分子细胞遗传学
原位杂交 (In situ hybridization)
1)同位素原位杂交 (Isotopic in situ hybridization)
—— 70年代
2)非同位素原位杂交 (Non-isotopic in situ hybridization)
—— 80年代中后期
( 1)免疫酶联
( 2)荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization,FISH)
**同位素原位杂交的不足之处:
1)不稳定;
2)低特异性;
3)高背景;
4)暴光时间长;
5)结果统计学处理繁琐。
Lichter P,Cremer T,Ward D.C.
FISH,(Fluorescent In Situ Hybridization).
FISH is the detection of highly specific DNA probes which
have been hybridized to either interphase or metaphase
chromosomes using fluorescence microscopy,
DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct
method) or non fluorescent molecules which are then
detected by fluorescent antibodies (indirect method),The
probes bind to a specific region or regions on the target
chromosome,The chromosomes are then stained using a
contrasting color,and the cells are viewed using a
fluorescence microscope.
**荧光原位杂交的特点:
1)快速; 2)信号强; 3)特异性高; 4)多色。
**FISH有上述优点的原因:
1)使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统
标记探针的物质,( 1)生物素 (biotin)/地高辛 (digoxigenin)
—— 半抗原报告分子(间接标记)
( 2)荧光物质(直接标记)
Cy2或 FluorX(绿色 ) / Cy3(橙色 ) / Cy3.5(猩红色 ) / Cy5(红色 ) / Aqua(兰色 )
间接标记的信号检测(抗 biotin或 digoxigenin抗体上连接荧光物质)物质:
conjugated to avidin or antibody of digoxigenin
(1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或 Bidopy—— 绿色
(2)Texas Red,Rhodamine,—— 红色
(3)AMCA—— 兰色
染色体复染的物质,
Propidium Iodide (PI)(红色),DAPI(兰色),quinacrine(绿色),
chromomycine A3(绿色)
2)染色体“原位抑制”杂交( chromosome in situ suppression,CISS)
克服散在的重复序列造成的杂交背景,提高信号的特异性,在探针中加入过量
的未标记的竞争性 DNA(competitor DNA),如 human Cot-1 DNA,进行杂交前
的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性,而
特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少,绝大部分仍保持单链状态。
**FISH技术的应用
1)基因(或 DNA片段)的染色体定位;
2)染色体数目与结构异常的检测;
3)间期细胞遗传学(绒毛 /羊水 /精子 /卵裂球 /其它间期细胞研究与诊断);
4)肿瘤遗传学研究
**用于 FISH的探针
1)单拷贝探针:
( 1)种类,YAC,BAC,Cosmid,Plasmid,cDNA片段
( 2)应用
( a)定位 DNA片段及嵌合体克隆验证;
( b)确定染色体微小缺失与重复;
( c)染色体断裂点分析。
( d)间期细胞染色体数目异常诊断。
左,DNA片段的染色体定位 右:嵌合体检出
FISH检测微小缺失
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1
A
B
A
B
Direct Dup
Normal
Normal
左图:染色体断裂点分析
—— 21号染色体长臂断裂点精确定位
右图,21q22.2 BAC克隆在 Down综合征间期细胞中的杂交信号
BAC 1D9 on 2p21 Detected Amplifications
on Thyroid Tumor Cell Line WRO
2)简单重复序列探针 (simple repetitive probes)
—— 异染色质着丝粒探针 (heterochromatic centromer probes)
其靶序列为 α卫星 DNA或卫星 III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染
色体的着丝粒和异染色质区域,重复数百次至数千次。
特点:信号强
应用,(a)标记染色体识别
(b)染色体数目异常检测
(c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
**间期细胞遗传学的意义:
细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十
分之一,经细胞培养和相应处理才能获得染色体。
人体的大部分细胞并不进行分裂,很难通过培养
获得中期染色体分裂相,间期 FISH为这一时期
遗传物质的研究提供了可能,而且快速。
3)染色体涂染探针 (chromosome painting probes)
整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源:
