第五讲 分子生物学研究法
? 一,重组 DNA技术发展史上的重大事件
? 二,基因操作的主要技术原理
? 三,分子克隆技术
? 四,DNA的 Microarray
一,重组 DNA技术发展史上的重大
事件
1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的
分子载体是 DNA而不是蛋白质，解决了遗传
的物质基础问题；
2.50年代提示了 DNA分子的双螺旋结构模型和
半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世
代交替问题；
3.50年代末至 60年代，相继提出了 "中心法则 "
和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分
认识了遗传信息的流动和表达。
? 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离
DNA。
? 1944 O.T,Avery证实 DNA是遗传物质。
? 1952 A.D,Hershey和 M.Chase再次证实和噬菌
体的遗传物质是 DNA。
? 1953 J.D.Watson和 F.H.C.Crick提出 DNA分子结
构的双螺旋模型。 M.Wilkins用 X-射线衍射法证实
了这一结构。
? 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了 DNA聚合
酶 I。
? 1958 M,Meselson和 F,W,Stahl提出了 DNA的半
保留复制模型。
? 1959-1960 S,Ochoa发现 RNA聚合酶和信使
RNA，并证明 mRNA决定了蛋白质分子中的氨基
酸序列。
? 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码； F,Jacob
和 J,Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964 C,Yanofsky和 S,Brenner等人证明，多肽
链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在
着共线性关系。
? 1965 S,W,Holley完成了酵母丙氨酸 tRNA的全序
列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由,质
粒,DNA所决定。
? 1966 M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana、
F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
? 1970H.O.Smith,K.W.Wilcox和 T.J.Kelley分离了
第一种限制性核酸内切酶。 H.M.Temin和
D.Baltimore从 RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
? 1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人发展了 DNA重
组技术，于 72年获得第一个重组 DNA分子,73年
完成第一例细菌基因克隆。
? 1975-1977 F.Sanger与 A.Maxam,W.Gilbert等人
发明了 DNA序列测定技术。
? 1977年完成了全长 5387bp的噬菌体 φ174基因组
测定。
? 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达
的人脑激素和人胰岛素。
? 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以
专利化。
? 1981R,D,Palmiter和 R,L,Brinster获得转基因小
鼠； A,C,Spradling和 G,M,Rubin得到转基因果
蝇。
? 1982美、英批准使用第一例基因工程药物 --胰岛
素； Sanger等人完成了入噬菌体 48,502bp全序列
测定。
? 1983 获得第一例转基因植物。
? 1984 斯坦福大学获得关于重组 DNA的专利。
? 1986 GMO首次在环境中释放。
? 1988 J,D,Watson出任,人类基因组计划,首席科
学家。
? 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧 --
“Oncomouse”。
? 1992 欧共体 35个实验室联合完成酵母第三染色体
全序列测定 (315kb)
? 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。
? 1996完成了酵母基因组 (1.25× 107bp)全序列测定。
? 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
基因工程中常见的名词,
遗传工程 --genetic engineering，基因操作 -
-gone manipulation，基因克隆 --gone
cloning，
重组 DNA技术 --recombinant DNA
technology，分子克隆 --molecular cloning。
基因工程的主要内容或步骤,
1,从生物有机体基因组中，分离出带有目
的基因的 DNA片段。
2,将带有目的基因的外源 DNA片段连接到
能够自我复制的并具有选择记号的载体分
子上，形成重组 DNA分子。
3,将重组 DNA分子转移到适当的受体细胞
（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。
4,从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得
了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已
经得到扩增的目的基因。
5,将目的基因克隆到表达载体上，导入寄
主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能
表达，产生出人类所需要的物质。
二,基因操作的主要技术原理
1,核酸的凝胶电泳 (Agarose & Polyacrylamide)
? 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的
速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁
移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与
该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦
