? 第九章 基因重组与基因工程
Gene Recombination and
Genetic Engineering
转基因植物获得新的性状
把
大
鼠
生
长
因
子
转
入
小
鼠
得
到
巨
大
型
的
转
基
因
小
鼠
。
用噬
菌体
DNA
构建
重组
DNA
分子
用
质
粒
构
建
重
组
D
N
A
分
子
? 基因重组 (gene recombination)是指
DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不
同物种之间进行交换，交换后的片段仍
然具有复制和表达的功能。
? 基因工程 (genetic engineering） 是指
采用人工方法将不同来源的 DNA进行重
组，并将重组后的 DNA引入宿主细胞中
进行增殖或表达的过程。
重组 DNA技术
? 重组 DNA技术又称为 基因工程 （ genetic
engineering）或 分子克隆 (molecular
cloning)。 基因工程的操作过程主要由以
下步骤组成：
? ① 载体和目的基因的分离；
? ②载体和目的基因的切断；
? ③载体和目的基因的重组；
? ④重组 DNA的转化和扩增；
? ⑤重组 DNA的筛选和鉴定。
? 一、载体和目的基因的分离
? 为了进行基因重组，首先需要对载体 DNA
和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯
品。
? （一）载体,基因工程中常用的载体
(vector)主要包括 质粒 (plasmid)、噬菌体
(phage)和 病毒 (virus)三大类。这些载体
均需经人工构建，除去致病基因，并赋予
一些新的功能，如有利于进行筛选的标志
基因、单一的限制酶切点等。
? 1．质粒,是存在于天然细菌体内的一
种独立于细菌染色体之外的 双链环状
DNA，具有 独立复制 的能力，通常带有
细菌的 抗药基因 。 最早使用的质粒 DNA
是人工构建的 pBR322，该质粒分子大
小为 4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青
霉素基因，含 EcoRⅠ, BamHⅠ,
HindⅢ 等单一的限制酶切点。
质粒 pUC19的分子结构
2．噬菌体,
可通过转染方式将其 DNA送入细菌体内进行增殖 。 常用的为人工构建的
? 3．病毒, 常用的为 SV40，通过感染方
式将其 DNA送入哺乳动物细胞中进行增
殖。目前应用相对较少。
? （二）目的基因,
? 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进
行：
? 1．直接从染色体 DNA中分离, 仅适用于
原核生物基因的分离，较少采用。
? 2．人工合成：
? 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传
密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。
适应于编码小分子多肽的基因。
3．从 mRNA合成 cDNA：
采用一定的方法钓取特定基因的 mRNA,再通过逆转录酶催化合成其互补
? 4．从基因文库中筛选, 将某一种基
因 DNA用适当的限制酶切断后，与
载体 DNA重组，再全部转化宿主细
胞，得到含全部基因组 DNA的种群，
称为 G文库 (genomic DNA library)。
将某种细胞的全部 mRNA通过逆转
合成 cDNA，然后转化宿主细胞，得
到含全部表达基因的种群，称为 C-
文库 (cDNA library)。 C-文库具有
组织细胞特异性。
基因组文库的制作
5．利用 PCR合成,
如已知目的基因两端的序列, 则可采用聚合酶链反应 （ polymerase
? 二、载体和目的基因的切断
? 通常采用 限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease)，简称
限制酶，分别对载体 DNA和目的基因
进行切断，以便于重组。限制酶目前
已经发现 400多种，所识别的顺序往
往为 4-8个碱基对，且有 回文结构 。
由限制酶切断后的末端可形成 平端、
3'-突出粘性末端和 5'-突出粘性末端
三种情况。形成粘性末端 (cohesive
end)者较有利于载体 DNA和目的基因
的重组。
? 三、载体和目的基因的重组
? 即将带有切口的载体与所获得的目的
基因连接起来，得到重新组合后的
DNA分子。
? （一）粘性末端连接法, 当载体 DNA
和目的基因均用同一种限制酶进行切
断时，二者即可带有相同的粘性末端。
如将载体与目的基因混合在一起，二
者即可通过粘性末端进行互补粘合，
再加入 DNA连接酶，即可封闭其缺口，
得到重组体。 较少的情况下，对产生
的平端也可直接进行连接。
载体 DNA与目的基因的连接
? （二）人工接尾法, 即同聚物加尾连接
法。当载体和目的基因无法采用同一种
限制酶进行切断，无法得到相同得粘性
末端时，可采用此方法。 此法首先使用
单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端