( 1)含有人单条染色体的人 -啮齿类 (human-rodent)体细胞杂种组
织融合的产物;
( 2)荧光激活的流式细胞仪 (fluorescence-activated cell
sorter,FACS)分离整条染色体 DNA,并以载体克隆 /PCR扩增;
( 3)显微切割得到染色体或染色体片段,PCR扩增;
染色体涂染方法:
( 1)正向 (forward):正常 probe杂交到待检测的异常标本上;
( 2)逆向 (reverse):分离异常染色体制备探针,杂交到正常标本上。
应用( 1)染色体数目和结构异常分析;
( 2)不同物种间的同源性比较;
( 3)白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
**不能用于间期 FISH
FISH检测( chromosome painting)染色体易位
4)多色 FISH( muti-color FISH)
多色复合染色体 FISH探针 (multiplex FISH,M-FISH probes)
#两种以上不同的非同位素标记,不同的荧光检测系统,通过不同的滤光片组合
或极少数几种非同位素标记探针后,按照不同的比例混合,可以显示多种颜色。
#采取结合或比率标记的方法进行标记探针。
在一套特殊的滤光片和计算机软件系统辅助下,可制作 24条染色体的彩色核型。
应用,(a)染色体数目和结构异常及断裂点分析 —— 多色 FISH或 M-FISH
(b)标记染色体识别 —— 多色 FISH或 M-FISH
(c)不同种属间基因组同源性比较 —— 多色 FISH
(d)多个 DNA片段同时定位 —— 多色 FISH
**M-FISH不能检测染色体内的倒位、小片段缺失与重复。
多色 FISH
M-FISH技术
5)彩色显带 FISH( Rx-FISH)探针
根据灵长类动物与人类基因组的同源性制作探针,使人
类的 24条染色体显示出彩色带型。
**比较基因组杂交 (comparative in situ hybridization)
探针位整个基因组 DNA,而不是一个点或一个区域,主要用于
确定未知区域的 DNA扩增或缺失。特别是回避了实体肿瘤染色
体制备的难题,是其它 FISH方法难以替代的。但操作难度较大。
应用,(a)肿瘤遗传学研究 —— 发现新的癌基因和抑癌基因;
(b)相关种属间和同一种属内不同个体之间基因组差异;
(c)染色体不平衡片段识别和染色体重排研究。
比较基因组杂交 (comparative genomic hybridization,CGH)
**染色质 fiber FISH
染色质从细胞中释放出来后,做 FISH。信号由中期或间期的点状,
形成线状排列。可提高定位的分辨率。
应用:
(a)估计 cosmid和 YAC或 BAC克隆重叠群的重叠程度,以及 gap的有
无和大小;
(b)确定 DNA微小缺失与重复;
(c)染色质结构研究。
**引物原位标记或 DNA合成
(PRIMED In Situ labeling / Primed In Situ DNA
synthesis,PRINS)
特点,(a)背景低;
(b)分析时间短;
(c)信号强。
**DNA fiber FISH
杂交靶不是细胞或染色体等组织,而是 DNA克隆。
原位杂交 (In situ hybridization)
1)同位素原位杂交 (Isotopic in situ hybridization)
—— 70年代
2)非同位素原位杂交 (Non-isotopic in situ hybridization)
—— 80年代中后期
( 1)免疫酶联
( 2)荧光原位杂交( Fluorescence in situ hybridization,FISH)
**同位素原位杂交的不足之处:
1)不稳定;
2)低特异性;
3)高背景;
4)暴光时间长;
5)结果统计学处理繁琐。
Lichter P,Cremer T,Ward D.C.
FISH,(Fluorescent In Situ Hybridization).
FISH is the detection of highly specific DNA probes which
have been hybridized to either interphase or metaphase
chromosomes using fluorescence microscopy,
DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct
method) or non fluorescent molecules which are then
detected by fluorescent antibodies (indirect method),The
probes bind to a specific region or regions on the target
chromosome,The chromosomes are then stained using a
contrasting color,and the cells are viewed using a
fluorescence microscope.
**荧光原位杂交的特点:
1)快速; 2)信号强; 3)特异性高; 4)多色。
**FISH有上述优点的原因:
1)使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统
标记探针的物质,( 1)生物素 (biotin)/地高辛 (digoxigenin)
—— 半抗原报告分子(间接标记)
( 2)荧光物质(直接标记)
Cy2或 FluorX(绿色 ) / Cy3(橙色 ) / Cy3.5(猩红色 ) / Cy5(红色 ) / Aqua(兰色 )
间接标记的信号检测(抗 biotin或 digoxigenin抗体上连接荧光物质)物质:
conjugated to avidin or antibody of digoxigenin
(1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或 Bidopy—— 绿色