系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数
等）。
? 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化
的，所以,DNA和 RNA实际上呈多聚阴离子状态
（ Polyanions）。将 DNA,RNA放到电场中，它就
会由负极 → 正极移动。
? 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（ EB） -
-ethidium bromide染色，此时，核酸分子
在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约 50ng
DNA所形成的条带。
? DNA的脉冲电泳技术,PFGE-Pulse-field
gel electrophoresis
2,核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳
分离的 DNA或 RNA分子，都是在杂交之前，
通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中
的位置原封不动地 "吸印 " 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，
叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（ DBM）和二乙
氨基乙基纤维素滤膜（ DEAE）
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这
个过程特称为核酸印迹 (nucleic acid
blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、
斑点和狭线印迹法 (dot and slot blotting)、
菌落和噬菌斑印迹法 (colony and plaque
blotting)；
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记
或其它标记的 DNA或 RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3,细菌的转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来
自另一种细菌菌株的 DNA，而导致性状特征发生
遗传改变的生命过程。这种提供转化 DNA的菌株
叫做供体菌株，而接受转化 DNA的寄主菌株则称
做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。
在加入转化 DNA之前，必须预先用 CaCl2处理大
肠杆菌细胞，使之呈感受态（ Competent Cells）。
Mg2+对维持外源 DNA的稳定性起重要作用，质粒
DNA中的抗生素是筛选标记。
对绝大多数 hsdR-,hsdM-突变体菌株（ k12），
每 ug DNA可得 107-108个转化子。
4,DNA序列分析
a,Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的 F,Sanger在 1977年发明用双脱
氧链终止法测定单链 DNA的序列，其基本原理如
下：
① DNA聚合酶能够用单链 DNA作为模板，合成准
确的 DNA互补链； ② 该酶能够用 2',3'--双脱氧核
苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的
3'-末端，从而终止其延伸反应。在 DNA测序反应
中，加入模板 DNA，引物（特异性引物，如 T7，
T3,M13等）,DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC
和一种 ddNTP。常用 Klenow大片段，无 5'→3' 外
切酶活性。
b,Maxam-Gilbert化学修饰法 (哈佛大学 )
该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性
标记的 DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有
不同长度的 DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显
影之后，可直接读出待测 DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使 DNA的 4种核苷酸中，只有 1-2种
发生特异性的化学切割反应：
碱基的特异性修饰；
被修饰的碱基从核糖环上转移；
失去碱基的糖环部位发生 DNA链断裂。
专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学
试剂有硫酸二甲酯 (dimethylsulphate)和肼 (hydrazine)。
硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使 DNA链中鸟嘌呤
的 N7和腺嘌呤的 N6位发生甲基化，在中性 PH环境中就能
使糖苷键发生水解，并引起 DNA链的断裂。在碱性条件下，
肼能特异性切割 C和 T。如果加入 1 mol/L的 Nacl，那么，
只有 C被特异性切割。
c,DNA序列分析自
动化
用四甲基若丹明
(Tetramethylrhoda
mine)作为荧光剂
标记 DNA引物，带
有这种引物的 DNA
片段能在激光诱导
下发出荧光。按照
标准的双脱氧终止
法或化学终止法进
行测序反应，跑
DNA凝胶后用计算
机检测。
d.DNA杂交测序法 (SBH-Sequencing by
hybridization)
? 如果一段较短的 DNA探针能与较长的
DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，
我们就推测在靶 DNA上存在着相应的互补
序列，这就是 DNA杂交测序法的基本原理。
如果将一种 12-mer的靶 DNA与完全随机合
成的 8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数
为 48=65536种 8-mer的控针群体中，仅有 5
种探针会与靶 DNA杂交，形成完全互补的
双链分子。
? 当靶 DNA与标记探针形成 G-T或 G-A末端碱基错配
的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越
短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与
完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交
