2.11 酶的作用机制 P384 10章 酶的活性部位 (1)酶活性部位:酶的特殊催化能力只局限在大分子的一定区域,活性部位又称活性中心。 酶分子中与酶活力直接相关的区域称为活性中心,分为: 结合部位:负责与底物结合,决定酶的专一性。 催化部位:负责催化底物键的断裂或形成,决定酶的催化能力。 对需要辅酶的酶,辅酶分子或辅酶分子某一部分结构往往是酶活性部位组成部分。 (2)酶活性部位特点: 1. 活性部位只占酶分子中相当小的部分,通常1~2%。P384 表10-1列举一些酶活性部位的氨基酸残基。如溶菌酶一共129个氨基酸残基,活性部位为Asp52和Glu35;胰凝乳蛋白酶241个残基,活性部位为His57,Asp102,Ser 195。 2. 活性部位为三维实体。活性部位氨基酸残基在一级结构上可能相距甚远,甚至不在一条肽链上,但在空间结构上相互靠近。因此空间结构破坏酶即失活。活性中心以外部分可为酶活性中心提供三维结构。 3. 酶与底物的结构互补是指在酶和底物结合过程中,相互构象发生一定变化后才互补。如P385 图10-1。 4. 活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内。裂缝中为一个疏水微环境,也含有某些极性氨基酸残基有利于催化,底物在此裂缝内有效浓度很高。 5. 酶与底物结合形成ES复合物主要靠次级键:氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用。 6. 酶活性部位具有柔性和可运动性。 研究酶活性部位的方法 酶侧链基团化学修饰法: 特异性共价修饰:如二异丙基磷酰氟(DFP)专一地与酶活性部位Ser-OH的羟基共价结合,使酶失活。如胰凝乳蛋白酶共28个Ser,但DFP只与活性中心的Ser反应,见P386。反应后,用HCl将酶部分水解,得含二异丙基磷酸酯(DIP)基团的肽的片断,序列分析定出DIP-Ser为Ser195。 亲和标记:用与底物结构相似的修饰剂,对酶活性部位进行专一性共价修饰。 如TPCK(结构式见P387),结构与胰凝乳蛋白酶的底物对甲苯磺酰-L-苯丙氨酸乙酯(TPE)类似,TPCK只与胰凝乳蛋白酶中His57结合,说明His57为该酶活性部位的一个氨基酸残基。 (2) X-射线晶体结构分析: 可提供酶分子三维结构,了解酶活性部位氨基酸残基所处相对位置与状态,与底物结合后酶分子在底物周围氨基酸残基排列状况,被作用键周围残基状况等。由此提出活性中心处氨基酸残基组成及催化作用形式。 如溶菌酶:对它水解的糖苷键周围氨基酸残基分析后确定酶的催化基团为Glu35和Asp52。 又如胰凝乳蛋白酶经X-射线晶体结构分析,表明活性部位由Ser195、His57和Asp102组成,并提出这三个氨基酸残基联在一起形成一个“电荷中继网”,如P409 图10-40所示: ① 没有底物时,His57未质子化,三联体排列为A;② 在加上底物后,Ser195转移一个质子给His57,带正电荷的咪唑环通过带负电荷的Asp102静电相互作用被稳定,成为B。详细酶作用机制见P410 图10-42。 影响酶催化效率的有关因素: 底物和酶的邻近效应与定向效应。 酶催化反应高效率一重要原因是将分子间反应变为分子内反应。 邻近效应:底物与酶先形成中间体络合物,两分子成一个分子,分子内反应速度比分子间反应速度提高。P388 图10-2 所示:用咪唑催化乙酸对硝基苯酯水解来证实:咪唑可催化乙酸对硝基苯酯的酯键水解成乙酸和对硝基苯酚;若将咪唑分子先共价连接在底物上,在分子内催化酯键水解,可增速24倍。 定向效应:底物反应基团和酶催化基团正确取位会大大加速反应。P389 表10-3 用二羧酸单苯酯水解相对速度和结构关系实验表明:分子内催化反应,当催化基团羧基与酯键愈邻近并有一定取向,反应速度愈大。