(2)Texas Red,Rhodamine,—— 红色
(3)AMCA—— 兰色
染色体复染的物质,
Propidium Iodide (PI)(红色),DAPI(兰色),quinacrine(绿色),
chromomycine A3(绿色)
2)染色体“原位抑制”杂交( chromosome in situ suppression,CISS)
克服散在的重复序列造成的杂交背景,提高信号的特异性,在探针中加入过量
的未标记的竞争性 DNA(competitor DNA),如 human Cot-1 DNA,进行杂交前
的预复性。探针中的重复序列与加入的竞争物中的大量重复序列优先复性,而
特异性的单拷贝序列因竞争物中同源序列拷贝数少,绝大部分仍保持单链状态。
**FISH技术的应用
1)基因(或 DNA片段)的染色体定位;
2)染色体数目与结构异常的检测;
3)间期细胞遗传学(绒毛 /羊水 /精子 /卵裂球 /其它间期细胞研究与诊断);
4)肿瘤遗传学研究
**用于 FISH的探针
1)单拷贝探针:
( 1)种类,YAC,BAC,Cosmid,Plasmid,cDNA片段
( 2)应用
( a)定位 DNA片段及嵌合体克隆验证;
( b)确定染色体微小缺失与重复;
( c)染色体断裂点分析。
( d)间期细胞染色体数目异常诊断。
左,DNA片段的染色体定位 右:嵌合体检出
FISH检测微小缺失
染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1
A
B
A
B
Direct Dup
Normal
Normal
左图:染色体断裂点分析
—— 21号染色体长臂断裂点精确定位
右图,21q22.2 BAC克隆在 Down综合征间期细胞中的杂交信号
BAC 1D9 on 2p21 Detected Amplifications
on Thyroid Tumor Cell Line WRO
2)简单重复序列探针 (simple repetitive probes)
—— 异染色质着丝粒探针 (heterochromatic centromer probes)
其靶序列为 α卫星 DNA或卫星 III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染
色体的着丝粒和异染色质区域,重复数百次至数千次。
特点:信号强
应用,(a)标记染色体识别
(b)染色体数目异常检测
(c)间期细胞遗传学研究和临床诊断
**间期细胞遗传学的意义:
细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十
分之一,经细胞培养和相应处理才能获得染色体。
人体的大部分细胞并不进行分裂,很难通过培养
获得中期染色体分裂相,间期 FISH为这一时期
遗传物质的研究提供了可能,而且快速。
3)染色体涂染探针 (chromosome painting probes)
整条染色体探针或染色体区带特异性探针
探针来源:
( 1)含有人单条染色体的人 -啮齿类 (human-rodent)体细胞杂种组
织融合的产物;
( 2)荧光激活的流式细胞仪 (fluorescence-activated cell
sorter,FACS)分离整条染色体 DNA,并以载体克隆 /PCR扩增;
( 3)显微切割得到染色体或染色体片段,PCR扩增;
染色体涂染方法:
( 1)正向 (forward):正常 probe杂交到待检测的异常标本上;
( 2)逆向 (reverse):分离异常染色体制备探针,杂交到正常标本上。
应用( 1)染色体数目和结构异常分析;
( 2)不同物种间的同源性比较;
( 3)白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
**不能用于间期 FISH
FISH检测( chromosome painting)染色体易位
4)多色 FISH( muti-color FISH)
多色复合染色体 FISH探针 (multiplex FISH,M-FISH probes)
#两种以上不同的非同位素标记,不同的荧光检测系统,通过不同的滤光片组合
或极少数几种非同位素标记探针后,按照不同的比例混合,可以显示多种颜色。
#采取结合或比率标记的方法进行标记探针。
在一套特殊的滤光片和计算机软件系统辅助下,可制作 24条染色体的彩色核型。
应用,(a)染色体数目和结构异常及断裂点分析 —— 多色 FISH或 M-FISH
(b)标记染色体识别 —— 多色 FISH或 M-FISH
(c)不同种属间基因组同源性比较 —— 多色 FISH
(d)多个 DNA片段同时定位 —— 多色 FISH
**M-FISH不能检测染色体内的倒位、小片段缺失与重复。
多色 FISH
M-FISH技术
5)彩色显带 FISH( Rx-FISH)探针
根据灵长类动物与人类基因组的同源性制作探针,使人
类的 24条染色体显示出彩色带型。
**比较基因组杂交 (comparative in situ hybridization)
探针位整个基因组 DNA,而不是一个点或一个区域,主要用于
确定未知区域的 DNA扩增或缺失。特别是回避了实体肿瘤染色
体制备的难题,是其它 FISH方法难以替代的。但操作难度较大。
应用,(a)肿瘤遗传学研究 —— 发现新的癌基因和抑癌基因;
(b)相关种属间和同一种属内不同个体之间基因组差异;
(c)染色体不平衡片段识别和染色体重排研究。
比较基因组杂交 (comparative genomic hybridization,CGH)
**染色质 fiber FISH
染色质从细胞中释放出来后,做 FISH。信号由中期或间期的点状,
形成线状排列。可提高定位的分辨率。
应用:
(a)估计 cosmid和 YAC或 BAC克隆重叠群的重叠程度,以及 gap的有
无和大小;
(b)确定 DNA微小缺失与重复;
(c)染色质结构研究。
**引物原位标记或 DNA合成
(PRIMED In Situ labeling / Primed In Situ DNA
synthesis,PRINS)
特点,(a)背景低;
(b)分析时间短;
(c)信号强。
**DNA fiber FISH
杂交靶不是细胞或染色体等组织,而是 DNA克隆。