产物的总体稳定性下降，信 /噪比下降，影响结果
的可靠性。所以,6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用
于测定 500bp的靶 DNA； 7-mer=2000bp,8-
mer=8000bp。
? SBH的应用：
① 可有效检测靶 DNA中的单碱基突变；
② 可用于不同 DNA片段之间的序列比较；
③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基
因的表达状况；
④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
5,基因的定点诱变（ site-directed
mutagenesis）
使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个
特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过
程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋
白质工程的重要手段。
a,盒式诱变 (cassette mutagenesis)，包括盒
式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
b．寡核苷酸引物
诱变
应用化学
合成的含有突
变碱基的寡核
苷酸短片段做
引物，进行
DNA复制，使
寡核苷酸引物
成为新合成的
DNA子链的一
个部分。
C,PCRG与 PCR诱变
6,利用 DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究,
a.凝胶滞缓
实验 (Gel
retardation
assay)，
又称 DNA迁
移率变化试
验 (DNA
mobility
shift assay-
-EMSA)。
b,DNase I 印迹试验（ DNase I foot printing）
? 主要步骤：
① 用 32P标记 DNA双链末端，并用 RE切去一端；
② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；
③ 加入适量 DNaseI或硫酸二甲酯 -六氢吡啶，使
DNA链发生断裂。
这一反应中,DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关
键，要保证一条链只发生一次断裂！
④ 沉淀 DNA（包括与 DNA相结合的蛋白质）；
⑤ 进行 DNA凝胶分析。
? 如果某个蛋白质已经与 DNA的特定区段相结合，
那么，它就会保证该区段 DNA免受消化或降解作
用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋
白质结合的部位不产生放射性标记的条带。
c,甲基化干扰试验 (Methylation interference
assay)
? 用 DMS处理靶 DNA，使平均每条链上只
有一个 G被甲基化。将局部甲基化的 DNA与
含 DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进
行凝胶滞缓试验。分离各种 DNA条带，并
用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某
个 G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与
DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基
化 G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质
结合的 DNA中观察到。
d,体内足迹试验
? 用适量 DMS处理完
整的游离细胞，使染
色质中的 G残基甲基
化，提取 DNA并加
入六氢吡啶切割
DNA链。与对照的
裸露 DNA经甲基化
处理后形成的梯度相
对照，就能发现
DNA链上的蛋白质
结合区。
三、分子克隆技术
1、高质量 mRNA的制备
应用 Promega PolyAT tract
mRNA Isolation System
分离 Poly(A)RNA。将
Biotinylated Oligo(dT)引
物与细胞总 RNA共温育，
加入与微磁球相连的
Streptavidin，用磁场吸附
与 PMP相连的 SA-
Biotinylated Oligo(dT)-
mRNA。
2,反转录成 cDNA
可同时在反转录系统中加入 Oligo（ dT） 12-
18-mer及随机引物 R6，以保证得到全长
cDNA；
应选用活性较高的反转录酶（ Reverse
transcriptase）；
应选用甲基化 dCTP；
应保证所获得双链 cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系统中所用的 poly（ dT）引物
因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有 5?-methyl C的外源 DNA，
所以，应选用 mcrA- mcrB-菌株。
3．分子克隆的主要方法
? （ 1）构建 cDNA、核 DNA文库，应用现有
核酸探针分离新的目的基因；
（ 2）差式杂交 (differential screen)和扣除
杂交 (subtractive hybridization)技术；
（ 3） DD-RT-PCR法及差别显示技术；
（ 4）差别分析法 (RDA法，即
Representational difference analysis）；
（ 5）酵母双杂交体系 Two-hybrid system；
（ 6）图位克隆法（ map-based cloning）
与染色体步移 （ genomic DNA
Walking）。
? 习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两
个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来
的单卵双生子（ monozygotic twins）便属于同一克隆。细
胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（ progenitor cell）分裂
而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，
把将外源 DNA插入具有自主复制能力的载体 DNA中，使之
得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。
