL
e? DL
Vl
2
2/1
)(24
1
eoe
e DL
Vl
最佳电压的实验选择
毛细管内径和长度一定时，采用某浓度的 CE缓冲液进行实验，据欧姆定律 V=IR,作 I-V曲线来确定最佳电压。
当 CE系统不能有效的散热时,I-V曲线偏离直线
（ R下降,I增加）。曲线的拐点所对应的电压即为最佳电压。
（二） CE的缓冲溶液
１,CE中使用的缓冲溶液应该具有的特点：
在所选的 pH范围内有较强的缓冲能力；
在检测波长处有低的紫外吸收或荧光强度；
低的电泳淌度（即分子量大，电荷小的离子），
以降低所产生的电流。
２．缓冲溶液的 pH效应
1） pH对 EOF的影响
pH 4-6范围,EOF对 pH表现出很强的依赖性，因 Si-OH的电离对 pH非常敏感；
高 pH下（大于 12）,EOF达到最大且变化平缓；低 pH下（小于 2）,EOF接近于０；
２．缓冲溶液的 pH效应
2） pH对样品组分电泳分离的影响离子的电泳淌度直接正比于它的有效电荷，
而离子的有效电荷受缓冲溶液 pH的影响较大，
因此缓冲溶液 pH的调节与控制是优化 CE分离的重要对策。
３．缓冲溶液浓度
１）缓冲溶液浓度对电泳淌度和迁移时间的影响许多实验证实：在恒定 pH条件下，缓冲溶液浓度增加，溶质的电泳淌度降低，迁移时间延长。
２）缓冲溶液浓度对柱效和分离度的影响对柱效的影响很复杂，可根据实验结果确定最佳值。
根据 Rs公式，浓度增加,EOF减小,Rs增加。
（三）缓冲液添加剂
１．添加剂种类
表面活性剂：季铵盐等
有机溶剂：甲醇，乙腈等
两性离子：如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-CH2-
COO-
中性盐,K2SO4,LiCl等
手性试剂：环糊精，冠醚等
其它：如硼砂作为络合剂与糖类和多羟基化合物络合，形成带电荷的络合物，从而使中性物质可用 CZE分离。
２．添加剂的作用
１）控制 EOF大小和方向，增加分离选择性，减少分析时间。 如季铵盐,
季铵盐的浓度和烷烃链长对 EOF影响很大。
浓度增加（ 小于 CMC）,EOF减小，直至反向。
烷烃链增长,EOF受浓度变化的影响加大，长链季铵盐如十四烷基三甲基溴化铵（ TTAB）及十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）在很低浓度下就能使 EOF反向。
反向机理：
烷基季铵离子与带负电荷的毛细管壁因静电引力 形成一单分子层，其烃基端面向缓冲液，和溶液中其他烷基季铵离子的烃基端在范德华引力（疏水作用）的作用下形成第二分子层，第二分子层带正电，因此 EOF反向。
２）抑制管壁吸附作用，提高分离效率和重现性 。
如中性盐、两性离子添加剂和 短链季铵盐
缓冲液中加入高浓度的中性盐，大量的阳离子可与毛细管壁的负电荷结合，因而降低了管壁对样品组分的吸附；同时中性盐增加缓冲液离子强度，
抑制硅醇基电离，也可降低吸附。
两性离子添加剂：如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-
CH2-COO-。可增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，降低吸附。
短链季铵盐：
３）增加溶质的溶解度,如有机溶剂添加剂
４）扩大分离对象，如添加手性试剂进行手性溶质的分离；
５）增加分离介质粘度，降低电流，优化分离条件。如添加有机溶剂。
（四）控制电渗流、消除样品吸附的柱技术
1,动态修饰毛细管壁
1) 改变缓冲液 pH值和离子强度抑制硅醇基离解
采用低 pH（ <２）缓冲液，可抑制硅醇基离解；