核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核
苷酸添加于载体或目的基因的 3'-端，如
载体上添加一段 polyG，则可在目的基
因上添加一段 polyC，故二者即可通过
碱基互补进行粘合，再由 DNA连接酶连
接。
? （三）人工接头连接法, 将人工连接器
（即一段含有多种限制酶切点的 DNA片
段）连接到载体和目的基因上，即有可
能使用同一种限制酶对载体和目的基因
进行切断，得到可以互补的粘性末端。
? 四、重组 DNA的转化和扩增
? 重组 DNA需导入宿主细胞才能进行增殖
或表达。重组质粒可通过 转化
（ transformation）方式导入宿主细胞，
即将大肠杆菌用 CaCl2处理，增加细菌
细胞壁的通透性，再与重组质粒 DNA短
暂温育，质粒 DNA即可导入宿主细胞。
? 如果是用 λ噬菌体作为载体的重组体，则需要
用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能
力的噬菌体，再通过 转染 (transfection)方
式将重组噬菌体 DNA导入大肠杆菌等宿主细
胞。 重组 DNA导入宿主细胞后，即可在适当
的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对
于质粒 DNA，还可通过在培养基中加入氯霉
素，抑制细菌蛋白质合成及染色体 DNA的复
制，以单独扩增细胞中的质粒 DNA。
? 五、重组 DNA的筛选和鉴定
? 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，
因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛
选并作鉴定。可采用以下方法进行：
? （ 一）根据重组体的表型进行筛选, 对于
带有抗药基因的质粒重组体，可采用 插入
灭活法 进行筛选。如 pBR322中带有抗氨
苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因
插入抗四环素基因后，就可引起该基因失
活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素
敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生
长，而在含四环素的培养基上不能生长的
细菌即为带重组体的细菌。
插
入
灭
活
法
筛
选
重
组
体
? （二）根据标志互补进行筛选, 当宿主
细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷
时，可采用此方法筛选重组体。即在载
体 DNA分子中插入相应的缺陷基因，如
宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，
则说明该细胞中带有重组体。
? （三）根据 DNA限制酶谱进行分析,
经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进
行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细
菌进行扩增后分别提取其 DNA，用重组
时所用的同一限制酶进行酶切，再将其
与不含目的基因的载体一起进行电泳比
较分析，如发现出现目的基因片段的电
泳带即证明重组体中带有目的基因。
（ 四）用核酸杂交法进行分析鉴定,
为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的
? 获得带目的基因的细菌后，可将其
不断进行增殖，从而得到大量的目的基
因片段用于分析研究。如在目的基因的
上游带有启动子顺序，则目的基因还可
转录表达合成蛋白质。
? 五, 转基因技术
? 1982年 Palmiter等人首次将大白鼠的
生长激素基因放在质粒中小白鼠金属
巯基蛋白启动子之后 。
? 这个启动子通常在染色体上, 控制金
属巯基蛋白的转录 。
? 将重组好的这种质粒（几百个拷贝）
用特制的微量注射器注入小鼠受精卵
的雄性原细胞核（ pronuc leus）中，
再将这个受精卵植入小鼠 子宫中。
结 果 发 育 生 成 的 小 鼠 中 经
Southen杂交证明许多小鼠中
都含有大白鼠的生长激素基因 。
而且成熟的小鼠体重比对照大
两倍, 成为, 硕鼠, 或, 超级
鼠, 。 这个实验首次证明, 外
源基因在新的启动子控制下可
以整合到哺乳类细胞核内, 并
在其中实现有效地表达 。 转基
因技术中有关外源基因与染色
体的定位重组, 表达调控等还
有待深入研究 。
六, 体细胞克隆技术
? 1997 年 Nature 杂 志 报 导, 英 国 学 者
I.Wilmut 等人, 从一只胚胎羊中取出乳
腺上皮细胞进行培养 （ 供体 ）, 再用另
一母羊的卵细胞 （ 受体 ） 摘出细胞核后,
与上述乳腺上皮细胞进行体外融合 。 融
合体经培养后, 植入受体母羊的子宫中,
结果融合体发育并分娩出一头小羊, 多
利, 。 称为克隆羊 。 这是 20世纪生物科