每移去一个旋转自由度,反应速度约增加200倍。 又如P389所示制备邻羟苯丙酸内酯的分子内酯化反应表明:当在分子中引入甲基使羧基和酚羟基定位,反应速率可提高2.5×1011倍。 底物的形变和诱导契合: 酶使底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度增高或降低,产生“电子张力”,底物扭曲而接近过渡态,使反应加速。 如具有五元环构象的乙烯环磷酸酯(P390),由于构象更接近磷酸酯水解时的过渡态,P-O键有电子张力,因此水解速度是磷酸二甲酯的108倍。 溶菌酶作用细菌细胞壁,水解由N-乙酰基葡萄糖胺等构成的糖苷键。溶菌酶与底物结合时会引起糖环构象由椅式变成半椅式,可加速水解。 酸碱催化: 酶为广义酸碱催化。咪唑基既是一个强亲核基团,又是一个有效的广义酸碱催化功能基团,因此蛋白质中His含量虽少,但却占有重要的地位。此外酶蛋白中还有氨基、羧基、巯基、羟基等,都具有广义酸碱催化功能。 共价催化: 有亲核催化或亲电催化。酶在催化过程中形成中间物,P392 表10-5列出形成共价中间物的一些酶。 酶分子中氨基酸侧链上有许多亲核基团如羟基、巯基、咪唑基等,可进攻底物的酰基、磷酰基和糖基等。 金属离子催化: 几乎三分之一的酶催化需要金属离子,金属离子可以与酶紧密结合,也可以是松散结合。 金属作用与H+相似,但由于带正电荷更多而作用更强,且容易维持一定浓度。② 金属离子可通过电荷屏蔽作用而促进反应。如Mg++屏蔽ATP中磷酸基负电荷,消除负电荷排斥作用而加速激酶的反应,此时激酶真正作用底物是Mg2+-ATP,而不是ATP,见P394。③ 金属离子通过水的离子化,使水分子更具酸性,促进亲核催化。④ 许多氧化还原酶都含有金属的辅基。 多元催化和协同效应: 酶催化反应时常常是几个功能团适当排列共同作用。如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网”,催化肽键水解;核糖核酸酶催化水解时,His12起广义碱催化作用,接受一个质子,而His119起广义酸作用,和磷酸的氧原子形成氢键。 亚胺内酯水解:在咪唑缓冲液中得酰胺,而在磷酸缓冲液中,尽管pH相同产物却为胺和酯,其区别即为磷酸盐双功能催化。 微环境影响: 酶促反应在酶表面的疏水裂缝(活性中心)中进行,如同反应在有机溶剂中进行,反应基团不为溶剂化,亲核亲电反应均可加速。如溶菌酶Glu35的羧基在非极性区,催化功能增速3×106倍。模拟酶由此设计胶束模拟酶和环糊精等。 酶催化反应机制实例: 溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)是第一个用X-衍射阐明结构和功能的酶。生物功能为催化某些细菌细胞壁多糖的水解,结构如P395图 10-9所示。 细胞壁是由NAG(N-乙酰氨基葡萄糖)和NAM(N-乙酰氨基葡萄糖乳酸)通过β(1→4)糖蔗键交替排列而成的多糖。溶菌酶底物为NAG-NAM交替的六糖,可表示为ABCDEF。 在酶活性部位凹穴中,底物受酶影响D-环发生变形,糖环构象从椅式变成能量较高的半椅式或船式,接近过渡态构象。 酶活性基团处于非极性区的Glu35的羧基不解离,提供一个H+到D环与E环间的糖苷键上氧原子上,D环上的C1与氧原子间的糖苷键断开,形成正碳离子(SP2)过渡态中间物,并为处于极性区的活性基团Asp52上的羧基负离子所稳定。六糖中的E及F两糖残基成HO-EF离开,如P398图 10-16所示。 正碳离子中间产物进一步与来自溶剂中的-OH反应,解除SP2张力,ABCD四糖残基离开酶分子,Glu35同时质子化恢复原状。如P399图 10-17所示。 至次一次反应完成,细胞壁打开一个缺口。