高离子强度的缓冲液，也可抑制硅醇基离解。
2) 在缓冲液中加入添加剂使其在毛细管内壁形成一个动态涂层
常用添加剂
A,烷基季铵盐：
TTAB,CTAB等长链烷基季铵盐，可 使
EOF反向。
短链烷基季铵盐可降低电渗流，一般不反向。
B,胺类聚合物：
如聚胺、聚乙烯亚胺等。毛细管内壁吸附聚合物而带正电，也可使电渗流反向。原理与 A相似，也是通过静电引力 ---疏水作用形成双分子层而带正电。
C,亲水性中性聚合物：
如烷基纤维素，聚乙烯醇等，他们与毛细管内壁以氢键作用形成动态涂层，可屏蔽管壁电荷，降低 EOF，但不能改变 EOF方向。
2．毛细管内壁永久涂层
动态修饰的缺点：
改性剂可能干扰分离过程；动态涂层不稳定,EOF波动大，重现性差。
永久涂层具有高稳定性，可提高分析结果的重现性。
1) 物理吸附涂层
通过与管壁的静电或氢键或疏水作用而形成。
纤维素类中性聚合物、胺类聚合物等都能形成吸附涂层。
制备简单，寿命短 。
2）化学键合涂层
通过化学键将涂层键合到毛细管内壁上。制备复杂，但寿命长。
毛细管的化学键合涂层技术可分为三步：毛细管预处理，硅烷化引入活性基团，接上目标涂层试剂，如环糊精，杯芳烃等。
五,CE在生物医药学领域的应用
药品质量控制（杂质检查、含量测定、稳定性评价等）
生物样品中药物及代谢物分析
药物与蛋白质的相互作用
手性药物及结构相似药物的分离分析
蛋白质、多肽、氨基酸和糖类分析
临床疾病诊断分析
核酸及其序列分析
基因突变检测
药物动力学研究
单细胞分析
单分子分析等
1,R,Mandriol,V,Pucci,D,Visini et al,J Pharm,Biomed,Anal.,29,1127,
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2,M,Jaworska,Z,Szulińska,M,Wilk,J,Chromatogr,A,993,165,2003.
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Capillary Electrophoresis
1．经典平板电泳的最大局限：
高压电场产生的焦耳热效应，导致电泳区带展宽，分离度降低。这种影响还会由于电场强度的增大而迅速加剧，
极大地限制了高电压的使用，难以提高电泳分离速度。
一,CE概述
2,CE及其特点
毛细管电泳或高效毛细管电泳（ CE 或 HPCE）
是以高压直流电场为驱动力，荷电粒子在毛细管内按其电泳淌度或 /和分配系数不同进行分离的一种电泳新技术。
和平板电泳相比,CE过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而可引入高电场强度，全面改善分离质量。
CE最显著特点,高效、快速和样品用量少。
3,CE与 HPLC的比较
CE优势,柱效更高，分析速度更快，而样品用量仅为 HPLC的几百分之一；同时，
它不需高压泵输送系统，溶剂消耗极少，
成本相对较低；另外，通过简单的操作模式和缓冲液体系改变,CE即可实现不同理化性质样品组分的有效分离，而为了达到类似目的,HPLC需要价格相对昂贵的色谱柱和有机溶剂。
3,CE与 HPLC的比较
CE 不足,由于进样量小，采用柱上在线检测，光径长度短，其灵敏度不如 HPLC；
同时由于电渗流难以定量控制及进样精确性的影响,CE的分离重现性和定量准确性也比 HPLC逊色。
4,CE发展趋势
目前,CE仍然是分析化学的一个热门研究分支，其理论、仪器、应用等各方面都在不断发展。其中 CE在生物学、医学和药学领域的应用已相当广泛，分离分析对象涉及到多肽、