? 文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，
卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总 mRNA量的 50-
90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有
10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含 10,000到 40,000种不
同的 mRNA，如果要达到 99%的期望值，大约需要筛选
150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克 cDNA可
产生 10万 -60万个克隆子。
A.差式杂交或扣除杂交克隆技术
B.cRNA差式显示法
? 除了极少数特例 (如组蛋白基因 )之外，几乎所有
的真核基因 mRNA分子的 3'-末端，都带有一段多
聚的腺苷酸结构，即通常所说的 poly(A)尾巴。
? P.Liang等人设计合成了全部 12种不同的引物，
用以反转录 mRNA，合成第一链 cDNA。这种引物
通常叫作 3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用 5'-
T11MN或 5'-T12MN通式表示。其中 M为除了 T以
外的任何一种核苷酸（即 A,G或 C），而 N则为
任何一种核苷酸（即 A,G,C或 T），故 MN共有
12种不同的排列组合方式。
? DDRT-PCR的主要步骤：
Ⅰ,从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分
离 mRNA，并以 3'锚定引物作为反转录的引物，
合成第一键 cDNA；
Ⅱ,用 5'随机引物和某个 3'端锚定引物对扩增第一
链 (掺入 32p-dNTP)；
Ⅲ,用 DNA变性测序胶分离扩增产物,X光片曝光
后检测差别条带；
Ⅳ,回收特异性差别条带；
Ⅴ,用同一引物对扩增已回收的 DNA条带；
Ⅵ,用 Northern,Southern及测序法分析所得的条
带；
Ⅶ,以该 DNA片段做探针，筛选全长 cDNA或核基
因。
C.cDNA差式分析法 (Representational ditterence
analysis)
? RDA法充分发挥了 PCR以指数形式扩增双链
DNA模板的特性，通过降低 cDNA群体复杂性和
更换 cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因
片段。因为试验对象（ Tester）和供试探针
（ Driver）在接受差式分析前均经一个 4碱基切割
酶处理，形成平均长度 256bp的代表群
（ representation）保证绝大部分遗传信息能被扩
增。每次 T减 D反应后仅设置 72℃ 复性与延伸，
94℃ 复性这两个参数共 20个 PCR循环,PCR产物
的特异性和所得探针的纯度非常高。
D.酵母双杂交体系
? Two-hybrid system也叫 interaction trap（相互作用陷
井），是 90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于
分离能与已知靶蛋白质（ target protein）相互作用的基因。
? 基本原理：
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上
独立的结构域组成的。如 GAL4的 N端 1-147aa是 DNA结合
域（ BD），其 C端 768-881aa是转录激活域（ AD）。一
般情况下,AD能与 GAL4效应基因启动子上游的特定 DNA
区段（ UAS）相结合，而此时,AD则推动了转录起始。
? 若用基因工程的方法，将 GAL4 AD和 BD分别克隆到不
同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激
活,但可把来自不同转录因子的 AD或 BD区域连成一个功能
基
? 主要实验过程：
a,选择缺失 GAL4编码基因的酵母寄主菌株 -
SFY526或 HF7c；
b,构建带有 GAL1 UAS-启动子 -lac Z（ His3）的
转化载体 ;
c,把已知的靶蛋白质编码基因克隆到 pGBT9的多
克隆位点上，把所有 cDNA都克隆到 pGAD424载
体上，构成 cDNA表达文库。
d,从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒 DNA，
共转化感受态酿酒酵母菌株。
e,将共转化的酵母菌株涂布于缺少 Leu,Trp和
His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的
阳性菌落。
E.基因的图位克隆法
? Map-based cloning是分离未知性状目的基因的
一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型
的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目
的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两
侧确定紧密连锁的 RFLP或 RAPD分子标记。二、
利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探
针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间
的基因片段克隆并分离出来。三、根据基因功能
互作原理鉴定目的基因。
? 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶
和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的
RFLP标记。在 RFLP作图中，连锁距离是根据重
组率来计算的,1cm（厘米）相当于 1%的重组率。
人类基因组中,1cm≈1000kb;拟南芥菜中，
1cm≈290kb;小麦中,1cm≈3500kb。
四,DNA的 Microarray
只要事先除去高度及中等重复序列，任何 DNA都可以被用于
Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（ nanoliters）
的 DNA点到玻片或其它载体上，照射 UV light使之永久固定，
用不同细胞周期发育阶段的 cDNA作探针系统性地研究细胞
中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全部已
知基因分别点到 DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育
