§2.8 酶促反应动力学 （9章 P351） 底物浓度对酶反应速率的影响 用反应初速度v对底物浓度[S]作图得P355 图9-6。 曲线分以下几段： OA段：反应底物浓度较低时v与[S]成正比，表现为一级反应， v = k[S]。 根据酶底物中间络合物学说，酶催化反应时，首先和底物结合生成中间复合物ES，然后再生成产物P，并释放出E。 E + S = ES → P + E OA段上，底物浓度小，酶未被底物饱和，有剩余酶，反应速率取决于ES浓度，与[S]呈线性关系，v正比于[S]。 AB段：反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应。此时酶渐渐为底物饱和，[ES]慢慢增加，v也慢慢增加，为分数级反应。 BC段：反应速度趋于Vmax，为零级反应，酶促反应表现出饱和现象。此时底物过量[S]>[E], [E]已全部转为[ES]而恒定，因此反应速率也恒定，为最大反应速率，Vmax为[E]所决定。 非催化反应无此饱和现象。 酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。 酶促反应力学方程式 米氏方程推导 1913年Michaelis和Menten提出并推导出表示[S]与v之间定量关系的米氏方程 Vmax[S] V = Km + [S] Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率Vmax一半时底物的浓度，单位与底物浓度同。 推导：酶促反应分两步进行。 k1 k3 E + S ES → P + E k2 v = k3 [ES] 一般k3为限速步骤 v = k3 [ES] … ① [ES] 生成速率： d[ES]/dt = k1([E] - [ES]) [S] [ES]分解速率： -d[ES] / dt = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3) [ES] 稳态下[ES]不变，ES生成速率和分解速率相等： k1 ([E]- [ES]) [S] = (k2+k3) [ES] 引入Km： 令Km = k2+k3 / k1 代入Km = ([E]- [ES]) [S] / [ES] , Km [ES] = [E] [S]- [S] [ES], [ES] (Km + S) = [E] [S], [ES] = [E] [S] / Km+[S], 代入①式：v = k3 [ES] = k3 [E] [S] / Km + [S] … ② 引入Vmax：为所有酶都被底物饱和时的反应速率，即此时[E]= [ES] Vmax = k3 [ES] = k3 [E] 代入②式：v = Vmax [S] / Km + [S] 米氏方程表示Km及Vmax已知时，v~[S]的定量关系。 米氏常数的意义 Km是酶的一个特性常数，Km大小只与酶性质有关，而与酶浓度无关。当底物确定，反应温度，pH及离子强度一定时，Km值为常数，可用来鉴别酶。P359 表9-1 列出一些酶的Km值。一般Km在1×10-6~10-1mol/L之间。 不同的酶Km值不同，测定Km要在相同测定条件（pH、温度、离子强度）下进行。 Km值可用于判断酶的专一性和天然产物，若一个酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物称为该酶的最适底物，又称天然底物。 1 / Km可近似表示酶与底物亲和力的大小。 真正表示酶与底物亲和力为Ks=k2 / k1 ,(注 Km= k2+k3 / k1)。 已知Km可由[S]计算v，或由v计算[S]。 Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径。 Km小的为主要催化方向（正、逆两方向反应Km不同）。 Vmax和k3(kcat)的意义： 酶浓度[E]一定，则对特定底物Vmax为一常数。催化常数 kcat 又称酶的转化数，数值上与k3同，为酶被底物饱和时，每秒钟每个酶分子转换底物的分子数。 大多数酶的kcat 为1~104/sec，见P322 表8-2，为每秒钟酶促反应每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数。kcat越大，酶催化效率越高。 kcat / Km的意义： 生理条件下S << Km， Vmax = kcat [E] 代入米氏方程 v = kcat [E] [S] / Km + [S] = kcat [E] [S] / Km 得出：v = kcat / Km[E][S] kcat / Km为[E]和[S]反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mol s。可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率，见P362 表9-4。 kcat / Km大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。 米氏常数求法： 双倒数法： 1 / v = Km / Vmax×1 /[S] + 1 / Vmax 以1 / v ~ 1 / [S]作图，见P363 图9-10 纵轴截距：1 / Vmax；横轴截距：-1 / Km；斜率：Km / Vmax。 （2）v ~ v / [S]法 （Eadic-Hofstee）： v = -Km×v / [S] +Vmax 以v ~ v / [S]作图，见P363 图9-11。 斜率：-Km；纵轴截距：Vmax；横轴截距：Vmax / Km。 （3）[S] / v ~ [S]法 （Hanes-Woolf）： [S] / v = Km / Vmax + 1 / Vmax×[S] 以[S] / v ~ [S]作图，见P363 图9-12 斜率：1 / Vmax；纵轴截距：Km / Vmax；横轴截距：-Km。 §2.9 酶的抑制作用 失活作用：使酶蛋白变性而引起酶活力丧失。 抑制作用：酶的必需基团的化学性质改变而引起酶活力降低或丧失，但不引起酶蛋白变性。 引起抑制作用的物质称为抑制剂。研究酶的抑制剂，可以研究酶的结构与功能、酶催化机制，进行药物、农药的设计与筛选。 抑制作用的类型： 不可逆抑制作用： 抑制剂与酶必需基团以共价键结合而引起酶活力丧失，不能用透析、超过滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，酶被化学修饰。 可逆抑制作用： 抑制剂与酶以非共价键结合而使酶活力降低或丧失，能用物理方法除去抑制剂而使酶复活。 可逆抑制又分为三种类型，如P369 图9-17所示。 竞争性抑制：抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。 抑制剂结构大多与底物类似，许多底物过渡态类似物为抑制剂。抑制剂与酶活性部位结合形成EI复合物，抑制酶与底物的结合。竞争性抑制可以通过增加底物浓度而解除，如丙二酸或戊二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制。 非竞争性抑制：底物和抑制剂同时和酶结合，两者无竞争作用。I与S结构无共同之处，酶活性降低或被抑制，不能用增加底物浓度来解除抑制，如Leu是精氨酸酶非竞争性抑制剂。 反竞争性抑制：酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。常见于多底物反应中，如肼类化合物抑制胃蛋白酶。 可逆抑制作用和不可逆抑制作用动力学鉴别 加入一定量抑制剂，以v与酶浓度[E]作图，见P370 图9-8。 加不可逆抑制剂使直线原点右移，斜率不变，加入酶使浓度大于不可逆抑制剂，才表现酶活力；加可逆抑制剂，直线原点不动，斜率变小。 可逆抑制作用动力学 竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见P371 图9-20，Vmax不变，Km变大。 纵轴截距：1 /Vmax不变，Vmax不变，底物浓度足够高，可克服抑制作用；横轴截距：1 /Km变小，Km变大；斜率：Km / Vmax变大。 非竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见P372 图9-21，Vmax变小，Km不变。 纵轴截距：1 /Vmax变大，Vmax变小；横轴截距：-1 /Km不变，Km不变；斜率：Km / Vmax变大。 反竞争性抑制：1 /v ~ 1 /[S]作图见P373 图9-22，Km，Vmax都变小。 一些重要的抑制剂： 不可逆抑制剂： 有机磷化合物：与脂酶活性部位Ser–OH共价结合，如抑制胆碱酯酶，使乙酰胆碱不能分解而积累，使一些以乙酰胆碱为传导介质的神经系统处于过于兴奋状态，引起神经中毒。 如神经毒剂和有机磷农药，结构式见P374。 可用能与磷酸根有更强结合力的化合物将酶游离出，从而解毒，如用肟类化合物解磷定，结构式见P374。 有机砷化合物：与酶中Cys-SH作用使人畜中毒。如有机砷化合物路易斯毒气（结构式见P375），可用含-SH的化合物作解毒剂，使酶恢复活性。 氰化物、CO、H2S与含铁卟啉的酶，如细胞色素氧化酶中的Fe2+络合，使酶失活，阻止呼吸。 青霉素：与糖肽转肽酶活性部位Ser-OH共价结合，使酶失活，（P375图9-24）抑制细菌细胞壁合成。青霉素与转肽酶的底物之一的酰基-D-Ala-D-Ala结构类似，见P546。 TLCK：根据底物的化学结构设计的专一性不可逆抑制剂。以胰蛋白酶底物对甲苯磺酰-L-赖氨酰甲酯（TLME）为模板，设计底物结构类似物对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）（结构见P376 图9-25），与胰蛋白酶活性部位His57共价结合，引起不可逆失活。 可逆抑制剂： 磺胺药：四氢叶酸（THF）是合成核酸和蛋白质酶的必需物质（辅酶）。根据人和细菌获THF途径不同设计磺胺类杀菌剂。叶酸（FA）结构见P377，DHF（二氢叶酸）、THF见P457 图11-30。 FA还原酶 DHF还原酶 叶酸 DHF THF （人可从食物中获取） DHF合成酶 对氨基苯甲酸（细菌靠此合成THF） 人体可直接从食物获取叶酸经DHF还原成THF而细菌只能从对氨基苯甲酸合成DHA。因此若抑制DHF合成酶，即可断绝细菌THF来源，从而抑制核酸和蛋白质的合成，而抗菌。 THF中对氨基苯甲酰胺部分的过渡态类似物对氨基苯磺酰胺可抑制DHF合成酶。 磺胺药抗菌谱广，性质稳定，对肺炎、痢疾等疗效显著。 此外抗癌药阿糖胞苷、氨甲喋呤等均为酶的竞争性抑制剂。 §2.10 温度、pH等对酶反应影响 酶反应最适温度：使酶促反应速度达最大值的温度，见P378 图9-28， 一般为钟罩形曲线。 每种酶在一定条件下都有其最适温度，动物一般35~400C，植物40~500C，微生物则差别较大，最高可达700C。 （二）最适pH：在此pH下酶促反应有最大速率。见P379 图9-29，钟罩形曲 线。 一般酶最适pH在5~8之间，动物6.5~8.0，植物及微生物4.5~6.5。 （三）激活剂：凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂，大部分是无机离子或简单有机化合物。 不同的酶可有不同激活剂。