蛋白质、核酸、氨基酸、有机药物、无机离子等多种物质以及单个细胞中各种化学成分。
4,CE发展趋势
最新版中国药典（ 2000年版）和美国药典（第 26版）均已收录 CE。
在今后较长一段时间内,CE 将和 HPLC
并驾齐驱，互为补充，成为生物医药学领域的一种重要分离分析工具。
二,CE基本理论
1．电泳和电泳淌度
电泳是带电粒子在电场作用下的定向迁移。电泳分离是基于组分在电场作用下的差速迁移进行的。带电粒子在电场下的迁移速度（ 电泳速度 ）为：
νe = μe E (1)
式中 E为电场强度，是指单位距离的电压降（ V/cm）；
μe为 电泳淌度,是指单位电场下带电粒子的迁移速度。
对给定粒子、分离介质和操作温度，电泳淌度为一常数。
处于电场中的带电粒子以迁移速度 νe运动时，受到电场力和粘滞阻力（或称摩擦力）两种力的作用，对电场力（ FE）有：
FE = qE (2)
而粘滞阻力（ FF）正比于粒子的迁移速度，方向与电场力相反：
FF = f νe (3)
对于球形粒子,f由 Stokes定律给出：
f = 6 π η r (4)
式中 q为粒子电荷,f为摩擦系数,η为介质粘度,r为粒子半径。
当电场力与摩擦力相对平衡时，离子以稳定速度运动。即：
qE = 6 π η r ν e (5)
显然，电泳淌度为：
μe = (6)
可见，粒子半径越小、粒子所带电荷越多、分离介质的粘度越小，电泳淌度越大。 电泳淌度不同是电泳分离的基础 。
r
q
6
2,电渗流电渗流（ electrophoresis flow,EOF）或电渗是毛细管内溶液在电场作用下 整体朝一个方向运动 的现象。
形成,对石英毛细管来说，一般情况下，由于硅醇基（ -SiOH）电离，管壁表面带负电，为了保持电荷平衡，溶液中水合阳离子被吸附到表面附近，形成双电层。当在毛细管两端加电压时，双电层中的阳离子向阴极迁移，由于离子是溶剂化的，因此带动了毛细管中的整体溶液向阴极迁移，其过程如图 2-1。石英毛细管中的 EOF通常是从 阳极流向阴极 。
Figure 2-1 Schematic of creating EOF.
EOF大小可用电渗速度（ νeo）或电渗淌度（ μeo）
来表示：
νeo = E (7)
μeo = (8)
式中 ξ 为双电层的 Zeta电位,ε为分离介质的介电常数。 电渗速度可用实验方法求得,
νeo = l / teo (9)
式中 l为毛细管有效长度（从进样端至检测窗的长度）,teo为电渗流标记物（中性物质）从进样端迁移至检测窗所需时间。
EOF的特点：
(1) 平面流型
EOF的一个重要特点是具有平面流型，电渗速度的径向分布几乎是均匀的，不引起样品区带扩散。
HPLC中,由于泵驱动,液体和固体表面接触处的摩擦力会导致压力下降,因此 HPLC的液体流型则是抛物线型，柱管中心速度为平均速度的两倍，使样品区带大大展宽（见图 2-2）。
Figure 2-2 Schematic of the flow shape and the sample peaks in CE (a) and HPLC (b),
（ 2）电渗速度大
EOF的速度一般比荷电粒子的电泳速度大,
因而可以使所有样品组分（正离子、中性分子、负离子）沿相同方向迁移，实现一次 CE
操作同时完成正、负离子和中性分子的分离分析。各组分从进样端迁移到检测窗所需时间（迁移时间）取决于电渗速度和组分电泳速度的矢量和，迁移过程如图 2-3所示。
Figure 2-3 Schematic for the migration of different samples in CE.