阶段的 cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育
阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正
常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用
可疑病人的 cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受
抑制或激活。
? 一,重组 DNA技术发展史上的重大事件
? 二,基因操作的主要技术原理
? 三,分子克隆技术
? 四,DNA的 Microarray
一,重组 DNA技术发展史上的重大
事件
1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的
分子载体是 DNA而不是蛋白质，解决了遗传
的物质基础问题；
2.50年代提示了 DNA分子的双螺旋结构模型和
半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世
代交替问题；
3.50年代末至 60年代，相继提出了 "中心法则 "
和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分
认识了遗传信息的流动和表达。
? 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离
DNA。
? 1944 O.T,Avery证实 DNA是遗传物质。
? 1952 A.D,Hershey和 M.Chase再次证实和噬菌
体的遗传物质是 DNA。
? 1953 J.D.Watson和 F.H.C.Crick提出 DNA分子结
构的双螺旋模型。 M.Wilkins用 X-射线衍射法证实
了这一结构。
? 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了 DNA聚合
酶 I。
? 1958 M,Meselson和 F,W,Stahl提出了 DNA的半
保留复制模型。
? 1959-1960 S,Ochoa发现 RNA聚合酶和信使
RNA，并证明 mRNA决定了蛋白质分子中的氨基
酸序列。
? 1961Nirenberg破译了第一相遗传密码； F,Jacob
和 J,Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
1964 C,Yanofsky和 S,Brenner等人证明，多肽
链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在
着共线性关系。
? 1965 S,W,Holley完成了酵母丙氨酸 tRNA的全序
列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由,质
粒,DNA所决定。
? 1966 M.W.Nirenberg,S.Ochoa,H.G.Khorana、
F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
? 1970H.O.Smith,K.W.Wilcox和 T.J.Kelley分离了
第一种限制性核酸内切酶。 H.M.Temin和
D.Baltimore从 RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
? 1972-1973 H.Boyer,P.Berg等人发展了 DNA重
组技术，于 72年获得第一个重组 DNA分子,73年
完成第一例细菌基因克隆。
? 1975-1977 F.Sanger与 A.Maxam,W.Gilbert等人
发明了 DNA序列测定技术。
? 1977年完成了全长 5387bp的噬菌体 φ174基因组
测定。
? 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达
的人脑激素和人胰岛素。
? 1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以
专利化。
? 1981R,D,Palmiter和 R,L,Brinster获得转基因小
鼠； A,C,Spradling和 G,M,Rubin得到转基因果
蝇。
? 1982美、英批准使用第一例基因工程药物 --胰岛
素； Sanger等人完成了入噬菌体 48,502bp全序列
测定。
? 1983 获得第一例转基因植物。
? 1984 斯坦福大学获得关于重组 DNA的专利。
? 1986 GMO首次在环境中释放。
? 1988 J,D,Watson出任,人类基因组计划,首席科
学家。
? 1989DuPont公司获得转肿瘤基因小氧 --
“Oncomouse”。
? 1992 欧共体 35个实验室联合完成酵母第三染色体
全序列测定 (315kb)
? 1994第一批基因工程西红柿在美国上市。
? 1996完成了酵母基因组 (1.25× 107bp)全序列测定。
? 1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。
基因工程中常见的名词,
遗传工程 --genetic engineering，基因操作 -
-gone manipulation，基因克隆 --gone
cloning，
重组 DNA技术 --recombinant DNA
technology，分子克隆 --molecular cloning。
基因工程的主要内容或步骤,
1,从生物有机体基因组中，分离出带有目
的基因的 DNA片段。
2,将带有目的基因的外源 DNA片段连接到
能够自我复制的并具有选择记号的载体分
子上，形成重组 DNA分子。
3,将重组 DNA分子转移到适当的受体细胞
（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。
4,从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得
了重组 DNA分子的受体细胞，并筛选出已
经得到扩增的目的基因。
5,将目的基因克隆到表达载体上，导入寄
主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能
表达，产生出人类所需要的物质。
二,基因操作的主要技术原理
1,核酸的凝胶电泳 (Agarose & Polyacrylamide)
? 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的
速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁
移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与
