1.10 蛋白质分离和纯化 P290 7章 蛋白质分子量测定： 根据化学组成测最低分子量： 肌红蛋白、血红蛋白均含铁0.335%，分别求它们的最低分子量： 肌红蛋白为55.8（Fe原子量）÷0.335×100=16700，与其他方法测分子量相符。 血红蛋白含铁也是0.335%，最低分子量也为16700，但用其他方法测分子量为68000，即每一个血红蛋白含有4个铁原子，由此计算更为准确分子量为：16700×4=66800。 由氨基酸含量计算： 如牛血清清蛋白含Trp0.58%，蛋白质最低分子量为35200；每一牛血清蛋白含有2个Trp，所以分子量为70400，比其他方法测出的准（69000）。 沉降系数和沉降系数单位： 蛋白质分子在溶液中受强大离心力作用时，蛋白质分子沉降，沉降速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状等有关，可用于测分子量。 沉降系数：蛋白质颗粒在单位离心场的沉降速度是个定值，称为沉降系数或沉降常数用s表示。 s常用来近似描述生物大分子的大小，蛋白质、核酸、核糖体和病毒的沉降系数介于1×10-13到200×10-13sec范围，见293 表7-4。 为方便起见，把10-13sec作为一个单位,称为svedberg（斯维得贝格）单位或沉降系数单位，用S表示，如人的Hb沉降系数为4.46S，即为4.46×10-13sec。 蛋白质胶体性质与蛋白质的沉淀： 蛋白质溶液属胶体系统，分散相质点大小1~100nm。 蛋白质可用盐析，有机溶剂沉淀，生成重金属盐、加生物碱和某些酸类（如三氯乙酸）进行沉淀；蛋白质加热变性也会沉淀。 蛋白质的分离纯化： 前处理：将蛋白质从动、植物或细菌的组织或细胞中以溶解状态释放出来，并保持天然状态，不丢失生物活性，如用适当缓冲液提取蛋白质，离心除去杂质。 粗分离：将蛋白质提取液中所需要的蛋白分出，除去其他杂蛋白、核酸和多糖等。 等电点沉淀和pH控制： 等电点沉淀：改变蛋白质溶液pH，使蛋白质净电荷为零处于等电点，相邻蛋白分子间无静电斥力，溶解度最低，蛋白保持天然构象聚集沉淀。 P305 图7-10 pH和离子强度对β-乳球蛋白溶解度的影响，等电点为pH5.2~5.3，溶解度最低。 由于不同蛋白有不同等电点，也可将一些蛋白质混合物分开。 盐溶和盐析： 盐析：当溶液中盐浓度增大，离子强度达一定数值时，蛋白质溶解度下降并进一步析出。 盐析蛋白保持天然构象，能再溶解。一般用硫酸铵盐析，硫酸铵在水中溶解度高，且溶解度的温度系数较低。 盐溶：当加入低浓度中性盐时，蛋白质溶解度增加。 细分级分离： 一般用层析法和电泳法。 电泳：在外电场作用下，不处于等电状态的带电颗粒（如蛋白质分子） 将向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。 电泳迁移率或泳动度（μ）：为单位电场强度下，蛋白质分子在溶液中的移动速度。 μ = υ/E υ：颗粒泳动速度，E：电场强度 常用的电泳种类： 区带电泳：在支持物上电泳时，蛋白质混合物被分离成若干区带。 薄膜电泳：使用醋酸纤维薄膜和聚酰胺薄膜。 凝胶电泳：凝胶有分子筛效应，可更好分离。如常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 毛细管电泳（HPCE）：毛细管散热好，有助于消除热引起的对流和区带变宽；系统高分辨力，进样量少，可分离手性化合物。 等电聚焦电泳：具有不同等电点的两性电解质载体在电场中自动形成pH梯度，使被分离物移动至各自等电点的pH处，聚集成很窄的区带。 分辨率高，适于分离分子量相同而电荷不同的两性分子。 pH梯度制作：可利用两性电解质，已有商品出售。 亲和层析：是利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法，可一步提纯。 根据生物分子与特定固相化配体（Ligand）之间的亲和力不同，而使生物分子在一种特制的具有专一吸附能力的吸附剂上进行层析。 例如将酶的底物或抑制剂接到固体支持物上（如琼脂糖），制成专一吸附剂，并装在层析柱中。当含有这种酶的溶液通过层析柱时，酶就会被吸附，而其他蛋白质则不被吸附先流出；然后再用适当缓冲液将吸附在柱上的酶洗脱下来。 结晶： 结晶为蛋白质纯度一个标志，也是判断制品处于天然状态指标。蛋白质纯，则易结晶，为分离提纯最后步骤。