影响 EOF的因素
（ 1） 电场强度
EOF与电场强度成正比。当毛细管长度固定时，
与外加电压 V成正比。但 V太高时，由于毛细管不能有效地散失产生的焦耳热,EOF会偏离线性。
（ 2） 缓冲液组成、浓度和 pH
对同一种缓冲液,EOF随浓度增加而降低。
因浓度增加，双电层厚度变薄,Zeta电势下降，
EOF减小。
对石英毛细管,pH增加,Si-OH易电离，负电荷密度增大,Zeta电势增高,EOF增大。
（ 3） 毛细管材料
（ 4）缓冲液添加剂中性盐,增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，
EOF降低。缺点是热效应大，电流升高。
两性离子,如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-CH2-COO-。
可增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离,EOF
降低。但不增加电流。
表面活性剂,如烷基季铵盐有机溶剂,影响机理复杂
（ 5） 柱温,
T升高,CE buffer 粘度降低,EOF增大。
3．柱效和分离度
CE的柱效用理论塔板数（ the number of theoretical
plates,N）表示，其表达式来源于色谱理论：
N = （ μe + μeo） (10)
式中 μe 为电泳淌度,μeo为电渗淌度,V为操作电压，
l为毛细管有效长度,D为溶质的扩散系数,L为毛细管总长度。
DL
Vl
2
实际理论塔板数 可以直接从电泳图谱中求得：
N =5.54 (tm / W1/2) 2 (11)
式中 tm 为迁移时间,W1/2为半峰宽。由式
（ 11）求得的柱效总是小于由式（ 10）计算的理论值。
影响 CE柱效的因素,
CE buffer 和溶质本身,主要是自热、扩散和吸附 ;
1) 自热在毛细管内产生径向温度梯度,进而产生径向粘度梯度,使带电粒子的迁移速度产生径向不均匀分布,EOF的平面流型被破坏,导致区带展宽,
2) 扩散,主要是溶质的纵向扩散
3) 吸附,静电吸附和疏水作用引起的吸附
系统本身,如进样和检测,
CE中两相邻组分的分离度可用下列公式表示：
Rs = (12)
式中 为两组分电泳淌度之差,为两组分平均电泳淌度。可见，分离度不仅取决于两组分的电泳淌度，也与电渗流有关。
2/1
)(24
1
eoe
e
DL
Vl
e
e?
分离度也可用 实验方法 测定：
Rs = (3)
式中 tm为迁移时间,W为峰底宽度，
脚标 1,2分别代表两个组分。
2/)( 21
12
WW
tt mm
4．分离模式根据分离介质、分离机理不同,CE有多种分离模式。
毛细管区带电泳 （ capillary zone electrophoresis,
CZE）,又称自由溶液毛细管电泳，是 CE中最简单、
最基本、应用最广泛的一种分离模式，分离介质为缓冲液，基于带电溶质电泳淌度的不同进行分离。
溶质组分间的分离只受组分本身结构特点和缓冲液组成的影响，能分离电泳淌度差别很小的组分。 由于存在 EOF，阴、阳离子可同时被分析，中性溶质与
EOF同时流出 。为了降低 EOF和吸附现象，可对毛细管内壁改性。
胶束电动毛细管色谱 （ micellar electrokinetic
capillary chromatography,MECC）,CE借用胶束色谱 准固定相 分离技术的一种分离模式。 在缓冲液分离介质中加入离子型表面活性剂，形成的胶束为准固定相，电中性溶质以不同的分配系数在水相和准固定相之间进行分配并随电渗流在毛细管内迁移而达到分离。 它是 CE中唯一能同时分离中性溶质和离子型溶质的分离模式。 电动毛细管色谱的其它模式还有环糊精电动色谱、离子交换电动色谱和微乳胶电动色谱，它们分别用环糊精衍生物、高聚物离子和微乳胶代替 MECC中的胶束作为准固定相。
毛细管凝胶电泳 （ capillary gel electrophoresis,
CGE ）,在毛细管中装入单体，引发聚合形成凝胶分离介质，主要用于分析蛋白质,DNA等生物大分子化合物。由于毛细管凝胶柱制备困难，且使用寿命较短，进样端易堵，因此有人在 CE缓冲液中加入具有筛分作用的低粘度水溶性高分子聚合物，代替凝胶进行分析，
这种模式称为毛细管非胶筛分电泳。有时将这两种模式总称为毛细管筛分电泳。
毛细管等电聚焦 （ capillary isoelectric
focusing,CIEF）,分别采用酸性和碱性溶液作为两个电极槽溶液，毛细管内充满两性电解质混合溶液，加高电压后，在毛细管柱内产生 pH梯度，当溶质到达与其等电点相应的 pH位置时，由于电荷为零而停止迁移即聚焦形成区带，再在毛细管一端施加压力或改变检测器末端电极槽储液的 pH，
使溶质区带通过检测器。
毛细管等速电泳（ capillary isotachophoresis,
CITP）,使用两个电解质缓冲系统（即前导电解质和尾随电解质），样品夹在前导和尾随电解质之间，所有样品组分区带以相同速度移动，
不同组分按电泳淌度大小被分离。
常采用恒电流操作模式。在分离过程中，场强会自动调整以维持区带的等速移动。
毛细管电色谱 (capillary
electrochromatography,CEC)
包含电泳和色谱两种机制,
溶质组分根据它们在流动相和固定相中的分配系数不同和自身电泳淌度的差异进行分离,
CEC的介质选择首先是选择合适的固定相,其次才是流动相或缓冲溶液的选择,
根据固定相的极性,CEC包括正相和反相 CEC.
