第十二章 基因工程 下册 P580 12-1 基因工程 是对携带遗传信息的分子进行设计和施工的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。核心是构建重组体DNA的技术。 DNA克隆 将DNA限制酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经无性繁殖以获得相同的DNA扩增分子。 DNA限制酶和连接酶： 限制酶可将DNA切割成平末端或黏性末端，互补黏性末端之间碱基配可促使连接反应容易进行。 相容的限制片段可用DNA连接酶相连接，DNA的黏性末端和平末端连接见P582 图40-1。 分子克隆的载体与宿主系统： 载体：将外源DNA带入宿主细胞并进行复制的运载工具。 克隆载体通常是由质粒、病毒（如λ-噬菌体）或一段染色体DNA改建而成。 质粒是染色体外自主复制的遗传因子，多为共价闭环DNA分子，常用作细菌与真菌的克隆载体。如用限制性酶切割环形质粒DNA，制备一个具黏性末端的开环质粒分子。 作为克隆载体应具有自主复制能力，有易于筛选的选择标记，如含有抗药基因等。 宿主细胞应根据载体的性质来选定，应易于接受外源DNA，且易于生长和筛选。 外源基因导入宿主细胞： 欲引入的外源目标DNA经限制酶切割后应与载体有同样的黏性末端，用连接酶将外源DNA片段和载体连接成外源基因。 用CaCl2等方法,使E. coli等宿主细胞处于感受态，从而将外源基因导入细胞。 此外还有电穿孔法等使外源DNA高效导入细胞。 最后分离筛选出带有目的基因的重组体并进行克隆（可按重组体某种特征，如抗药性选择、营养标记选择等在特定培养基上进行筛选后繁殖形成菌落。每个菌落的细胞将含有同样的重组质粒DNA，这些质粒DNA又含有同样外源DNA片段）。 基因文库 基因文库的构建： P589 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和。 理想情况下基因文库应包含该基因组的全部遗传信息。 基因文库的构建包括基因组DNA的随机片段化、载体DNA的制备、重组DNA的体外包装、重组噬菌体感染大肠杆菌、基因文库的鉴定和扩增等步骤。 cDNA文库的构建： 真核生物基因是断裂的，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。若将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（cDNA），接上原核生物表达控制元件，在原核生物表达。 通过cDNA还可研究不稳定的mRNA。 cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。 12-2 聚合酶链反应 P595 简称PCR（Polymerase Chain Reaction），为DNA体外酶促扩增，又称为无细胞分子克隆法。 PCR基本原理 将DNA聚合反应所需五大要素集中在体外缓冲液中，可合成与模板互补的DNA新链。 DNA聚合酶：可采用耐热的Tag DNA聚合酶。但Tag酶无校正功能，PCR产物易发生错误。现已有多种具有校正功能的耐热DNA聚合酶作为商品出售。 模板：欲扩增的DNA，通常只需1pg~1ng。加热变性后两条链均可作为模版。 引物：两条模板两个引物。为取得PCR成功首先条件是设计好引物。 ① 引物长度应大于16个核苷酸。② Tm > 550。③ 引物无发夹结构。④ 两引物间不应有大于4bp以上的互补序列或同源序列。⑤ 引物中碱基分布均匀，G+C含量接近50%。 四种dNTP底物。 mg2+。 PCR最适条件 开始在940C加热5~10分钟，使DNA模板完全变性，然后进入热循环。 变性：940C下45秒到1分钟，DNA双链解开。 退火：约91~920C 1分钟，引物与模板两端附着结合。（最适退火温度由实验确定） 延伸：720C 1~1.5分钟，新DNA链形成。 最后一次延伸时间10分钟。 以上条件用于扩增300~500bp长的DNA片段，若扩增更长的DNA，反应时间可以适当延长。 （三）PCR技术的发展与应用 见P596 广泛用于扩增单个DNA，DNA测序，疾病诊断，人类基因疾病鉴定和法医鉴定等，为发展最迅速应用最广泛的成熟生物技术之一。