学震惊世界的成就 。 它表明成熟的体细
胞可以不经过有性繁殖发育成个体 。
Gene Recombination and
Genetic Engineering
转基因植物获得新的性状
把
大
鼠
生
长
因
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转
入
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鼠
得
到
巨
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型
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转
基
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小
鼠
。
用噬
菌体
DNA
构建
重组
DNA
分子
用
质
粒
构
建
重
组
D
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子
? 基因重组 (gene recombination)是指
DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不
同物种之间进行交换，交换后的片段仍
然具有复制和表达的功能。
? 基因工程 (genetic engineering） 是指
采用人工方法将不同来源的 DNA进行重
组，并将重组后的 DNA引入宿主细胞中
进行增殖或表达的过程。
重组 DNA技术
? 重组 DNA技术又称为 基因工程 （ genetic
engineering）或 分子克隆 (molecular
cloning)。 基因工程的操作过程主要由以
下步骤组成：
? ① 载体和目的基因的分离；
? ②载体和目的基因的切断；
? ③载体和目的基因的重组；
? ④重组 DNA的转化和扩增；
? ⑤重组 DNA的筛选和鉴定。
? 一、载体和目的基因的分离
? 为了进行基因重组，首先需要对载体 DNA
和目的基因分别进行分离纯化，得到其纯
品。
? （一）载体,基因工程中常用的载体
(vector)主要包括 质粒 (plasmid)、噬菌体
(phage)和 病毒 (virus)三大类。这些载体
均需经人工构建，除去致病基因，并赋予
一些新的功能，如有利于进行筛选的标志
基因、单一的限制酶切点等。
? 1．质粒,是存在于天然细菌体内的一
种独立于细菌染色体之外的 双链环状
DNA，具有 独立复制 的能力，通常带有
细菌的 抗药基因 。 最早使用的质粒 DNA
是人工构建的 pBR322，该质粒分子大
小为 4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青
霉素基因，含 EcoRⅠ, BamHⅠ,
HindⅢ 等单一的限制酶切点。
质粒 pUC19的分子结构
2．噬菌体,
可通过转染方式将其 DNA送入细菌体内进行增殖 。 常用的为人工构建的
? 3．病毒, 常用的为 SV40，通过感染方
式将其 DNA送入哺乳动物细胞中进行增
殖。目前应用相对较少。
? （二）目的基因,
? 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进
行：
? 1．直接从染色体 DNA中分离, 仅适用于
原核生物基因的分离，较少采用。
? 2．人工合成：
? 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗传
密码表推定其核苷酸顺序再进行人工合成。
适应于编码小分子多肽的基因。
3．从 mRNA合成 cDNA：
采用一定的方法钓取特定基因的 mRNA,再通过逆转录酶催化合成其互补
? 4．从基因文库中筛选, 将某一种基
因 DNA用适当的限制酶切断后，与
载体 DNA重组，再全部转化宿主细
胞，得到含全部基因组 DNA的种群，
称为 G文库 (genomic DNA library)。
将某种细胞的全部 mRNA通过逆转
合成 cDNA，然后转化宿主细胞，得
到含全部表达基因的种群，称为 C-
文库 (cDNA library)。 C-文库具有
组织细胞特异性。
基因组文库的制作
5．利用 PCR合成,
如已知目的基因两端的序列, 则可采用聚合酶链反应 （ polymerase
? 二、载体和目的基因的切断
? 通常采用 限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease)，简称
限制酶，分别对载体 DNA和目的基因
进行切断，以便于重组。限制酶目前
已经发现 400多种，所识别的顺序往
往为 4-8个碱基对，且有 回文结构 。
由限制酶切断后的末端可形成 平端、
3'-突出粘性末端和 5'-突出粘性末端
三种情况。形成粘性末端 (cohesive
end)者较有利于载体 DNA和目的基因
的重组。
? 三、载体和目的基因的重组
? 即将带有切口的载体与所获得的目的
基因连接起来，得到重新组合后的
DNA分子。
? （一）粘性末端连接法, 当载体 DNA