根据固定相的存在方式,CEC包括开管 CEC,
填充 CEC 和整体 CEC
非水毛细管电泳 (non-aqueous capillary
electrophoresis,NACE)
是在以有机溶剂为主体的非水缓冲体系中进行的 CE。
非水体系可承受更高的操作电压,提高分离效率；使在水性体系中难溶而不能用 CE分离的样品得到 CE分离。
但增加了 CE的可优化参数 (如分离介质的极性、介电常数等 )。
常用有机溶剂：甲醇，乙腈，四氢呋喃，甲酰胺等。
有机溶剂中常加入的电解质：酸及其铵盐。用于调节分离介质的 pH和分离选择性，使分离介质具有导电性。
三．仪器系统
CE仪器主要包括进样、（高压电场作用下的）分离、检测及数据处理系统，如图 1-4。
Figure 1-4 Schematic of the CE instrumentation,HV,high voltage; C,capillary;
E,electrode vial containing buffer; Pt,platinum electrode; D,detector; S,
sample; DA,data processing apparatus,
进样方式
常用 CE进样方式为电动进样和流体动力学进样（又称压力进样）。
压力进样比电动进样的重现性好。
样品区带长度应小于毛细管总长度的 1%。进样量太大，会使峰变宽甚至使峰形畸变。
电动进样,是在短时间内施加低电压，
通过电迁移作用将样品引入毛细管，其实际进样量与电渗流和被分析组分的电泳淌度有关。
进样方式
流体动力学进样,具体包括 3种进样方式：
（ 1）在毛细管进样端加压；
（ 2）在毛细管出口端抽真空；
（ 3）调节进样端样品池和出口端缓冲液电极槽的相对高度，通过虹吸作用进样。
高压电源
CE一般采用 0～ ± 30kV连续可调的直流高压电源。
电源输出电压的稳定性直接影响 CE分离的重现性，
因此通常要求电压输出精度高于 1%。
高压电源具有恒电压、恒电流或恒功率等方式，
但以恒压最常用。
毛细管
毛细管是 CE分离的核心部件，目前所用毛细管材料有熔融石英、聚四氟乙烯（ teflon）和玻璃，
其中熔融石英最常用。
石英毛细管外壁涂覆聚酰亚胺保护层，以增强弹性、便于操作。
实验前，需除去一小段保护层，形成一个柱上光学检测窗口。常用毛细管内径为 25～ 100μm。
毛细管的清洗。
检测器
信号检测是 CE分析的一个重要因素,CE中的检测器包括：
紫外吸收光谱 (UV)
激光诱导荧光 (LIF)
电化学（ ECD,包括电导、电位和安培法）
质谱（ MS）
折射指数、激光光热、放射、免疫、单细胞生物传感器等检测器。
四,CE分离的优化
（一） CE的外加电压
Voltage升高，迁移时间减小，柱效升高，分离度增加。但由于焦耳热的影响，当 V太高时,N,Rs
反而减小。
tm= N = （ μe + μeo）
Rs =
V
lL
e? DL
Vl
2
2/1
)(24
1
eoe
e DL
Vl
最佳电压的实验选择
毛细管内径和长度一定时，采用某浓度的 CE缓冲液进行实验，据欧姆定律 V=IR,作 I-V曲线来确定最佳电压。
当 CE系统不能有效的散热时,I-V曲线偏离直线
（ R下降,I增加）。曲线的拐点所对应的电压即为最佳电压。
（二） CE的缓冲溶液
１,CE中使用的缓冲溶液应该具有的特点：
在所选的 pH范围内有较强的缓冲能力；
在检测波长处有低的紫外吸收或荧光强度；
低的电泳淌度（即分子量大，电荷小的离子），
以降低所产生的电流。
２．缓冲溶液的 pH效应
1） pH对 EOF的影响
pH 4-6范围,EOF对 pH表现出很强的依赖性，因 Si-OH的电离对 pH非常敏感；
高 pH下（大于 12）,EOF达到最大且变化平缓；低 pH下（小于 2）,EOF接近于０；
２．缓冲溶液的 pH效应
2） pH对样品组分电泳分离的影响离子的电泳淌度直接正比于它的有效电荷，
而离子的有效电荷受缓冲溶液 pH的影响较大，
