1.6 肽：P162 肽为氨基酸的线性聚合物，蛋白质是由一条或多条多肽链构成。 肽和肽键结构 肽的命名从N端开始到COOH端，氨基酸残基按顺序从左向右写，-NH2末端在左，-COOH端在右。如Ser-Gly-Phe，称为：丝氨酰甘氨酰苯丙氨酸。 一般氨基酸数目<12~20的肽为寡肽（小肽）；>20的肽为多肽。 肽的物理化学性质 与氨基酸同，为离子晶格，熔点高，在水溶液中以偶极离子存在。多肽中酰胺的氢不易解离，肽的酸碱性质主要取决于游离末端的α-氨基和α-羧基，以及侧链R基上的可解离基团，如Glu的γ-COOH、Lys的ε-NH2。 滴定曲线：也有等电点，为多价离子等电点。以Gly-Glu-Lys-Ala四肽为例 (P166表4-6)： 当pH <3.5，末端可解离基团全部质子化，2个+NH3、2个COOH，净电荷 +2； pH 3.5-4.5，C-末端COOH解离（pKa=3.7），为2个+NH3、一个COOH、一个COO-，净电荷+1； pH 4.5~7.5，Glu的γ-COOH解离，2个+NH3、2个COO-(pKa=4.6)，为等电点，净电荷为0； pH7.8~10.2，N末端-+NH3解离（pKa=7.8），一个+NH3、 一个NH2 、2个COO-、净电荷-1； pH>10.2，ε-+NH3解离，2个NH2、2个COO-，净电荷-2。 pH在等电点以上（碱性），多肽带负电荷。 pH在等电点以下（酸性），多肽带正电荷。 蛋白质滴定曲线更加复杂。 化学反应 ① 与茚三酮在弱酸性溶液中共热显紫色，为α-NH2反应（注意：伯胺也可使茚三酮显紫色），氨基酸、多肽均有此反应。Pro为仲胺（亚氨基氨基酸），与茚三酮生成黄色物质。 茚三酮反应可用于定性、定量测定氨基酸和多肽。 ② 肽键的双缩脲反应：多肽，蛋白质中有肽键，有此反应，氨基酸没有此反应。双缩脲：H2N-CO-NH-CO-NH2 ，P163。 双缩脲反应：含有两个或两个以上肽键的化合物（如双缩脲或二肽以上等多肽）在碱性溶液中能与CuSO4生成紫红色或紫蓝色复合物，可定性或定量测定蛋白质含量，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 活性多肽： 动植物体内存在许多具有生理活性的多肽，多肽药物已获得人们的重视。 二肽：肌肽 β-Ala-His，抗氧化，抗自由基，消炎，调节免疫。 甜二肽 Aspartame Asp-Phe-OCH3，比蔗糖甜200倍。 三肽：谷胱甘肽 γ-Glu-Cys-Gly，维持红细胞及其蛋白质中Cys的-SH处于还原态。 四肽：促胃酸激素。 五肽：脑啡肽，内源性吗啡，与吗啡受体结合。 蛋氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheMet。 亮氨酸脑啡肽 TyrGlyGlyPheLeu。 八肽：α-鹅膏蕈碱，见P168 图4-6，剧毒毒素。 九肽：牛催产素，牛加压素（升高血压），见P167，两者只差两个氨基酸，但生理作用极不相同。 十肽：短杆菌肽，见P532，为抗生素。 促黄体生成激素释放因子，见P551，为激素。 十六肽：内啡肽，有镇痛作用。 二十四肽：促皮质素（ACTH），治关节炎，已商品化。 二十六肽：蜂素溶血肽，抗关节炎。 五十一肽：胰岛素，降血糖。 以活性多肽研究为基础的药物研究： 血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂（ACEI）的开发是近代高血压治疗史上 的重大进展。 人体内存在的血管紧张素Ⅰ（AngⅠ）为十肽，无活性，但在ACE作用下 转化为血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）为八肽，具有收缩血管平滑肌作用，使血压升高。 ACE DRVYIHPFHL(AngⅠ) DRVYIHPF(AngⅡ)。 ACEI可使ACE失活，使AngⅠ不能形成AngⅡ，从而降血压，研究Ang Ⅰ活性部位，作用机理，进而设计并合成ACEI，已开发出二十多种降压药物， 如巯甲丙脯酸（Captopril）、依那普利（Enalapril）、赖诺普利（Lisonopril）等。 1.7 蛋白质一级结构测定 ：P168 测定蛋白质中共价键连接的全部情况，包括存在的链内、链间的二硫键位置，氨基酸数目、类型和顺序。 蛋白质氨基酸顺序决定其三维结构，而三维结构决定其生物活性和功能。蛋白质中氨基酸顺序是由基因决定的，是联系DNA遗传信息和蛋白质生物功能的桥梁。 蛋白质中氨基酸顺序揭示其进化史，具有同一祖先的蛋白质才有相似的氨基酸顺序。如细胞色素C（P182），是一种含血红素的电子转运蛋白，存在于所有真核生物的线粒体中。40多种物种的细胞色素C序列的研究揭示，在细胞色素C中含有的一百多个氨基酸残基，其中有28个位置上的氨基酸残基是相同的（P182 图4-16），这些不变残基对于细胞色素C的生物学功能至关重要，由此可根据细胞色素C序列的物种差异建立进化树（P183 图4-17）。来自任两个物种的细胞色素C间序列的氨基酸差异数目越多则进化位置相差越远。 蛋白质测序 样品纯度应>97%，测分子量（允许误差10%）。 蛋白质分子中多肽链的数目：测N-末端和C-末端残基的摩尔数。寡聚蛋白要用变性剂将亚基拆开。 