和目的基因均用同一种限制酶进行切
断时，二者即可带有相同的粘性末端。
如将载体与目的基因混合在一起，二
者即可通过粘性末端进行互补粘合，
再加入 DNA连接酶，即可封闭其缺口，
得到重组体。 较少的情况下，对产生
的平端也可直接进行连接。
载体 DNA与目的基因的连接
? （二）人工接尾法, 即同聚物加尾连接
法。当载体和目的基因无法采用同一种
限制酶进行切断，无法得到相同得粘性
末端时，可采用此方法。 此法首先使用
单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端
核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核
苷酸添加于载体或目的基因的 3'-端，如
载体上添加一段 polyG，则可在目的基
因上添加一段 polyC，故二者即可通过
碱基互补进行粘合，再由 DNA连接酶连
接。
? （三）人工接头连接法, 将人工连接器
（即一段含有多种限制酶切点的 DNA片
段）连接到载体和目的基因上，即有可
能使用同一种限制酶对载体和目的基因
进行切断，得到可以互补的粘性末端。
? 四、重组 DNA的转化和扩增
? 重组 DNA需导入宿主细胞才能进行增殖
或表达。重组质粒可通过 转化
（ transformation）方式导入宿主细胞，
即将大肠杆菌用 CaCl2处理，增加细菌
细胞壁的通透性，再与重组质粒 DNA短
暂温育，质粒 DNA即可导入宿主细胞。
? 如果是用 λ噬菌体作为载体的重组体，则需要
用外壳蛋白进行包装，使之成为具有感染能
力的噬菌体，再通过 转染 (transfection)方
式将重组噬菌体 DNA导入大肠杆菌等宿主细
胞。 重组 DNA导入宿主细胞后，即可在适当
的培养条件下进行培养以扩增宿主细胞。对
于质粒 DNA，还可通过在培养基中加入氯霉
素，抑制细菌蛋白质合成及染色体 DNA的复
制，以单独扩增细胞中的质粒 DNA。
? 五、重组 DNA的筛选和鉴定
? 由于重组体导入宿主细胞的比例通常较低，
因此需要对含有重组体的宿主细胞进行筛
选并作鉴定。可采用以下方法进行：
? （ 一）根据重组体的表型进行筛选, 对于
带有抗药基因的质粒重组体，可采用 插入
灭活法 进行筛选。如 pBR322中带有抗氨
苄青霉素和抗四环素基因，当将目的基因
插入抗四环素基因后，就可引起该基因失
活，细菌对氨苄青霉素耐药，而对四环素
敏感。在含氨苄青霉素的培养基上能够生
长，而在含四环素的培养基上不能生长的
细菌即为带重组体的细菌。
插
入
灭
活
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筛
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重
组
体
? （二）根据标志互补进行筛选, 当宿主
细胞存在某种基因及其表达产物的缺陷
时，可采用此方法筛选重组体。即在载
体 DNA分子中插入相应的缺陷基因，如
宿主细胞重新获得缺陷基因的表达产物，
则说明该细胞中带有重组体。
? （三）根据 DNA限制酶谱进行分析,
经过粗筛后的含重组体的细菌，还需进
行限制酶谱分析进一步鉴定。将单一细
菌进行扩增后分别提取其 DNA，用重组
时所用的同一限制酶进行酶切，再将其
与不含目的基因的载体一起进行电泳比
较分析，如发现出现目的基因片段的电
泳带即证明重组体中带有目的基因。
（ 四）用核酸杂交法进行分析鉴定,
为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的
? 获得带目的基因的细菌后，可将其
不断进行增殖，从而得到大量的目的基
因片段用于分析研究。如在目的基因的
上游带有启动子顺序，则目的基因还可
转录表达合成蛋白质。
? 五, 转基因技术
? 1982年 Palmiter等人首次将大白鼠的
生长激素基因放在质粒中小白鼠金属
巯基蛋白启动子之后 。
? 这个启动子通常在染色体上, 控制金
属巯基蛋白的转录 。
? 将重组好的这种质粒（几百个拷贝）
用特制的微量注射器注入小鼠受精卵
的雄性原细胞核（ pronuc leus）中，
再将这个受精卵植入小鼠 子宫中。
结 果 发 育 生 成 的 小 鼠 中 经
Southen杂交证明许多小鼠中
都含有大白鼠的生长激素基因 。
而且成熟的小鼠体重比对照大
两倍, 成为, 硕鼠, 或, 超级
鼠, 。 这个实验首次证明, 外
源基因在新的启动子控制下可
以整合到哺乳类细胞核内, 并
在其中实现有效地表达 。 转基
因技术中有关外源基因与染色
体的定位重组, 表达调控等还
有待深入研究 。
六, 体细胞克隆技术
? 1997 年 Nature 杂 志 报 导, 英 国 学 者
I.Wilmut 等人, 从一只胚胎羊中取出乳
腺上皮细胞进行培养 （ 供体 ）, 再用另
一母羊的卵细胞 （ 受体 ） 摘出细胞核后,
与上述乳腺上皮细胞进行体外融合 。 融
合体经培养后, 植入受体母羊的子宫中,
结果融合体发育并分娩出一头小羊, 多
利, 。 称为克隆羊 。 这是 20世纪生物科
学震惊世界的成就 。 它表明成熟的体细
胞可以不经过有性繁殖发育成个体 。