因此缓冲溶液 pH的调节与控制是优化 CE分离的重要对策。
３．缓冲溶液浓度
１）缓冲溶液浓度对电泳淌度和迁移时间的影响许多实验证实：在恒定 pH条件下，缓冲溶液浓度增加，溶质的电泳淌度降低，迁移时间延长。
２）缓冲溶液浓度对柱效和分离度的影响对柱效的影响很复杂，可根据实验结果确定最佳值。
根据 Rs公式，浓度增加,EOF减小,Rs增加。
（三）缓冲液添加剂
１．添加剂种类
表面活性剂：季铵盐等
有机溶剂：甲醇，乙腈等
两性离子：如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-CH2-
COO-
中性盐,K2SO4,LiCl等
手性试剂：环糊精，冠醚等
其它：如硼砂作为络合剂与糖类和多羟基化合物络合，形成带电荷的络合物，从而使中性物质可用 CZE分离。
２．添加剂的作用
１）控制 EOF大小和方向，增加分离选择性，减少分析时间。 如季铵盐,
季铵盐的浓度和烷烃链长对 EOF影响很大。
浓度增加（ 小于 CMC）,EOF减小，直至反向。
烷烃链增长,EOF受浓度变化的影响加大，长链季铵盐如十四烷基三甲基溴化铵（ TTAB）及十六烷基三甲基溴化铵（ CTAB）在很低浓度下就能使 EOF反向。
反向机理：
烷基季铵离子与带负电荷的毛细管壁因静电引力 形成一单分子层，其烃基端面向缓冲液，和溶液中其他烷基季铵离子的烃基端在范德华引力（疏水作用）的作用下形成第二分子层，第二分子层带正电，因此 EOF反向。
２）抑制管壁吸附作用，提高分离效率和重现性 。
如中性盐、两性离子添加剂和 短链季铵盐
缓冲液中加入高浓度的中性盐，大量的阳离子可与毛细管壁的负电荷结合，因而降低了管壁对样品组分的吸附；同时中性盐增加缓冲液离子强度，
抑制硅醇基电离，也可降低吸附。
两性离子添加剂：如三甲铵基甲内盐 (CH3)3-N+-
CH2-COO-。可增加缓冲液离子强度，抑制硅醇基电离，降低吸附。
短链季铵盐：
３）增加溶质的溶解度,如有机溶剂添加剂
４）扩大分离对象，如添加手性试剂进行手性溶质的分离；
５）增加分离介质粘度，降低电流，优化分离条件。如添加有机溶剂。
（四）控制电渗流、消除样品吸附的柱技术
1,动态修饰毛细管壁
1) 改变缓冲液 pH值和离子强度抑制硅醇基离解
采用低 pH（ <２）缓冲液，可抑制硅醇基离解；
高离子强度的缓冲液，也可抑制硅醇基离解。
2) 在缓冲液中加入添加剂使其在毛细管内壁形成一个动态涂层
常用添加剂
A,烷基季铵盐：
TTAB,CTAB等长链烷基季铵盐，可 使
EOF反向。
短链烷基季铵盐可降低电渗流，一般不反向。
B,胺类聚合物：
如聚胺、聚乙烯亚胺等。毛细管内壁吸附聚合物而带正电，也可使电渗流反向。原理与 A相似，也是通过静电引力 ---疏水作用形成双分子层而带正电。
C,亲水性中性聚合物：
如烷基纤维素，聚乙烯醇等，他们与毛细管内壁以氢键作用形成动态涂层，可屏蔽管壁电荷，降低 EOF，但不能改变 EOF方向。
2．毛细管内壁永久涂层
动态修饰的缺点：
改性剂可能干扰分离过程；动态涂层不稳定,EOF波动大，重现性差。
永久涂层具有高稳定性，可提高分析结果的重现性。
1) 物理吸附涂层
通过与管壁的静电或氢键或疏水作用而形成。
纤维素类中性聚合物、胺类聚合物等都能形成吸附涂层。
制备简单，寿命短 。
2）化学键合涂层
通过化学键将涂层键合到毛细管内壁上。制备复杂，但寿命长。
毛细管的化学键合涂层技术可分为三步：毛细管预处理，硅烷化引入活性基团，接上目标涂层试剂，如环糊精，杯芳烃等。
五,CE在生物医药学领域的应用
药品质量控制（杂质检查、含量测定、稳定性评价等）
生物样品中药物及代谢物分析
药物与蛋白质的相互作用
手性药物及结构相似药物的分离分析
蛋白质、多肽、氨基酸和糖类分析
临床疾病诊断分析
核酸及其序列分析
基因突变检测
药物动力学研究
单细胞分析
单分子分析等
1,R,Mandriol,V,Pucci,D,Visini et al,J Pharm,Biomed,Anal.,29,1127,
2002.