每一多肽链氨基酸组成：鉴定N-末端残基和C-末端残基，定出氨基酸序列参考点。 按专一方式断裂成较小的肽片段：可用酶或化学方法完成，并用多种断裂方法，将每条多肽链样品降解成几套有重叠序列片段的肽段。 侧各肽段氨基酸序列：常用Edman降解法，用自动序列分析仪。 测定片段次序：用重叠肽段确认拼凑出原来完整多肽链的氨基酸序列。 确定二硫键位置。 （二）N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定 （1）N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法：Sanger反应。 2、4-二硝基氟苯称为Sanger试剂，与游离末端氨基反应生成DNP-多肽或DNP-蛋白质，再酸性水解生成DNP-氨基酸（黄色），提取分离后可进行鉴定和定量测定。 此方法在蛋白质氨基酸序列分析的历史上起过很大作用。 丹磺酰氯（DNS）法：有荧光，灵敏度高。5-二甲氨基-萘-1-磺酰氯（DNS），结构式见170。 Eman降解 苯异硫氰酸酯 (PITC) 法：Phenylisothiocyanate(PITC)能顺序从肽的N-端将氨基酸残基一个个切下来，还可用来测定氨基酸序列。 PITC与多肽链每反应一次，得到一个PTH-氨基酸和少一个氨基酸残基的肽。 PTH (phenylthiohydantoin)： 苯乙内酰硫脲。PTH-氨基酸可用TLC或HPLC快速测定，由此发展出氨基酸序列自动分析仪。 氨肽酶法： 用外切酶，从N-末端逐个向里切。最常用的是亮氨酸肽酶，适用于N-末端残基的氨基酸被封闭的肽（如环肽）；N-末端是焦谷氨酸残基时，可使用焦谷氨酸氨肽酶。 （2）C-末端分析 ① 肼解法：蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解反应，除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其余氨基酸都变成相应的氨基酸酰肼化物。肼进攻肽键而不易与-COOH反应，肼解中Gln、Asn、Cys被破坏。 ② 还原法：用LiBH4还原C-末端氨基酸成氨基醇，肽水解后可分离、鉴定。 ③ 羧肽酶法：专一地从肽链C-末端开始逐个降解释放出游离氨基酸，P171图4-7。 （三）二硫键断裂： 用变性剂，如8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍使蛋白质变性，分子内部-S-S-露出，并用HSCH2CH2OH处理，则-S-S-变成2个-SH，再用碘乙醇保护-SH不被氧化，P172 图 4-8。 也可用过甲酸氧化，将-S-S-变成2个磺酸基。 氨基酸组成分析： 可用氨基酸分析仪进行测定。样品可用酸完全水解（6mol/L HCl），再用碱水解测Trp。 测出Asx和Glx，酰胺基总量由水解液中NH4Cl量计算出。 P172 表4-8列出一些蛋白质的氨基酸组成。 多肽链部分裂解成小肽段，分别测序： 现在一般只能测几十个氨基酸残基肽段，需将蛋白质先裂解成较小肽段，分离后测序。 酶裂解法：常用的蛋白酶有以下几种（为内切酶）： 胰蛋白酶：水解碱性氨基酸的羧基所形成的肽键，如Lys，Arg。 糜蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）：肽键羧基端为芳香族氨基酸，如Phe、Trp、或Tyr，以及疏水氨基酸Leu、Met或His。 胃蛋白酶：特异性不太强，切点多，肽键羧基端为芳香族和疏水氨基酸。 化学裂解法：溴化氰BrCN断裂羧基端为Met的肽键，反应见P175 图4-10，生成肽酰高丝氨酸。 肽段氨基酸序列测定 Edman化学降解法： 每反应一次生成一个PTH-AA，层析分离、鉴定，剩下减少一个残基的肽链，又有新N-端参加下一轮反应。由此进行氨基酸序列自动分析，进行几轮反应就能测出几个残基序列。最低样品用量仅5 pmol。 Edman降解现已有多种改进。如DNS-Edman测序，可提高灵敏度；试剂的改进，用由荧光基团或有色基团标记的PITC可更灵敏。 质谱法：电喷射电离（ESI），见P178 图4-11。使蛋白质离子解吸进入气相，15肽以下均可用。 肽段在多肽链中次序确定 用两种或两种以上不同方法断裂多肽样品成两套或几套肽段，由于切口错位，可由重迭肽（两套肽段相互跨过切口而重迭的肽段）确定肽段先后次序，从而拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。P179 图4-12。 二硫桥位置的确定 用切点多的胃蛋白酶水解肽链，生成比较小的含二硫桥的肽段混合物，将样品点在滤纸中央，在pH6.5进行第一向电泳分离。然后用过甲酸蒸气熏，-S-S-氧化断裂成两个含磺酰丙氨酸（带负电荷）的肽。将滤纸转900，在完全相同条件下再进行第二向电泳，大多数肽段迁移率未变，位于滤纸对角线上，而含磺酰丙氨酸的肽段由于负电荷增加偏离对角线（向正极向），见P178 图4-13。将每对含磺酰丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推出二硫桥的位置（肽链内或肽链间）。 现在越来越多的蛋白质氨基酸序列是由核酸的核苷酸顺序推定的，但仍需氨基酸序列分析配合。