该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦
系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数
等）。
? 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化
的，所以,DNA和 RNA实际上呈多聚阴离子状态
（ Polyanions）。将 DNA,RNA放到电场中，它就
会由负极 → 正极移动。
? 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（ EB） -
-ethidium bromide染色，此时，核酸分子
在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约 50ng
DNA所形成的条带。
? DNA的脉冲电泳技术,PFGE-Pulse-field
gel electrophoresis
2,核酸的分子杂交技术
在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳
分离的 DNA或 RNA分子，都是在杂交之前，
通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中
的位置原封不动地 "吸印 " 转移到滤膜上的。
常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，
叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（ DBM）和二乙
氨基乙基纤维素滤膜（ DEAE）
核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这
个过程特称为核酸印迹 (nucleic acid
blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、
斑点和狭线印迹法 (dot and slot blotting)、
菌落和噬菌斑印迹法 (colony and plaque
blotting)；
将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记
或其它标记的 DNA或 RNA探针进行杂交。
所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
3,细菌的转化
所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来
自另一种细菌菌株的 DNA，而导致性状特征发生
遗传改变的生命过程。这种提供转化 DNA的菌株
叫做供体菌株，而接受转化 DNA的寄主菌株则称
做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。
在加入转化 DNA之前，必须预先用 CaCl2处理大
肠杆菌细胞，使之呈感受态（ Competent Cells）。
Mg2+对维持外源 DNA的稳定性起重要作用，质粒
DNA中的抗生素是筛选标记。
对绝大多数 hsdR-,hsdM-突变体菌株（ k12），
每 ug DNA可得 107-108个转化子。
4,DNA序列分析
a,Sanger的双脱氧链终止法
Cambridge的 F,Sanger在 1977年发明用双脱
氧链终止法测定单链 DNA的序列，其基本原理如
下：
① DNA聚合酶能够用单链 DNA作为模板，合成准
确的 DNA互补链； ② 该酶能够用 2',3'--双脱氧核
苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的
3'-末端，从而终止其延伸反应。在 DNA测序反应
中，加入模板 DNA，引物（特异性引物，如 T7，
T3,M13等）,DNA聚合酶,dA,dT,dG,dC
和一种 ddNTP。常用 Klenow大片段，无 5'→3' 外
切酶活性。
b,Maxam-Gilbert化学修饰法 (哈佛大学 )
该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性
标记的 DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有
不同长度的 DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显
影之后，可直接读出待测 DNA片段的核苷酸序列。
该反应的关键在于使 DNA的 4种核苷酸中，只有 1-2种
发生特异性的化学切割反应：
碱基的特异性修饰；
被修饰的碱基从核糖环上转移；
失去碱基的糖环部位发生 DNA链断裂。
专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学
试剂有硫酸二甲酯 (dimethylsulphate)和肼 (hydrazine)。
硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使 DNA链中鸟嘌呤
的 N7和腺嘌呤的 N6位发生甲基化，在中性 PH环境中就能
使糖苷键发生水解，并引起 DNA链的断裂。在碱性条件下，
肼能特异性切割 C和 T。如果加入 1 mol/L的 Nacl，那么，
只有 C被特异性切割。
c,DNA序列分析自
动化
用四甲基若丹明
(Tetramethylrhoda
mine)作为荧光剂
标记 DNA引物，带
有这种引物的 DNA
片段能在激光诱导
下发出荧光。按照
标准的双脱氧终止
法或化学终止法进
行测序反应，跑
DNA凝胶后用计算
机检测。
d.DNA杂交测序法 (SBH-Sequencing by
hybridization)
? 如果一段较短的 DNA探针能与较长的
DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，
我们就推测在靶 DNA上存在着相应的互补
序列，这就是 DNA杂交测序法的基本原理。
如果将一种 12-mer的靶 DNA与完全随机合
成的 8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数
为 48=65536种 8-mer的控针群体中，仅有 5
种探针会与靶 DNA杂交，形成完全互补的
双链分子。
? 当靶 DNA与标记探针形成 G-T或 G-A末端碱基错配
的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越
短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与
完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交