2,M,Jaworska,Z,Szulińska,M,Wilk,J,Chromatogr,A,993,165,2003.
3,H.J.C,Eriksson,M,Wijngaard,W.L.J,Hinrichs et al,J,Pharm,Biomed,
Anal.,31,351,2003.
4,A.B,Anderson,C.M,Ciriacks,K.M,Fuller,E.A,Arriaga,Anal,Chem.,
75,8,2003.
5,A.B,Anderson,J,Gergen,E.A,Arriaga,J,Chromatogr,B,769,97,
2002.
6,Z,Shen,Z,Sun,L,Wu,K,Wu,S,Sun,Z,Huang,J,Chromatogr,A,
979,227,2002.
7,C,Horstk?tter,E,Jiménez-Lozano,D,Barrón et al,Electrophoresis,23,
3078,2002.
8,C.M,Boone,J.W,Douma,J.P,Franke,Forensic Sci,International,
121,89,2001.
9,W,Jin,D,Yu,Q,Dong,X,Ye,Electrophoresis,21,925,2000.
10,G,Hempel,P,Schulze-Westhoff,S,Flege et al,J,Chromatogr,B,758,
221,2001.
11,N,Griese,G,Blaschke,J,Boos,G,Hempel,J,Chromatogr,A,979,
379,2002.
12,G,Hempel,S,Flege,G,Wurthwein,J,Boos,Cancer Chemother,
Pharmacol.,49,133,2002.
13,P.R,Tomás,M.L,Carmen,S,Antonio,B,Eva,Electrophoresis,22,
134,2001.
14,A,Gavenda,J,?ev?ík,J,Psotová et al,Electrophoresis,22,2782,
2001.
15,Q,Hu,T,Zhou,L,Zhang,H,Li,Y,Fang,Fresenius J,Anal,Chem.,
368,844,2000.
16,Q,Hu,L Zhang,T,Zhou,Y,Fang,Anal,Chim,Acta,416,15,2000.
17,J,?stergaard,C,Schou,C,Larsen,N.H.H,Heegaard,Electrophoresis,
23,2842,2002.
18,H.S,Kim,J,Austin,D.S,Hage,Electrophoresis,23,956,2002.
19,J,?stergaard,C,Schou,C,Larsen,N.H.H,Heegaard,Anal,Chem.,
75,207,2003.
20,Y,Ishihama,T,Miwa,N,Asakawa,Electrophoresis,23,951,2002.
21,G,Manetto,M.S,Bellini,Z,Deyl,J,Chromatogr,A,990,281,2003.
22,K.D,Altria,J,Pharm,Biomed,Anal.,31,447,2003.
23,Y.F,Pai,C.Y,Liu,J,Chromatogr,A,982,293,2002.
24,B,Awadallah,P.C,Schmidt,M.A,Wahl,J,Chromatogr,A,988,135,
2003.
25,M,Blanco,I,Valverde,J,Pharm,Biomed,Anal.,31,431,2003.
26,S.H,Kang,X,Gong,E.S,Yeung,Anal,Chem.,72,3014,2000.
27,H,Li,G,Xue,E.S,Yeung,Anal,Chem.,73,1537,2001.
28,Q,Gao,E.S,Yeung,Anal,Chem.,72,2499,2000.