产物的总体稳定性下降，信 /噪比下降，影响结果
的可靠性。所以,6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用
于测定 500bp的靶 DNA； 7-mer=2000bp,8-
mer=8000bp。
? SBH的应用：
① 可有效检测靶 DNA中的单碱基突变；
② 可用于不同 DNA片段之间的序列比较；
③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基
因的表达状况；
④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
5,基因的定点诱变（ site-directed
mutagenesis）
使已克隆基因或 DNA片段中的任何一个
特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过
程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋
白质工程的重要手段。
a,盒式诱变 (cassette mutagenesis)，包括盒
式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
b．寡核苷酸引物
诱变
应用化学
合成的含有突
变碱基的寡核
苷酸短片段做
引物，进行
DNA复制，使
寡核苷酸引物
成为新合成的
DNA子链的一
个部分。
C,PCRG与 PCR诱变
6,利用 DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究,
a.凝胶滞缓
实验 (Gel
retardation
assay)，
又称 DNA迁
移率变化试
验 (DNA
mobility
shift assay-
-EMSA)。
b,DNase I 印迹试验（ DNase I foot printing）
? 主要步骤：
① 用 32P标记 DNA双链末端，并用 RE切去一端；
② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；
③ 加入适量 DNaseI或硫酸二甲酯 -六氢吡啶，使
DNA链发生断裂。
这一反应中,DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关
键，要保证一条链只发生一次断裂！
④ 沉淀 DNA（包括与 DNA相结合的蛋白质）；
⑤ 进行 DNA凝胶分析。
? 如果某个蛋白质已经与 DNA的特定区段相结合，
那么，它就会保证该区段 DNA免受消化或降解作
用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋
白质结合的部位不产生放射性标记的条带。
c,甲基化干扰试验 (Methylation interference
assay)
? 用 DMS处理靶 DNA，使平均每条链上只
有一个 G被甲基化。将局部甲基化的 DNA与
含 DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进
行凝胶滞缓试验。分离各种 DNA条带，并
用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某
个 G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与
DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基
化 G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质
结合的 DNA中观察到。
d,体内足迹试验
? 用适量 DMS处理完
整的游离细胞，使染
色质中的 G残基甲基
化，提取 DNA并加
入六氢吡啶切割
DNA链。与对照的
裸露 DNA经甲基化
处理后形成的梯度相
对照，就能发现
DNA链上的蛋白质
结合区。
三、分子克隆技术
1、高质量 mRNA的制备
应用 Promega PolyAT tract
mRNA Isolation System
分离 Poly(A)RNA。将
Biotinylated Oligo(dT)引
物与细胞总 RNA共温育，
加入与微磁球相连的
Streptavidin，用磁场吸附
与 PMP相连的 SA-
Biotinylated Oligo(dT)-
mRNA。
2,反转录成 cDNA
可同时在反转录系统中加入 Oligo（ dT） 12-
18-mer及随机引物 R6，以保证得到全长
cDNA；
应选用活性较高的反转录酶（ Reverse
transcriptase）；
应选用甲基化 dCTP；
应保证所获得双链 cDNA的方向性。
Super Script Choice cDNA合成系统中所用的 poly（ dT）引物
因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有 5?-methyl C的外源 DNA，
所以，应选用 mcrA- mcrB-菌株。
3．分子克隆的主要方法
? （ 1）构建 cDNA、核 DNA文库，应用现有
核酸探针分离新的目的基因；
（ 2）差式杂交 (differential screen)和扣除
杂交 (subtractive hybridization)技术；
（ 3） DD-RT-PCR法及差别显示技术；
（ 4）差别分析法 (RDA法，即
Representational difference analysis）；
（ 5）酵母双杂交体系 Two-hybrid system；
（ 6）图位克隆法（ map-based cloning）
与染色体步移 （ genomic DNA
Walking）。
? 习惯上，人们用克隆表示由同一物种具有相同基因型的两
个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来
的单卵双生子（ monozygotic twins）便属于同一克隆。细
胞学上，克隆是指由同一个祖细胞（ progenitor cell）分裂
而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，
把将外源 DNA插入具有自主复制能力的载体 DNA中，使之
得以自主复制和永久保存的过程叫做分子克隆。
? 文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，
卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总 mRNA量的 50-
90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有
10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含 10,000到 40,000种不
同的 mRNA，如果要达到 99%的期望值，大约需要筛选
150,000-170,000个克隆子。一般情况下，每微克 cDNA可
产生 10万 -60万个克隆子。
A.差式杂交或扣除杂交克隆技术
B.cRNA差式显示法
? 除了极少数特例 (如组蛋白基因 )之外，几乎所有
的真核基因 mRNA分子的 3'-末端，都带有一段多
聚的腺苷酸结构，即通常所说的 poly(A)尾巴。
? P.Liang等人设计合成了全部 12种不同的引物，
用以反转录 mRNA，合成第一链 cDNA。这种引物
通常叫作 3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用 5'-
T11MN或 5'-T12MN通式表示。其中 M为除了 T以
外的任何一种核苷酸（即 A,G或 C），而 N则为
任何一种核苷酸（即 A,G,C或 T），故 MN共有
12种不同的排列组合方式。
? DDRT-PCR的主要步骤：
Ⅰ,从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分
离 mRNA，并以 3'锚定引物作为反转录的引物，
合成第一键 cDNA；
Ⅱ,用 5'随机引物和某个 3'端锚定引物对扩增第一
链 (掺入 32p-dNTP)；
Ⅲ,用 DNA变性测序胶分离扩增产物,X光片曝光
后检测差别条带；
Ⅳ,回收特异性差别条带；
Ⅴ,用同一引物对扩增已回收的 DNA条带；
Ⅵ,用 Northern,Southern及测序法分析所得的条
带；
Ⅶ,以该 DNA片段做探针，筛选全长 cDNA或核基
因。
C.cDNA差式分析法 (Representational ditterence
analysis)
? RDA法充分发挥了 PCR以指数形式扩增双链
DNA模板的特性，通过降低 cDNA群体复杂性和
更换 cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因
片段。因为试验对象（ Tester）和供试探针
（ Driver）在接受差式分析前均经一个 4碱基切割
酶处理，形成平均长度 256bp的代表群
（ representation）保证绝大部分遗传信息能被扩
增。每次 T减 D反应后仅设置 72℃ 复性与延伸，
94℃ 复性这两个参数共 20个 PCR循环,PCR产物
的特异性和所得探针的纯度非常高。
D.酵母双杂交体系
? Two-hybrid system也叫 interaction trap（相互作用陷
井），是 90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于
分离能与已知靶蛋白质（ target protein）相互作用的基因。
? 基本原理：
真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上
独立的结构域组成的。如 GAL4的 N端 1-147aa是 DNA结合
域（ BD），其 C端 768-881aa是转录激活域（ AD）。一
般情况下,AD能与 GAL4效应基因启动子上游的特定 DNA
区段（ UAS）相结合，而此时,AD则推动了转录起始。
? 若用基因工程的方法，将 GAL4 AD和 BD分别克隆到不
同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激
活,但可把来自不同转录因子的 AD或 BD区域连成一个功能
基
? 主要实验过程：
a,选择缺失 GAL4编码基因的酵母寄主菌株 -
SFY526或 HF7c；
b,构建带有 GAL1 UAS-启动子 -lac Z（ His3）的
转化载体 ;
c,把已知的靶蛋白质编码基因克隆到 pGBT9的多
克隆位点上，把所有 cDNA都克隆到 pGAD424载
体上，构成 cDNA表达文库。
d,从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒 DNA，
共转化感受态酿酒酵母菌株。
e,将共转化的酵母菌株涂布于缺少 Leu,Trp和
His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的
阳性菌落。
E.基因的图位克隆法
? Map-based cloning是分离未知性状目的基因的
一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型
的基因都可以通过该方法克隆得到。首先，将目
的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两
侧确定紧密连锁的 RFLP或 RAPD分子标记。二、
利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探
针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间
的基因片段克隆并分离出来。三、根据基因功能
互作原理鉴定目的基因。
? 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶
和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的
RFLP标记。在 RFLP作图中，连锁距离是根据重
组率来计算的,1cm（厘米）相当于 1%的重组率。
人类基因组中,1cm≈1000kb;拟南芥菜中，
1cm≈290kb;小麦中,1cm≈3500kb。
四,DNA的 Microarray
只要事先除去高度及中等重复序列，任何 DNA都可以被用于
Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（ nanoliters）
的 DNA点到玻片或其它载体上，照射 UV light使之永久固定，
用不同细胞周期发育阶段的 cDNA作探针系统性地研究细胞
中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全部已
知基因分别点到 DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育
阶段的 cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育
阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正
常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用
可疑病人的 cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受
抑制或激活。
